一種花生四烯酸的制備方法
【專利摘要】一種花生四烯酸的制備方法，涉及花生四烯酸。對高山被孢霉產ARA的培養條件進行優化，在基礎培養基分批發酵，在優化培養基中以酵母粉和玉米漿為氮源分批發酵，再以酵母粉為氮源進行的發酵罐放大實驗，對高山被孢霉在優化培養基中以玉米漿和酵母粉為混合氮源進行培養，將優化培養基中的氮源替換為玉米漿和酵母粉，得混合氮源優化培養基；對高山被孢霉在混合氮源優化培養基中分批發酵；對高山被孢霉高糖馴化及對馴化后的菌種在混合氮源優化培養基中分批發酵，在當葡萄糖濃度降至10g/L時，流加600g/L葡萄糖，使殘糖控制在10g/L左右，培養168h后開始收獲干菌體、油脂和ARA。
【專利說明】一種花生四烯酸的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及花生四烯酸，尤其是涉及一種花生四烯酸的制備方法。
【背景技術】
[0002]花生四烯酸(Arachidonic Acid,簡稱ARA,即5,8,11,14-二十碳四烯酸)屬于ω-6系列長鏈多不飽和脂肪酸，由于人體內不具備相應的酶系統來合成特定的不飽和雙鍵，因此被認為是人體必需脂肪酸，是許多二十碳衍生物如前列腺素E2 (PGE2)、前列環素(PGI2)、血栓烷 A2 (TXA2)、白三烯 Leukotirene B4(LTB4)和 C4 (LTC4)的直接前體。ARA 還具有調節體內多種離子通道作用，控制細胞膜的通透性，維持機體保水性等許多重要的生理功能。同時研究表明，花生四烯酸對嬰兒的大腦發育和視覺功能的完善有著極為重要的意義，花生四烯酸對高血壓、高血脂、糖尿病、病毒感染等疾病的預防與治療也有顯著的效果(Roger et al.Biotechnology Bioengineering, 2010，9 (20): 245-257)。因此，花生四烯酸既是一種營養強化劑，又是人類重要的保健品。ARA作為人體必需脂肪酸發揮著無可替代的作用，應用前景廣闊。
[0003]ARA主要來源有植物、動物組織、魚油以及微生物和微藻類等，但ARA在動物組織中含量低，來源也有限，而微生物發酵法則為生產ARA開辟了新途徑，它具有不受原材料及氣候限制、生長周期短、培養工藝簡單、ARA含量高等特點，近年來已成為國內外研究的熱點。國際上開展產多不飽和脂肪酸(PFUAs)的微生物研究主要集中在以下幾個方面:(1)產PFUAs菌種的分離與選育；(2)培養條件及發酵工藝的優化；(3)培養方式的研究(包括批式、補料、連續培養工藝等);(4)PFUAs的分離純化及結構鑒定。目前，人們僅發現接合菌綱是比較具有研究價值的的一個綱，而且普遍看好被孢霉，認為它是生產ARA、EPA、DHA最有潛力的菌種。目前，日本、美國等國家已經先后問世了 ARA的發酵產品，國內在這一領域的研究起步晚，雖對微生物發酵生產ARA方面作了一些研究，但還存在著生物量偏低，油脂含量較低等問題，離大規模的工業`化生產仍有一定的距離。
[0004]中國專利CN101613724公開一種利用高山被孢霉菌絲體制備花生四烯酸的方法，包括有下述步驟:首先在恒溫搖床中將高山被孢霉接種量的深層培養；再轉接于裝有發酵培養基的器皿中，培養后獲得發酵醪液，其中生長培養基或/和發酵培養基的氮源以高山被孢霉菌柏代替部分常用氮源，高山被孢霉菌柏中的氮源替代比以質量百分比計為10%-90% ;發酵醪液經過濾，收集的霉菌生物體，經洗滌、干燥、粉碎，采用非極性溶劑進行浸提或壓榨，收獲油脂，收獲的油脂經進一步處理獲得目標產品，霉菌生物體經非極性溶劑浸提后剩余固體物質，即為可循環使用的高山被孢霉菌柏，該發明利用高山被孢霉發酵生產花生四烯酸過程中產生的廢棄物得到循環利用，避免了環境污染物的排放。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種花生四烯酸的制備方法。
[0006]本發明包括以下步驟:[0007]I)通過搖瓶實驗對高山被孢霉產ARA的培養條件進行優化，所述優化的方法為取4mL種子液接入裝有50mL基礎培養基(葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ；MgS04-7H200.lg/L ；KH2PO40.5g/L ；CaC030.05g/L ；ZnS04-7H200.lg/L ；pH6.0)的 250mL 三角瓶，28 °C、150rpm培養5-6d，得到優化培養基:葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米漿10g/L ;谷氨酸1.0g/L ；MgS04-7H200.lg/L ；KH2P042.0g/L ；CaCO30.05g/L ；ZnS04-7H200.lg/L ;混合微量元素 lmL/L ；混合維生素lmL/L ；pH調至6.0 ；
[0008]2)對高山被孢霉在基礎培養基中進行了 2L分批發酵，培養至第168h，開始收獲菌體，獲得干菌體、油脂和ARA ；
[0009]3)對高山被孢霉在優化培養基中分別以酵母粉和玉米漿為氮源進行了 2L分批發酵，再以酵母粉為氮源進行的發酵罐放大實驗，菌體生長正常，未發生自溶現象，并獲得干菌體、油脂和ARA ；
[0010]4)對高山被孢霉在優化培養基中以玉米漿和酵母粉為混合氮源進行培養，將步驟O中的優化培養基中的氮源替換為玉米漿和酵母粉，得混合氮源優化培養基；
[0011]5)對高山被孢霉在混合氮源優化培養基中進行2L分批發酵，在2L發酵罐中裝入混合氮源優化培養基，培養168h后收獲干菌體、油脂和ARA ；
[0012]6)對高山被孢霉進行高糖馴化及對馴化后的菌種在混合氮源優化培養基中進行2L分批發酵，在當葡萄糖濃度降至10g/L時，流加600g/L葡萄糖，使殘糖控制在10g/L左右，其余操作過程與步驟5)相同，培養168h后開始收獲干菌體、油脂和ARA。
[0013]在步驟I)中，所述混合微量元素可包括FeCl3.6H20,、H3B03、MnCl2.4H20、CoCl2.6H20、CuSO4.5H20、NiSO4.6H20等；所述混合維生素可包括維生素B12、生物素、維生素B1、泛酸鈣等。
[0014]在步驟2)中，所述發`酵的條件可為:將培養3d的液體種子，按10%接種量接種于基礎培養基中，裝液量1.5L，初始葡萄糖濃度為60g/L，在28°C，攪拌轉速200rpm，通氣量Ivvm ;所述干菌體可得18g/L,油脂可得7g/L, ARA可得2.7g/L。
[0015]在步驟3)中，所述發酵的條件可與步驟2)的發酵條件相同；所述干菌體可得21g/L,油脂可得9g/L，ARA可得3.8g/L。
[0016]在步驟4)中，所述培養的方法可與步驟I)中的培養方法相同；所述玉米漿和酵母粉的質量比可為3: 8。
[0017]在步驟5)中，所述混合氮源優化培養基的加入量可為1.5L ;所述混合氮源優化培養基中葡萄糖的初始濃度為60g/L，接種量10%，初始pH用25%氨水控制在6.0-6.5，溫度28°C、轉速250rpm ;所述干菌體可得36g/L，油脂可得16g/L，ARA可得6.5g/L。
[0018]在步驟6)中，所述2L分批發酵的具體方法可為:首先采用固體培養基馴化，將菌種逐級涂布于梯度高糖平板(含糖量分別為2%、5%、7%、10%和15%)培養，挑選經固體馴化后能耐受10%高糖濃度平板的菌種轉接到兩種含不同氮源的梯度高糖(含糖量分別為3%、4%、5%和6%)液體培養基中進行馴化，接著對該馴化后的菌種，使用步驟4)中所述的混合氮源優化培養基進行分批發酵；所述干菌體可得58g/L，油脂可得28g/L，ARA可得16g/L。
[0019]所述高山被孢霉可以接種適量的被孢霉至載有培養基的搖瓶中，置于搖床上培養，轉速為100-300rpm，較好的為150-200rpm。
[0020]本發明涉及的培養基的組成成分，例如碳源、氮源可以有所不同。碳源可以使用蔗糖、麥芽糖、糊精、淀粉等，葡萄糖是較適宜的碳源，來源簡單，價格低廉，使用量為30-80g/L。對于搖瓶種子培養，一般將使用量降低至10-30g/L，可根據培養的時間及所要求的生物量密度來選擇用量。具體合適的用量選擇，本領域的技術人員可以通過相關操作確定碳源的種類及合適用量。同時，可視微生物的生長情況，選擇一次性加入全部碳源或者分批補入。氮源可以選擇酵母粉、玉米漿、蛋白胨、大豆粉等中的至少一種，酵母粉或者玉米漿被認為是比較好的氮源，添加濃度在5-15g/L，本領域的技術人員可以通過相關實驗操作確定氮源的種類及用量。
[0021]可選擇使用單一氮源或混合氮源，更好的結果是使用混合氮源(玉米漿、酵母粉)為發酵罐培養的適宜氮源，且二者的質量比例對于油脂的積累影響較大，可利用響應面分析等統計方法進一步優化碳氮源的組合，較好的兩種氮源比例為3:8 (w/w)0[0022]溫度低于20°C高山被孢霉將會開始大量產生EPA，而培養要求得到較高含量的ARA，同時盡量減低或避免產生EPA，培養溫度通常保持在25-30°C。微生物發酵生產PUFAs，其最高產量一般是在對數期后期或穩定期前期，因此要在最短的時間內獲得最大可能的生物量及總脂肪酸的含量，一般來說，最適收獲ARA的時間是在第5-6天。
[0023]真菌生長的pH范圍較廣，更偏好于在偏酸環境中生長，pH在4.0至8.0之間均可以正常生長，本發明的實施過程中發現，初始pH6.0-6.5，培養過程中pH在7-8之間有利于ARA的積累；pH4-5之間有利于生物量的積累，在培養過程中可分階段的調節pH水平以適應所要求的生長環境。
[0024]接種量可以在2%至14%(V/V)，接種量低，生物量達不到所要求的水平，接種量高，在生物量積累到一定程度將會抑制菌體的繼續生長，在搖瓶培養中，接種控制在3%-5%(V/V)，而在發酵罐培養中，接種量控制在8%-10%(V/V)能得到較好的結果。
[0025]培養基中碳氮比影響真菌油脂的積累，碳氮比在10:1至60:1之間，較好的是40:1至50: 1，在培養過程中可以選擇滅菌前一次性加入或培養開始后分批加入。
[0026]微生物的生長需要維生素等生長因子，當培養環境中缺乏維生素時，細胞內RNA、DNA以及蛋白質的含量會下降。添加維生素B1、維生素B12、生物素及泛酸鈣最有利于ARA的積累，其用量分別在50-150mg/L、300-600μ g/L、400-600 μ g/L及80-150mg/L之間。谷氨酸可以提高細胞中G6TOH的活性，為被孢霉細胞的生長提供核酸原料，從而與花生四烯酸的合成緊密相關，在培養基中添加0.5-2g/L的谷氨酸有利于ARA的積累。
[0027]為了提高高山被孢霉的耗糖能力及保存過程中的穩定性，可對菌種進行了高糖馴化培養，馴化后的結果發現，菌種的耗糖能力及產油能力明顯提升，ARA的含量呈倍數增長。
[0028]發酵培養過程可采用分批發酵或補料-分批發酵，分批發酵要求營養物質一次性加入，營養物含量過高可能在培養前期抑制真菌的生長而延長延滯期，發酵周期隨之延長，而營養物含量過低，在培養后期無法滿足真菌生長需要的營養補充。本領域的技術人員，可以通過一系列實驗操作確定適宜的碳氮營養物含量；補料-分批發酵培養過程中，必須對培養液中的營養物質進行檢測，特別是當葡萄糖濃度小于5g/L時，需要及時補充葡萄糖，這是需要分別滅菌的。上述兩種培養方式，在實施過程中，可能會出現起泡現象，這是不希望出現的，可以選擇在滅菌之間加入適量消泡劑或者在起泡現象出現時，適時地加入消泡劑防止產生過量泡沫。
[0029]根據上述優化高山被孢霉的發酵條件，能夠獲得較高的生物量及總油脂含量，可以每12h或24h取樣測定生物量、油脂及ARA含量，或者培養結束收獲生物質測定。
[0030]可以用多種方法對生物質體進行收獲，例如過濾、真空抽濾、離心、膜分離、絮凝沉淀等，一般的，選擇成本低且方便操作的過濾或真空抽濾收獲生物質體。收獲后，可以選擇采用干菌體或濕菌體進行油脂的萃取，本實施過程中，對菌體進行干燥至含水量小于4%，此時，使用丙酮、乙醇、異丙醇等醇類、烷烴如正己烷、正庚烷等萃取油脂是較適宜的，但正己烷最佳。干燥后的菌體加入正己烷，進行研磨、勻漿或減法破壁萃取，得到的萃取液進行離心分離取上層，蒸發除去其中的有機溶劑，得到總油脂即粗油。
[0031]本發明與現有技術相比具有以下優點和效果:原料易購、價格適中、培養基配制方便、發酵工藝簡便、花生四烯酸合成穩定、油脂產量為16~28g/L，其中花生四烯酸產量在
6.5~16g/L，解決了花生四烯酸的發酵生產效率和產量低的問題、適合工業化生產。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為高山被孢霉在基礎培養基中的發酵結果。
[0033]圖2高山被孢霉在添加了維生素、氨基酸和微量元素的培養基中的發酵結果。
[0034]圖3高山被孢霉在實施例3培養基中添加了混合氮源的發酵結果。
[0035]圖4馴化后的高山被孢霉在實施例4中的培養基中的發酵結果。
[0036]圖1~4分別為實施例2~5中不同培養基對高山被孢霉的生物量、總油脂和ARA產量的影響結果。在圖1~4中，橫坐標為培養時間(h)，左縱坐標為葡萄糖消耗情況Glucose ( , g/L),右縱坐標分別為生物量Biomass (., g/L),總油脂Total fattyacid ( ★，g/L)和 ARA 產量(▲，g/L)。
【具體實施方式】
[0037]以下實施例用于進一步說明本發明。
[0038]實施例1.利用高山被孢霉生產ARA
[0039]在一個250mL搖瓶中培養高山被孢霉，載液量為50mL的活化培養基，150rpm，28°C，活化3天。再將活化后的菌株接入基礎培養基，裝液量250mL的搖瓶裝入50mL的基礎培養基，接種量10%(v/v)，于28°C往復式搖床培養5~6d，轉速150rpm，28°C，培養5d后收獲，抽濾收獲生物質，將其恒溫干燥至恒重，用正己烷研磨萃取油脂，蒸發除去有機容劑后，得到總油脂5g/L。
[0040]活化培養基組成(g/L ):
[0041]
葡萄糖30
醇母粉4
[0042]KH2PO40.1
MgS04-7H200.3.H:余為水，pH6.0。
[0043]基礎培養基組成(g/L):
[0044]葡萄糖40
醉母粉5
M g S (6.)..1 -7H2O0.1
KH2PO40.5
CaCO'0.05
ZnS04-7H200.1
[0045]其余為水，pH6.0.[0046]實施例2.利用基礎培養基在發酵罐培養高山被孢霉生產ARA
[0047]2L發酵罐培養，裝液量1.5L基礎培養基(如實施例1)，將初始葡萄糖濃度定為60~65g/L，單獨滅菌，發酵溫度維持在28°C，初始攪拌轉速150~200rpm，通氣量Ivvm的條件下對高山被孢霉菌進行分批發酵培養，滅菌前將PH調節至6.5~7.0，滅菌后的初始pH在6.0~6.5，培養12h后溶氧開始迅速下降，生長進入對數期，培養48h之后生長開始進入穩定期，在整個生長周期中，初始PH值為6.0~6.5，過程中pH值先升高后降低再升高，隨著穩定期的到來，最后PH值穩定在7.0~7.9之間；溶氧隨著生物量的增加迅速下降，在對數生長期維持溶氧在0.5%~10%。
[0048]培養期間每12h取樣進行生物質及脂肪酸的分析。培養至第168h，開始收獲菌體，采用實施例1的方法，獲得干菌體18g/L，總油脂7g/L, ARA2.7g/L，發酵液中的葡萄糖濃度從初始的60g/L降至15g/L,具體結果如圖1所示。
[0049]實施例3.氨基酸、維生素和微量元素對高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影響
[0050]在實施例2的基礎培養基中添加了生長因子(維生素、氨基酸)，以及微量元素來提
高產量。
[0051]加入的生長因子包括:
[0052]
維生素B1100~300pg/L
維生素B12501 ~65()Hg/L
生物紊5漏~7W)pg/L
泛酸鈣120~180mg/L
將扠酸0.5~2 g/L
[0053]維生素配成500X濃縮液，使用0.2 μ m無菌過濾膜過濾除菌，并放置4°C冰箱保存，待接種前直接加入基礎培養基中，添加量為2mL/L。谷氨酸在滅菌前配制基礎培養基時加入，隨培養基一同滅菌。
[0054]加入的微量元素包括(g/L):
[0055]FeCl3-6H20
H3BO3
0.5-0.75
MnCl2-4H20
0.8 ~1.0
CoCb-6H20
CuSO4-SH2O
0,002 ~0.004
NiS04-6H20
[0056]微量元素配成1000Χ濃縮液(即IL培養基中加入ImL微量元素濃縮液)，調至ΡΗ7。使用0.2 μ m無菌過濾膜過濾除菌，并放置4°C冰箱保存，待接種前直接加入基礎培養基中。
[0057]為了制備接種菌體，將使用的種子接種在3個含50mL活化培養基的搖瓶中，在280C、150rpm培養3天后，菌體在發酵液中呈現的形態為球狀，直徑為2~4mm，或松散的菌絲聚集體。接種至載液量為1.5L的2L發酵罐，接種量10% (V/V)，若種子在搖瓶中生長的密度較低，則在接種至發酵罐時適當的增加接種量。發酵罐中的培養基為添加了生長因子(維生素、氨基酸)和微量元素的優化培養基，進行分批發酵培養。其中初始葡萄糖濃度為60~65g/L,分開滅菌，12CTC滅菌30min。
[0058]發酵罐的參數如下:溫度:28°C ;通氣:0.5~lvvm ；pH:用25%氨水維持在6.0左右；初始攪拌轉速:150rpm。
[0059]第12h，溶氧開始迅速下降，pH也開始下降，菌體生長進入對數期，將轉速調至200rpm，此后I~2h內開始產生泡沫，加入適量消泡劑。此后將轉速調至250rpm。
[0060]接種時，發酵罐中的菌體是直徑為I~2mm的小球狀，外緣光滑，培養至12h開始，球體開始變大，至24h，球體形狀更清晰，繼續變大，48h開始罐內菌體密度增大，至72h，球體外緣顯得蓬松，且出現類似羽毛絮狀的松散菌絲體，這可能由于較大的球狀菌體開始解體,至120h,球的直徑在2~4mm之間，同時形成了許多松散的菌絲聚集體。每隔12h對發酵罐進行取樣進行生物量及脂肪酸的分析，168h后發酵結束，罐內發酵液的最終體積為
1.2L。獲得干菌體21g/L，總油脂9g/L，ARA3.8g/L，發酵液中的葡萄糖濃度從初始的65g/L降至13g/L，具體結果如圖2所示。
[0061]實施例4.混合氮源對高山被孢霉高山被孢霉生物量及ARA油脂含量的影響
[0062]這一組實驗通過使用混合氮源來進一步提高產量，過程與實施例3基本相同，添加的混合氮源的組成成分及比例通過一系列實驗得到。
[0063]添加的混合氮源包括(g/L):
[0064]玉米漿3
[0065]酵母粉7
[0066]發酵罐在第Ilh，溶氧開始迅速下降，在約第14h開始產生少量泡沫，通過人工加入消泡劑控制。至24h，菌體為直徑I~2mm的球狀，至48h，菌體為直徑2~3mm的球狀，外緣光滑，至72h，開始出現松散的羽毛絮狀菌絲聚集體，球體外緣松散。每隔12h對發酵罐進行取樣進行生物量及脂肪酸的分析，168h后收獲，獲得干菌體36g/L，總油脂16g/L，ARA6.5g/L，發酵液中的葡萄糖濃度從初始的60g/L降至5g/L，具體結果如圖3所示。[0067]實施例5.利用馴化后的高山被孢霉生產ARA
[0068]為使高山被孢霉在發酵培養過程中，對營養物質的吸收更為充分，減少原料的浪費，提高菌種耗糖能力，對菌種進行了馴化，主要通過固體培養基及液體培養基的逐級高糖馴化，提高菌體的耗糖能力，且馴化后的菌種均呈現為有利于油脂積累的外緣帶刺狀的松散球體。利用該馴化后的菌種，使用實施例4中所述的優化后培養基進行分批補料培養，及當葡萄糖濃度降至10g/L左右，流加600g/L葡萄糖，使殘糖控制在10g/L左右，其余操作過程與實施4相同。
[0069]發酵過程中用25%氨水調節控制pH在6.0-6.5。
[0070]第12h，菌體開始生長，菌體為外緣刺狀的小球,直徑I-2mm，之后隨著菌體大量生長，呈現為外緣刺狀的松散的球狀，直徑2-5mm，此時pH開始下降，這是糖代謝先產生酮酸等有機酸，而后被利用再逐漸上升，此時，允許PH降至4.5，至72h，pH會隨著菌體進入穩定期緩慢回升，此時菌體主要為外緣刺狀的松散的球狀，其次為羽毛絮狀的菌絲聚集體，至98h，將pH緩慢升至6.5-7.5之間，但不高于8.0。每隔12h對發酵罐進行取樣進行生物量及脂肪酸的分析，[0071]培養168h后開始收獲，獲得干菌體58g/L，總油脂28g/L，ARA16g/L，發酵結束時發酵液中的葡萄糖濃度趨于零。根據本實施例進行的分批發酵結果顯示，ARA產量較之前已有大幅度提高，具體結果如圖4所示。
【權利要求】
1.一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于包括以下步驟:1)通過搖瓶實驗對高山被孢霉產ARA的培養條件進行優化，所述優化的方法為取4mL種子液接入裝有50mL基礎培養基(葡萄糖40g/L ;酵母粉5g/L ；MgS04-7H200.lg/L ；KH2PO40.5g/L ；CaCO30.05g/L ；ZnS04-7H200.lg/L ；pH6.0)的 250mL 三角瓶，28 °C、150rpm培養5-6d，得到優化培養基:葡萄糖60g/L ;酵母粉或玉米漿10g/L ;谷氨酸1.0g/L ；MgS04-7H200.lg/L ；KH2P042.0g/L ；CaCO30.05g/L ；ZnS04-7H200.lg/L ;混合微量元素 lmL/L ；混合維生素lmL/L ；pH調至6.0 ；2)對高山被孢霉在基礎培養基中進行了2L分批發酵，培養至第168h，開始收獲菌體，獲得干菌體、油脂和ARA ；3)對高山被孢霉在優化培養基中分別以酵母粉和玉米漿為氮源進行了2L分批發酵，再以酵母粉為氮源進行的發酵罐放大實驗，菌體生長正常，未發生自溶現象，并獲得干菌體、油脂和ARA;4)對高山被孢霉在優化培養基中以玉米漿和酵母粉為混合氮源進行培養，將步驟I)中的優化培養基中的氮源替換為玉米漿和酵母粉，得混合氮源優化培養基；5)對高山被孢霉在混合氮源優化培養基中進行2L分批發酵，在2L發酵罐中裝入混合氮源優化培養基，培養168h后收獲干菌體、油脂和ARA ；6)對高山被孢霉進行高糖馴化及對馴化后的菌種在混合氮源優化培養基中進行2L分批發酵，在當葡萄糖濃度降至10g/L時，流加600g/L葡萄糖，使殘糖控制在10g/L左右，其余操作過程與步驟5)相同，培養168h后開始`收獲干菌體、油脂和ARA。
2.如權利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述混合微量元素包括 FeCl3.6H20,、H3BO3> MnCl2.4H20、CoCl2.6H20、CuSO4.5H20、NiSO4.6H20。
3.如權利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟I)中，所述混合維生素包括維生素B12、生物素、維生素B1、泛酸鈣。
4.如權利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述發酵的條件為:將培養3d的液體種子，按10%接種量接種于基礎培養基中，裝液量1.5L，初始葡萄糖濃度為60g/L，在28°C，攪拌轉速200rpm，通氣量lvvm。
5.如權利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟3)中，所述發酵的條件與步驟2)的發酵條件相同。
6.如權利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述培養的方法與步驟I)中的培養方法相同。
7.如權利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述玉米漿和酵母粉的質量比為3: 8。
8.如權利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述混合氮源優化培養基的加入量為1.5L ;所述混合氮源優化培養基中葡萄糖的初始濃度為60g/L，接種量10%，初始pH用25%氨水控制在6.0-6.5，溫度28°C、轉速250rpm。
9.如權利要求1所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述2L分批發酵的具體方法為:首先采用固體培養基馴化，將菌種逐級涂布于梯度高糖平板培養，挑選經固體馴化后能耐受10%高糖濃度平板的菌種轉接到兩種含不同氮源的梯度高糖液體培養基中進行馴化，接著對該馴化后的菌種，使用步驟4)中所述的混合氮源優化培養基進行分批發酵。
10.如權利要求9所述一種花生四烯酸的制備方法，其特征在于所述梯度高糖平板的含糖量分別為2%、5%、7%、10%和15% ;所述兩種含不同氮源的梯度高糖的含糖量分別為3%、4%、5% 和 6% ο
【文檔編號】C12P7/64GK103451247SQ201310416765
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月13日 優先權日:2013年9月13日
【發明者】盧英華, 曾思鈺, 凌雪萍, 敬科舉, 吳意珣, 陳翠雪 申請人:廈門大學