專利名稱：花生四烯酸及其生產(chǎn)和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及花生四烯酸的生產(chǎn)，含有花生四烯酸的組合物及其用途。
背景技術(shù)：
花生四烯酸(ARA)是ω6類長(zhǎng)鏈聚不飽和脂肪酸(PUFA) (5，8，11，14-二十碳四烯酸，20 4)。ARA是人體中含量最豐富的C2(1PUFA。它主要存在于器官、肌肉和血液組織中，在血液、肝臟、肌肉和其它器官系統(tǒng)中作為主要與磷脂結(jié)合的結(jié)構(gòu)脂類起著重要作用。除了主要的結(jié)構(gòu)脂類作用之外，ARA還是許多循環(huán)二十烯酸衍生的生物活性物質(zhì) (eicosenoid)，例如前列腺素& (PGE2)，前列腺環(huán)素(PGI2)，血栓烷A2 (TxA2)，和白細(xì)胞三烯 IeukotireneB4(LTB4)和C4(LTC4)的直接前體。這些eicosenoid具有對(duì)脂蛋白代謝，血液流變學(xué)，血管彈性，白細(xì)胞功能和血小板激活的調(diào)節(jié)作用。盡管ARA對(duì)人體很重要，但是它不能在體內(nèi)從頭合成。ARA是通過(guò)必需脂肪酸亞油酸(LOA)的延長(zhǎng)和去飽和來(lái)合成的。該過(guò)程需要酶△ 6-去飽和酶的存在，該酶在人體內(nèi)含量很低，Burre等，脂類(Lipids), 25 =354-356(1990)。所以，大多數(shù)ARA必須靠飲食提供， 這一點(diǎn)在身體的快速成長(zhǎng)期，例如嬰兒期，尤為重要。嬰兒在第一年中其體重可增至2至3倍。所以，需要大量的飲食ARA。為了滿足這一需要的增長(zhǎng)，母乳中含有大量的ARA。Sanders等，美國(guó)臨床營(yíng)養(yǎng)學(xué)雜志(Am. T. Clin. Nutr. ),31 :805-813 (1978)。ARA是母乳中主要的C2tlPUFA。那些母乳喂養(yǎng)嬰兒的母親，尤其是素食主義者其嬰兒可以通過(guò)附加的飲食ARA獲益。但是，許多母親不進(jìn)行母乳喂養(yǎng)，或者不在整個(gè)嬰兒快速成長(zhǎng)期進(jìn)行母乳喂養(yǎng)，而選擇使用嬰兒配方食物。在本申請(qǐng)人所知的市售嬰兒配方食物中都不含甘油三酯形式的ARA。再次引用參考的US4，670，觀5 (Clandinin等)揭示了嬰兒對(duì)包括ARA在內(nèi)的脂肪酸的需求。為了提供這些脂肪酸，Clandinin等提出了一種蛋黃、魚油或血紅細(xì)胞磷酸酯和植物油的混合物，以此作為一種建議嬰兒配方食物。但是，魚油中含有大量的二十碳五烯酸(EPA)。已知EPA在嬰兒體內(nèi)抑制ARA的合成。Carlson等，INFORM, 1 =306(1990)。所以，最好能夠提供ARA但不提供EPA。此外，蛋黃中的ARA含量較低，所以，Clandinin等的混合物在經(jīng)濟(jì)上并不可行。由于ARA存在于動(dòng)物油而不是植物油中，其工業(yè)量的生產(chǎn)仍然是一個(gè)希望但困難的目標(biāo)。Shinmen等在微牛物技術(shù)(Microbiol. Biotech.) 31 :11-16(1989)中報(bào)道，利用常規(guī)的攪拌罐發(fā)酵，由一種分離出的真菌高山被孢霉(Mortierella alpina)生產(chǎn)ARA。(參見Siinmen等的日本專利1，215，245)。在培養(yǎng)之后，收獲微生物，干燥后用有機(jī)溶劑從真菌生物質(zhì)中萃取脂類，然后對(duì)脂類進(jìn)行化學(xué)(共價(jià))改性。例如，水解脂類混合物或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為醚酯，然后與環(huán)糊精混合，再用作食物補(bǔ)充。Shinmen等并沒(méi)有說(shuō)明或建議使用未經(jīng)改性
5的微生物脂類。Porphyridium cruentum，一種紅色的微藻，可以在池塘中大量種植，而且其脂含量中含有多至40%的ARA。Ahern等，牛物技術(shù)與牛物工稈(Biotech. Bioeng) 25 1057-1070 (1983)。不巧的是，這些ARA主要與半乳糖脂結(jié)合，這是一種母乳中沒(méi)有的復(fù)合極性脂。這樣，不僅生成的可利用ARA僅占生物量的1%，而且ARA的形式如果不經(jīng)改性不適合用作嬰兒配方食物的添加劑。US4, 870，Oil (Suzuki等)公開了從被孢霉屬(Mortierella屬)真菌中獲得例如 Y-亞油酸之類的脂類的方法。從真菌中含有的脂類混合物中純化得到Y(jié)-亞油酸。DE3603000A1 (Milupa)公開了一種高聚不飽和脂肪酸混合物，及其作為嬰兒配方食物中脂肪組份的用途。這種脂肪混合物中含有高含量的ARA和二十二碳六烯酸(DHA)，兩者之比為2. 5 1，還有大量膽固醇。列舉的脂肪酸來(lái)源是某些類型的巨藻，魚油，來(lái)自牛肉和豬肉的器官脂肪或高度提純的蛋黃油。DHA和ARA的一種來(lái)源據(jù)說(shuō)是褐藻門和紅皂門的巨藻。從未有人提出將微生物用作油脂來(lái)源。藻類和魚油通常也含有抑制ARA體內(nèi)合成的 EPA。此外，高度提純的蛋黃油并不是一種經(jīng)濟(jì)的ARA來(lái)源。而且，其中沒(méi)有有關(guān)用于補(bǔ)充已有嬰兒配方食物的含高濃度ARA添加劑的內(nèi)容。所以，一直以來(lái)需要一種經(jīng)濟(jì)的，工業(yè)上可行的，最好不含EPA副產(chǎn)物的ARA生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的之一是滿足這一需求。本發(fā)明的目的之二是提供用于嬰兒配方食物的添加劑和這種添加劑的來(lái)源，用以使這些配方食物中的ARA含量接近母乳中的含量。本發(fā)明另一目是提供含ARA的真菌油，可用在腸用，非腸用或皮膚用產(chǎn)品中。發(fā)明概述本發(fā)明涉及含花生四烯酸的真菌油(ARASCO)的生產(chǎn)與使用，以及含有這類油的組合物。可將這類油稱為單細(xì)胞油。在產(chǎn)油條件下培養(yǎng)真菌，收獲真菌并萃取和回收油脂。 這些油不需要進(jìn)一步的化學(xué)改性即直接用于為需要ARA的人，包括新生兒，孕婦或哺乳期婦女，或是表現(xiàn)出ARA不足性疾病的人提供補(bǔ)充的ARA。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于生產(chǎn)方便，純度高，而且沒(méi)有檢知量的EPA。優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)說(shuō)明“ARA”和“EPA”在本文中還分別指花生四烯酸和二十碳五烯酸的殘基，當(dāng)這些殘基與甘油經(jīng)酯化反應(yīng)成為脂肪酰甘油三酯或磷酸酯的組成部分時(shí)。在本文中，當(dāng)將組合物用作營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充時(shí)，其中EPA的殘留含量低于會(huì)抑制ARA合成的含量，則該組合物“基本上不含 EPA”。本發(fā)明能夠提供經(jīng)濟(jì)的花生四烯酸(ARA)來(lái)源。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)含花生四烯酸而基本上不含二十碳五烯酸 (EPA)的真菌油(ARASCO)的方法。本文中，“基本上不含”指在油脂中，EPA的含量低于ARA 含量的約1/5。這種油，單細(xì)胞油，可以以非改性形式直接使用。本文中，“非改性”指沒(méi)有共價(jià)改變脂肪酸或油本身的化學(xué)特性。這樣，例如對(duì)ARASCO或ARA的臨時(shí)改性，這種臨時(shí)改性能夠在油脂被吸收時(shí)恢復(fù)，也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的非改性真菌油提供的甘油三酯其脂肪酸殘基中相對(duì)較多的是ARA(至少 40%的脂肪酸殘基是ARA為宜，50%更好)，ARA與EPA殘基之比也很高(至少5 1，至少 20 1更好，w/w)。在本發(fā)明之前，還從未有過(guò)這種來(lái)自天然來(lái)源的油脂的報(bào)道。雖然如此組成的甘油三酯可以化學(xué)合成(例如，通過(guò)ARA高含量的游離脂肪酸混合物的酯化反應(yīng)， 或以這些脂肪酸混合物的乙酯進(jìn)行轉(zhuǎn)酯反應(yīng))，對(duì)這些脂肪酸混合物的操作(例如純化，酯化等)會(huì)引入不需要的副產(chǎn)物。相反，本發(fā)明的方法能夠通過(guò)從天然來(lái)源中萃取來(lái)提供具有要求組成的甘油三酯。表1.幾種真菌菌屬的脂肪酸組成
權(quán)利要求
1.一種非改性真菌油，含有甘油三酯，其中至少25%的脂肪酸殘基是簡(jiǎn)稱ARA的花生四烯酸，油中簡(jiǎn)稱EPA的二十碳五烯酸殘基的量不超過(guò)ARA殘基量的五分之一，所述油是用包含以下步驟的方法生產(chǎn)的(a)在通氣的含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)被孢霉(Mortierella)；(b)在培養(yǎng)的早期將PH維持在5-6，所述早期包括指數(shù)生長(zhǎng)期；(c)在培養(yǎng)的后期將PH維持在7-7.5，所述后期包括穩(wěn)定生長(zhǎng)期；(d)從發(fā)酵罐中收獲生物質(zhì)，從生物質(zhì)中回收所述油。
2.如權(quán)利要求1所述的油，所述被孢霉是高山被孢霉(Mortierellaalpina)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的油，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有相當(dāng)于至少80g/L葡萄糖的碳源和相當(dāng)于至少15g/L酵母提取物的氮源。
4.如權(quán)利要求3所述的油，所述氮源分成兩份或更多份在不同的時(shí)刻加入發(fā)酵罐，至少一份不與碳源同時(shí)加入發(fā)酵罐。
5.如權(quán)利要求3或4所述的油，所述氮源是胨、胰化蛋白胨、玉米浸出液、大豆粉、或植物蛋白水解物。
6.如權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的油，所述碳源是葡萄糖、糖蜜、高果糖玉米糖漿、或水解淀粉。
7.如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的油，所述培養(yǎng)基的溶氧水平是至少35%空氣飽和濃度。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的油，通過(guò)非極性溶劑萃取從生物質(zhì)中回收所述的油。
9.如權(quán)利要求8所述的油，所述非極性溶劑是己烷。
10.如權(quán)利要求8或9所述的油，回收的油用極性溶劑澄清。
11.如權(quán)利要求10所述的油，所述極性溶劑是丙酮、乙醇或異丙醇。
12.—種嬰兒配方食物，包含非改性真菌油，所述非改性真菌油含有甘油三酯，其中至少25 %的脂肪酸殘基是ARA，油中EPA殘基的量不超過(guò)ARA殘基量的五分之一，所述油是用包含以下步驟的方法生產(chǎn)的(a)在通氣的含有生長(zhǎng)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)被孢霉(Mortierella)；(b)在培養(yǎng)的早期將PH維持在5-6，所述早期包括指數(shù)生長(zhǎng)期；(c)在培養(yǎng)的后期將PH維持在7-7.5，所述后期包括穩(wěn)定生長(zhǎng)期；(d)從發(fā)酵罐中收獲生物質(zhì)，從生物質(zhì)中回收所述油。
13.如權(quán)利要求12所述的嬰兒配方食物，所述被孢霉是高山被孢霉(Mortierella alpina)0
14.如權(quán)利要求12或13所述的嬰兒配方食物，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基含有相當(dāng)于至少80g/L 葡萄糖的碳源和相當(dāng)于至少15g/L酵母提取物的氮源。
15.如權(quán)利要求14所述的嬰兒配方食物，所述氮源分成兩份或更多份在不同的時(shí)刻加入發(fā)酵罐，至少一份不與碳源同時(shí)加入發(fā)酵罐。
16.如權(quán)利要求14或15所述的嬰兒配方食物，所述氮源是胨、胰化蛋白胨、玉米浸出液、大豆粉、或植物蛋白水解物。
17.如權(quán)利要求14至16中任一項(xiàng)所述的嬰兒配方食物，所述碳源是葡萄糖、糖蜜、高果糖玉米糖漿、或水解淀粉。
18.如權(quán)利要求12至17中任一項(xiàng)所述的嬰兒配方食物，所述培養(yǎng)基的溶氧水平是至少 35%空氣飽和濃度。
19.如權(quán)利要求12至18中任一項(xiàng)所述的嬰兒配方食物，通過(guò)非極性溶劑萃取從生物質(zhì)中回收所述的油。
20.如權(quán)利要求19所述的嬰兒配方食物，所述非極性溶劑是己烷。
21.如權(quán)利要求19或20所述的嬰兒配方食物，回收的油用極性溶劑澄清。
22.如權(quán)利要求21所述的嬰兒配方食物，所述極性溶劑是丙酮、乙醇或異丙醇。
23.—種經(jīng)腸或非經(jīng)腸對(duì)人給藥的組合物，包含產(chǎn)自高山被孢霉(Mortierella alpina)的非改性真菌甘油三酯油，其中，至少50 %的脂肪酸殘基是甘油三酯形式存在的 ARA殘基，所述油中EPA不超過(guò)ARA的十分之一，所述油含至少50% ARA0
24.一種嬰兒配方食物組合物，含有甘油三酯，其中ARA的含量與人乳中的相當(dāng)，其中的ARA來(lái)自向嬰兒配方食物添加足量的產(chǎn)自高山被孢霉(Mortierella alpina)的非改性真菌甘油三酯油，其中，至少50%的脂肪酸殘基是甘油三酯形式存在的ARA殘基，所述油中 EPA不超過(guò)ARA的十分之一，所述油含至少50% ARA0
25.如權(quán)利要求23或M所述的組合物，所述油基本不含EPA。
26.如權(quán)利要求23至25中任一項(xiàng)所述的組合物，所述油是通過(guò)高山被孢霉深層發(fā)酵獲得的。
27.如權(quán)利要求沈述的組合物，所述油是通過(guò)在通氣的含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中將高山被孢霉培養(yǎng)至約12g/L的生物質(zhì)密度而獲得的。
28.如權(quán)利要求沈述的組合物，所述油是通過(guò)在通氣的含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中將高山被孢霉培養(yǎng)至約Mg/L的生物質(zhì)密度而獲得的。
29.如權(quán)利要求沈至觀中任一項(xiàng)所述的組合物，所述油是通過(guò)在通氣的含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)高山被孢霉，且生物質(zhì)生長(zhǎng)期間培養(yǎng)基的溶氧濃度維持在至少40%空氣飽和濃度而獲得的。
30.如權(quán)利要求沈至四中任一項(xiàng)所述的組合物，所述油是通過(guò)在通氣的含有培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)高山被孢霉而獲得的，所述培養(yǎng)基含有相當(dāng)于至少80g/L葡萄糖的碳源和相當(dāng)于至少15g/L酵母提取物的氮源。
31.如權(quán)利要求30所述的組合物，所述培養(yǎng)基含有相當(dāng)于至少16g/L酵母提取物的氮源。
32.如權(quán)利要求30或31所述的組合物，所述培養(yǎng)基的碳氮比至少5 1，按w/w葡萄糖酵母提取物表示。
33.如權(quán)利要求30至32中任一項(xiàng)所述的組合物，用于深層發(fā)酵的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基含大豆粉作為氮源。
34.如權(quán)利要求23或25至33任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物調(diào)配成用于向人提供 0. 2-0. 8g ARA/ 天。
35.如權(quán)利要求23或25至34任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物調(diào)配成用于經(jīng)腸給予。
36.如權(quán)利要求23或25至35任一項(xiàng)所述的組合物，所述組合物調(diào)配成用于非經(jīng)腸給予。
37.如權(quán)利要求23或25至36任一項(xiàng)所述的組合物，所述人是孕期或哺乳期的婦女。
38.如權(quán)利要求23或25至37任一項(xiàng)所述的組合物，需要補(bǔ)充ARA的人患有神經(jīng)疾病。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，所述神經(jīng)疾病是慢性記憶障礙，精神分裂癥或各種過(guò)氧化酶疾病。
40.如權(quán)利要求23或25至39任一項(xiàng)所述的組合物，需要補(bǔ)充ARA的人患有與ARA血清水平降低相關(guān)的疾病。
41.如權(quán)利要求40所述的組合物，所述疾病是肝病，苯丙酮酸尿癥或囊性纖維化。
42.一種精煉真菌甘油三酯油，含有約32%ARA在甘油三酯中，約4.6%脂肪酸14 0， 約16%脂肪酸16 0，約3. 2%脂肪酸16 1，約沈.4%脂肪酸18 1，約9. 9%脂肪酸 18 2，約4. 脂肪酸18 3，約2. 2%脂肪酸20 1，約1. 4%脂肪酸20 3，所述真菌油基本不含EPA。
43.如權(quán)利要求42所述的真菌油，所述真菌油是由被孢霉生產(chǎn)的。
44.如權(quán)利要求43所述的真菌油，所述被孢霉是高山被孢霉。
45.一種嬰兒配方食物，含有非改性真菌油，所述非改性真菌油含有甘油三酯，其中含有至少40% ARAjEPA不超過(guò)ARA的五分之一，所述非改性真菌油是在發(fā)酵罐中有氧培養(yǎng)被孢霉生產(chǎn)的，其中，將被孢霉培養(yǎng)到生物質(zhì)密度達(dá)到至少25g/L干重。
46.如權(quán)利要求45所述的嬰兒配方食物，所述油包含的甘油三酯含至少50%ARA。
47.如權(quán)利要求45或46所述的嬰兒配方食物，所述油中的EPA不超過(guò)ARA的十分之ο
48.如權(quán)利要求45至47中任一項(xiàng)所述的嬰兒配方食物，所述油的平均生產(chǎn)速度為至少 l.Og/L/天。
49.如權(quán)利要求48所述的嬰兒配方食物，所述油的平均生產(chǎn)速度為至少2.Og/L/天。
50.如權(quán)利要求45至49中任一項(xiàng)所述的嬰兒配方食物，所述被孢霉是高山被孢霉。
51.一種生物質(zhì)，含有油，其中，在甘油三酯組份中含有至少40% ARA殘基，EPA不超過(guò) ARA的五分之一，所述生物質(zhì)是在發(fā)酵罐中有氧培養(yǎng)被孢霉至生物質(zhì)密度達(dá)到至少25g/L 干重而獲得的。
52.如權(quán)利要求51所述的生物質(zhì)，所述油含有的甘油三酯含至少50%ARA。
53.如權(quán)利要求51或52所述的生物質(zhì)，所述油中的EPA不超過(guò)ARA的十分之一。
54.如權(quán)利要求51至53中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，所述油的平均生產(chǎn)速度為至少1.Og/L/天。
55.如權(quán)利要求M所述的生物質(zhì)，所述油的平均生產(chǎn)速度為至少2.Og/L/天。
56.如權(quán)利要求51至55中任一項(xiàng)所述的生物質(zhì)，所述被孢霉是高山被孢霉。
全文摘要
本發(fā)明涉及含花生四烯酸油脂的生產(chǎn)方法，其中基本上不含二十碳五烯酸。本發(fā)明還涉及含油組合物，油中含有高含量的甘油三酯形式的花生四烯酸，以及這類油脂的使用方法。在一種較好的實(shí)施方式中，在適宜條件下培養(yǎng)高山被孢霉(Mortierella alpina)，該條件下能夠生產(chǎn)出花生四烯酸殘基含量特別高的甘油三酯，然后收獲生物質(zhì)，油脂經(jīng)萃取、回收后用作嬰兒配方食物中的添加劑。
文檔編號(hào)A61K31/202GK102399831SQ20111028279
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期1996年1月3日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月3日
發(fā)明者D·J·凱爾 申請(qǐng)人:馬泰克生物科學(xué)有限公司