專利名稱：花生四烯酸發酵制配方法
技術領域：
本發明涉及發酵工程領域，更具體涉及一種花生四烯酸發酵制配方法。
自八十年代以來圍繞多不飽和脂肪酸(PuFAs)發酵的研究工作取得了長足進展。目前，美國Starge公司、日本出光石油化學公司等已將發酵生產的γ-亞麻酸(GLA)產品投放市場，發酵生產的GLA油脂與月見草油相比，不僅具有GLA含量高、產量穩定、工業化生產不受自然條件限制等優點，而且其油脂成分更接近母乳。除GLA以外，其它PuFAs發酵尚處在實驗階段，是發酵工業及醫藥、食品工業的研究熱點。目前國內還主要停留在GLA微生物發酵工藝研究方面，而國外則將重點轉移到花生四烯酸(AA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)的產業化研究上，但到目前為止，國外尚無GLA以外的PuFAs微生物發酵產品投放市場的報道，但這方面的實驗研究已有較大的進展，尤其以日本和加拿大走在最前面，美國油脂化學協會亦十分關注PuFAs的生產和應用的研究進展。國際上開展PuFAs的微生物研究主要集中在以下幾個方面1、產PuFAs的菌種分離與選育；2、培養條件及發酵工藝的優化；3、培養方式的研究(包括批式、補料、連續培養工藝等)；4、PuFAs的分離純化及結構鑒定。目前人們僅發現接合菌綱是唯一有前途的一個綱，而且普遍看好被孢霉，認為它是生產花生四烯酸、EPA,DHA的最佳菌種。國內方面，研究GLA并取得一定進展的有中科院上海植物生理研究所、南開大學、福建師范大學生物工程學院以及山東大學生命科學學院，但現在GLA的主要來源仍是從月見草等植物中提取的，利用微生物工業化生產GLA尚未見報道。華南理工大學報道了花生四烯酸的發酵研究。其種子培養基是葡萄糖30g/1000mL、酵母膏2g/1000mL、蛋白胨3g/1000mL、K2HPO40.5g/1000mL、CaCl2.2H2O 0.2g/1000mL、MgSO4.7H2O 0.3g/1000mL、pH6.0。其發酵培養基為葡萄糖80g/1000ml,、酵母膏0.5g/1000mL、KNO340g/1000mL、K2HPO43.0g/1000mL、CaCl2.2H2O 0.1g/1000ml,MgSO4.7H2O 0.5g/1000mL、FeCl2·6H2O 0.015g/1000mL、ZnSO4·7H2O 0.0075g/1000mL、CuSO4·5H2O 0.0005g/1000mL、pH6.0。其種子液制備如下采用5ml無菌水將斜面菌種洗入裝有50ml種子培養基的250ml三角瓶中，25℃、180rpm下搖瓶培養4天。其搖瓶發酵培養方法如下取2ml種子液于裝有50ml發酵培養基的250ml三角瓶中，25℃，180rpm下搖瓶培養7天。目前國內研究仍處在搖瓶實驗階段，尚未進行花生四烯酸的發酵罐放大培養，且花生四烯酸搖瓶發酵制配的最高得率為0.827g/1000mL。
本發明的目的在于提供了一種花生四烯酸發酵制配方法，工藝簡便，制配方便，成本低，解決了花生四烯酸的發酵生產效率和產量低的問題。
為了達到上述目的，本發明采用以下技術方案，在對培養基配方及花生四烯酸發酵條件進行反復實驗的基礎上，找到了花生四烯酸大量合成的培養基及發酵條件，其培養基成本低廉，取材容易，操作過程簡單易行，其發酵制配方法如下1、種子擴大培養(1)豆芽汁的制備新鮮黃豆芽400-600g，加水800-1200mL煮沸0.5-1.0小時，取出豆芽汁，備用。
(2)種子培養基配方采用豆芽汁800-1200mL，葡萄糖40-60g/1000mL，K2HPO40.5-1.0g/1000mL,pH 6.0-6.5。
(3)種子培養條件培養溫度10-20℃，搖床轉速為110-150rpm，培養3-5天。
(4)種子擴大培養按500ml搖瓶裝100ml種子培養基，然后采用產花生四烯酸的普通被孢霉保藏菌種、經斜面活化后、加8-10ml無菌水、洗下孢子、制成孢子懸液。按100ml種子培養基加8-10ml孢子懸液，再按(3)中的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得花生四烯酸發酵生產用的種子培養物。
2、發酵培養(1)玉米粉糖化液制備玉米粉180-220g加水800-1200mL，煮沸膨脹，加α-淀粉酶4-6g及糖化酶1-3g,40-60℃，保溫10-14小時，過濾，濾液備用。
(2)發酵培養基玉米粉糖化液800-1200mL，酵母粉12-18g/1000mL，牛肉膏3-6g/1000mL,NaNO31-5g/1000mL,K2HPO40.5-1.0g/1000mL,pH 6.0-6.5。
(3)發酵罐發酵培養條件發酵溫度10-18℃，攪拌轉速150-250rpm，通氣量120-180VVM，培養10-20天。或搖瓶發酵培養條件發酵溫度為10-18℃，搖床轉速為110-150rpm，培養10-20天。
(4)發酵罐培養按每100mL罐體積中裝入65-75ml發酵培養基，采用上述制備好的種子液按100ml發酵培養基接入15-25ml種子液，再按發酵溫度為10-18℃，攪拌轉速為150-250rpm，通氣量120-180VVM，進行培養，培養時間10-20天。或搖瓶發酵培養按100ml搖瓶裝入20ml發酵培養基，然后按100ml發酵培養基加15-25ml上述制備好的種子液再按發酵溫度10-18℃，搖床轉速110-150rpm，培養10-20天。
發酵結束后，抽濾，收集菌體40-60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚抽提油脂。氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果原料易購，價格低廉，花生四烯酸合成穩定，產量在1.35-1.55g/1000ml，發酵過程簡單易行，操作簡便，適合工業化生產。
實施例11、種子擴大培養(1)豆芽汁的制備新鮮黃豆芽500g，加水1000mL，煮沸1小時，取出浸汁，備用。
(2)種子培養基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖50g/1000mL，K2HPO41g/1000mL,pH6.0。
(3)種子培養條件培養溫度為18℃搖瓶轉速為120rpm，培養3天。
(4)種子擴大培養按500ml搖瓶裝100ml種子培養基，然后采用普通的產花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌種活化后，用10ml無菌水洗下孢子，按每100ml種子培養基加入10ml孢子懸液接入搖瓶中，并按(3)中的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得花生四烯酸發酵生產用的種子培養物。
2、發酵培養(1)玉米粉糖化液的制備玉米粉200g加去離子水1000mL，煮沸膨脹，加α-淀粉酶5g及糖化酶2g，60℃，保溫12小時，過濾，濾液備用。
(2)發酵培養基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉15g/1000mL，牛肉膏5g/1000mL,NaNO33g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.0。
(3)發酵培養條件發酵溫度為15℃，搖瓶轉速為120rpm，培養15天。
(4)花生四烯酸發酵培養按2000ml搖瓶裝400ml發酵培養基，然后采用將種子擴大培養制配的大量被孢霉種子液按每100ml發酵培養基加入20ml種子液加入到發酵培養基中，再按上述(3)中的發酵培養條件進行花生四烯酸的發酵培養。發酵結束后，抽濾，收集菌體40-60℃烘干至恒重、粉碎，采用石油醚溶劑提取油脂；氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。
實施例21、種子擴大培養(1)豆芽汁的制備新鮮黃豆芽400g，加水1000mL，煮沸1小時，取出浸汁，備用。
(2)種子培養基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖60g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.0。
(3)種子培養條件培養溫度為20℃，搖瓶轉速為120rpm，培養3天。
(4)種子擴大培養按500ml搖瓶裝100ml種子培養基，然后采用產花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌種、經斜面活化后，加8ml無菌水、洗下孢子，制成孢子懸液。按每100ml種子培養基加8ml孢子懸液，再按(3)的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得花生四烯酸發酵生產用的種子培養物。
2、發酵培養(1)玉米粉糖化液的制備玉米粉180g加去離子水1000mL，煮沸膨脹，加α-淀粉酶4g及糖化酶2g,60℃，保溫12小時，過濾，濾液備用。
(2)發酵培養基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉12g/1000mL，牛肉膏4.5g/1000mL,NaNO33g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.0。
(3)發酵培養條件發酵溫度為12℃，搖瓶轉速為150rpm，培養15天。
(4)花生四烯酸發酵培養按2000ml搖瓶裝400ml發酵培養基，然后將種子擴大培養制配的大量被孢霉種子液按每100ml發酵培養基加入18ml種子液加入到發酵培養基中，再按上述(3)中的發酵培養條件進行花生四烯酸的發酵培養。發酵結束后，抽濾，收集菌體，至55℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。
實施例31、種子擴大培養(1)豆芽汁的制備新鮮黃豆芽600g，加水1000mL，煮沸1小時，取出浸汁，備用。
(2)種子培養基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖40g/1000mL,K2HPO40.5g/1000mL,pH6.2。
(3)種子培養條件培養溫度為20℃，搖瓶轉速為140rpm，培養4天。
(4)種子擴大培養按500ml搖瓶裝100ml種子培養基，然后采用產花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌種、經斜面活化后，加10ml無菌水、洗下孢子，制成孢子懸液。按每100ml種子培養基加10ml孢子懸液，再按(3)的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得花生四烯酸發酵生產用的種子培養物。
2、發酵培養(1)玉米粉糖化液的制備玉米粉190g加去離子水1000mL，煮沸膨脹，加α-淀粉酶5.5g及糖化酶1.5g,60℃，保溫14小時，過濾，濾液備用。
(2)發酵培養基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉10g/1000mL，牛肉膏5.5g/1000mL,NaNO32g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.4。
(3)發酵培養條件發酵溫度為17℃，搖瓶轉速為130rpm，培養14天。
(4)花生四烯酸發酵培養按2000ml搖瓶裝400ml發酵培養基，然后將種子擴大培養制配的大量被孢霉種子液按每100ml發酵培養基加入20ml種子液加入到發酵培養基中，再按上述(3)中的發酵培養條件進行花生四烯酸的發酵培養。發酵結束后，抽濾，收集菌體，至50℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。
實施例41、種子擴大培養(1)豆芽汁的制備新鮮黃豆芽450g，加水1000mL，煮沸1小時，取出浸汁，備用。
(2)種子培養基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖45g/1000mL,K2HPO40.8g/1000mL,pH6.5。
(3)種子培養條件培養溫度為16℃，搖瓶轉速為130rpm，培養3天。
(4)種子擴大培養按500ml搖瓶裝100ml種子培養基，然后采用產花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌種、經斜面活化后，加10ml無菌水。洗下孢子，制成孢子懸液。按每100ml種子培養基加8ml孢子懸液。再按(3)的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得花生四烯酸發酵生產用的種子培養物。
2、發酵培養(1)玉米粉糖化液的制備玉米粉210g加去離子水1100mL，煮沸膨脹，加α-淀粉酶4.5g及糖化酶2.5g,50℃，保溫14小時，過濾，濾液備用。
(2)發酵培養基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉16g/1000mL，牛肉膏5g/1000mL,NaNO34g/1000mL,K2HPO40.6g/1000mL,pH6.0。
(3)發酵培養條件發酵溫度為14℃，攪拌轉速為200rpm，通氣量為140VVM，培養16天。
(4)15升發酵罐中花生四烯酸發酵培養按15000ml機械攪拌式發酵罐裝10500ml發酵培養基，然后采用將種子擴大培養制配的大量被孢霉種子液按每100ml發酵培養基加入25ml種子液加入到發酵培養基中，再按上述(3)中的發酵培養條件進行花生四烯酸的發酵培養。發酵結束后，抽濾，收集菌體，至60℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。
實施例51、種子擴大培養(1)豆芽汁的制備新鮮黃豆芽550g，加水1000mL，煮沸1小時，取出浸汁，備用。
(2)種子培養基配方豆芽汁1000mL，葡萄糖55g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.5。
(3)種子培養條件培養溫度為17℃，搖瓶轉速為130rpm，培養4天。
(4)種子擴大培養按500ml搖瓶裝100ml種子培養基，然后采用產花生四烯酸的普通被孢霉斜面保藏菌種、經斜面活化后，加10ml無菌水、洗下孢子，制成孢子懸液。按每100ml種子培養基加10ml孢子懸液，再按(3)的種子培養條件進行種子擴大培養，獲得花生四烯酸發酵生產用的種子培養物。
2、發酵培養(1)玉米粉糖化液的制備玉米粉200g加去離子水1000mL，煮沸膨脹，加α-淀粉酶6g及糖化酶2g,55℃，保溫14小時，過濾，濾液備用。
(2)發酵培養基玉米粉糖化液1000mL，酵母粉18g/1000mL，牛肉膏3.5g/1000mL,NaNO32g/1000mL,K2HPO41g/1000mL,pH6.4。
(3)發酵培養條件發酵溫度為12℃，攪拌轉速為250rpm，通氣量為150VVM，培養14天。
(4)15升發酵罐中花生四烯酸發酵培養按15000ml機械攪拌式發酵罐裝入11250ml發酵培養基，然后將種子擴大培養制配的大量被孢霉種子液按每100ml發酵培養基加入18ml種子液加入到發酵培養基中，再按上述(3)中的發酵培養條件進行花生四烯酸的發酵培養。發酵結束后，抽濾，收集菌體，至55℃烘干至恒重、粉碎，石油醚萃取，氣相色譜法測定油脂中花生四烯酸含量，再經分離純化油脂得花生四烯酸純品。
權利要求
1.一種花生四烯酸發酵制配方法，其制配步驟如下A、種子擴大培養a、豆芽汁的制備，新鮮黃豆芽400-600g，加水800-1200ml煮沸0.5-1.0小時，取出豆芽汁，備用；b、種子培養基配方，豆芽汁800-1200mL，葡萄糖40-60g/1000mL,K2HPO40.5-1.0g/1000mL,pH6.0-6.5；c、種子培養條件，培養溫度為10-20℃，搖瓶轉速為110-150rpm，培養3-5天；d、種子擴大培養按500ml搖瓶裝100ml種子培養基，采用普通的產花生四烯酸的被孢霉斜面保藏菌種，經斜面活化后，用8-10ml無菌水，洗下孢子，制成孢子懸液，按每100ml種子培養基，加入8-10ml孢子懸液，并按(c)中的種子培養條件進行種子擴大培養；B、發酵培養a、玉米粉糖化液的制備玉米粉180-220g加水800-1200mL，煮沸膨脹，加α-淀粉酶4-6g及糖化酶1-3g,40-60℃，保溫10-14小時，過濾，濾液備用；b、發酵培養基玉米粉糖化液800-1200mL，酵母粉12-18g/1000mL，牛肉膏3-6g/1000mL,NaNO31-5g/1000mL,K2HPO40.5-1.0g/1000mL,pH6.0-6.5；c、發酵罐發酵培養條件發酵溫度為10-18℃，攪拌轉速為150-250rpm,通氣量120-180VVM，培養10-20天，或搖瓶發酵培養條件發酵溫度10-18℃，搖瓶轉速110-150rpm，培養10-20天；d、發酵罐培養按每100ml罐體積裝入65-75ml發酵培養基，按每100ml發酵培養基接入15-25m1種子液，發酵溫度為10-18℃，攪拌轉速為150-250rpm，通氣量120-180VVM，培養時間10-20天，或搖瓶發酵培養按100ml搖瓶裝入20ml發酵培養基，按100ml發酵培養基加入15-25ml種子液，發酵溫度為10-18℃，搖瓶轉速為110-150rpm，培養10-20天。
全文摘要
本發明公開了一種花生四烯酸發酵制配方法,其步驟是:A、種子擴大培養,首先是豆芽汁的制備;其次是種子培養基配方;第三是種子培養條件;第四是種子擴大培養。B、發酵培養,一是玉米粉糖化液的制備;二是發酵培養基;三是發酵培養條件;四是搖瓶或發酵罐發酵培養,發酵結束后,抽濾,收集菌體,烘干,粉碎,石油醚萃取。本發明工藝簡便,成本低,花生四烯酸合成穩定,產量高,適合工業化生產。
文檔編號C12P7/40GK1323904SQ0011456
公開日2001年11月28日 申請日期2000年5月12日 優先權日2000年5月12日
發明者余龍江, 周蓬蓬, 朱敏, 李為 申請人:華中科技大學