1.一種微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,包括如下步驟:
(1)種子的無(wú)菌萌發(fā):取成熟未開(kāi)裂的微斑報(bào)春苣苔的果莢,用洗潔精浸洗10-15min后在流水下沖洗干凈10-15min,在超凈工作臺(tái)上先用75%酒精中浸泡果莢30-40s,無(wú)菌水沖洗3-5次,再用0.1%升汞溶液浸泡果莢12-15min,無(wú)菌水沖洗3-5次,在接種盤(pán)上切開(kāi)果莢,并用經(jīng)過(guò)消毒滅菌的勺子輕輕將種子撥入種子萌發(fā)培養(yǎng)基中,播種好的種子先在光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至種子萌發(fā),然后再轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室中光培養(yǎng);所述的0.1%升汞溶液中加入有吐溫-20,每100mL0.1%升汞溶液中加入2滴吐溫-20;
(2)初代培養(yǎng):將已經(jīng)萌發(fā)子葉但尚未長(zhǎng)出真葉的小苗切成子葉、胚軸兩部分,然后接入不同的初代培養(yǎng)基中;子葉28-32d可直接誘導(dǎo)出不定芽,并且在子葉基部有愈傷組織產(chǎn)生;胚軸30d能誘導(dǎo)愈傷組織;
(3)不定芽的增殖培養(yǎng):將具有1對(duì)以上葉片的不定芽切取下來(lái),接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)26-28d;
(4)愈傷組織的分化培養(yǎng):將愈傷組織切成1cm×1cm的小塊接入分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)29-30d;
(5)生根培養(yǎng):當(dāng)組培芽具有2對(duì)以上葉片時(shí),轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)23-25d;
(6)煉苗移栽:將具有2-3對(duì)葉片的生根苗移出培養(yǎng)室,在溫室中煉苗10-14d;洗凈培養(yǎng)基移栽到裝有基質(zhì)的50孔穴盤(pán)中,澆透定根水后,將移栽小苗置于有遮陽(yáng)網(wǎng)的蔭棚下,透光率為40-50%,移栽7d后,用1/2MS營(yíng)養(yǎng)液澆淋,連續(xù)淋2次,時(shí)間間隔為7d,移栽后20d后統(tǒng)計(jì)成活率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟(1)中所述的暗培養(yǎng)的溫度為17-20℃;所述的光培養(yǎng)溫度23-25℃,光照為1000-1400 lx。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟(1)中所述的萌發(fā)培養(yǎng)基以MS+GA3 1.0-2.0mg/L+活性炭0.5g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟(2)中用于子葉的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+KT 1.0-2.0mg/L+NAA 0.01-0.1mg/L,愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+CPPU 0.1-1.0mg/L+2,4-D 1.5-2.0mg/L;用于胚軸的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+CPPU0.1-1.0mg/L+2,4-D1.5-2.0mg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟(3)中所述的增殖培養(yǎng)基以MS+6-BA1.0-3.0mg/L+IBA0.1-0.30mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋(píng)果20g/L+椰汁100ml/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟(4)中所述的分化培養(yǎng)基為MS+ZT0.1-1.0mg/L+IBA0.1-0.3mg/L+土豆30g/L+香蕉30g/L+蘋(píng)果20g/L+椰汁100ml/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟(5)中所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA1.0-3.0mg/L+椰汁50ml/L+活性炭1.0g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,所述1/2MS培養(yǎng)基為:將MS培養(yǎng)基中的大量元素減至一半,蔗糖為15g/L,其余成分及用量與MS保持一致。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟(6)中所述的基質(zhì)由泥炭和粗沙按照體積比為2:1組成。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微斑報(bào)春苣苔的無(wú)菌播種和組織培養(yǎng)方法,其特征在于,步驟(6)中所述的1/2MS營(yíng)養(yǎng)液為MS培養(yǎng)基中的大量元素減半,其余成分及用量與MS保持一致,不添加蔗糖和瓊脂。