專利名稱：一種促進花生四烯酸油脂高效積累的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種基于培養(yǎng)基成分階段性變化促進花生四烯酸油脂高效積累的方法。
背景技術(shù)：
花生四烯酸(Arachidonicacid, ARA,即 5,8,11,14-二十碳四烯酸)屬于 n_6 系列長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)，是人體中含量最高、分布最廣和最活躍的一種必需 PUFAs (Lombardo Y B, Hein G, Chicco A. Lipids, 2007,42 (5) :427-437)。是前列腺素、環(huán)前列腺素和白三烯類等衍生物的直接前體，具有多種生物活性，在促進智力發(fā)育、提高人體視力、降低血脂、增強免疫力和抗癌等方面具有重要作用，在生物醫(yī)藥、化妝品、功能性食品和保健品等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。由于花生四烯酸在成年人體內(nèi)合成量極少，嬰幼兒體內(nèi)則無法合成，因此從食物中攝取額外的花生四烯酸對人體許多組織特別是腦組織的生長發(fā)育至關(guān)重要。2009年衛(wèi)生部公布“花生四烯酸作為高級營養(yǎng)強化劑在嬰幼兒食品中的添加量擴大到230mg/100g”。花生四烯酸的傳統(tǒng)來源是從動物肝臟、豬腎上腺、蛋黃中提取(Gill I，Valivety R. Trends in biotechnology, 1997,15 (10) :401-409),但動物組織中的花生四烯酸含量很低(約為0.2%)，來源少，且受季節(jié)限制，價格昂貴，無法滿足日益增長的市場需求(Chen
H,Chang C, Chen C. Journal of the American Oil Chemists1 Society,1997,74(5) 569-578)。利用微生物合成法替代傳統(tǒng)的花生四烯酸制備方成為當(dāng)今研究的熱點(Jin M J, Huang H, Xiao AH, et al. Bioprocess and Biosystems Engineering,2008,32(I) 117-122)。2011年衛(wèi)生部公布食品添加劑花生四烯酸油脂(發(fā)酵法)國家標(biāo)準(zhǔn)，要求花生四烯酸含量以花生四烯酸甘油三酯計應(yīng)大于等于38%。目前，花生四烯酸油脂的發(fā)酵生產(chǎn)過程中存在著生產(chǎn)強度低、生產(chǎn)周期長等問題，導(dǎo)致其生產(chǎn)成本居高不下，市場價格昂貴，僅能作為高端營養(yǎng)保健品、化妝品等小規(guī)模使用。目前，花生四烯酸油脂生產(chǎn)過程中主要是采用分批發(fā)酵模式，通常只在分批發(fā)酵模式下考慮某一因素對發(fā)酵過程的影響，如限氮(Koike Y Cai H J, Higashiyama K, et al. Journal of Bioscience and Bioengineering,2001,91 (4) :382-389),改變?nèi)苎?Higashiyama K, Murakami K, Tsujimura H, et al. (1999). Biotechnology and Bioengineering 63(4) :442-448),添加物質(zhì)(Higashiyama K, Yaguchi T, Akimoto K, et al. Journal of the American Oil Chemists1 Society, 1998, 75 (12) 1815-1819.);或是對分批發(fā)酵進行一些后處理如老化工藝(黃和，金明杰，任璐靜等.花生四烯酸油脂的制備方法[P]. CN :101109015. 2008)等。雖然這些方法對花生四烯酸油脂的發(fā)酵生產(chǎn)過程起到了一定的調(diào)控作用，但效果還很有限，在限氮，改變?nèi)苎酰砑游镔|(zhì)等條件下花生四烯酸生產(chǎn)強度低等問題依然沒有得到很好的解決，在老化工藝中雖然花生四烯酸的生產(chǎn)強度得到提高，但生產(chǎn)周期太長為276h左右，而且這些方法通常不易在工業(yè)化中應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)是基于微生物油脂的合成機制，在菌體增殖，油脂積累和花生四烯酸積累的各階段分別進行精確調(diào)控，以提高各階段的反應(yīng)速率為目標(biāo)，相比于分批發(fā)酵工藝顯著提高了花生四烯酸油脂的生產(chǎn)強度，相比于老化工藝顯著縮短了生產(chǎn)周期。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種促進花生四烯酸油脂高效積累的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下—種促進花生四烯酸油脂高效積累的方法,將高山被孢霉(Mortierella alpina) 菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后，在碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基上進行菌體快速增殖培養(yǎng)，收集菌體，再在碳源豐富而其它營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基上進行油脂快速積累培養(yǎng)，收集菌體，最后在缺碳的培養(yǎng)基上進行花生四烯酸快速積累培養(yǎng)，收集菌體。其中，所述的活化培養(yǎng)條件為將菌種接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，20_28°C下培養(yǎng) 120-192h，然后再將斜面上的菌絲體接入搖瓶種子活化培養(yǎng)基中，20-28°C、100-250rpm下活化培養(yǎng)18_24h ;其中，所述的搖瓶種子活化培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20-60g/L，酵母膏 3-6g/L, KH2PO4 2-5g/L, NaNO3 2_5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 3-1. 5g/L，溶劑為水。其中，所述的碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基配方為葡萄糖40-80g/L，酵母膏 6-15g/L，KH2PO4 2-6g/L, NaNO3 2_6g/L，MgSO4 ·7Η20 O. 5_1. 5g/L，泛酸鈣 O. l_2g/L，維生素0. 2-lg/L，溶劑為水；優(yōu)選配方為葡萄糖40-60g/L，酵母膏I lg/L，KH2PO4 3. 8g/L, NaNO3 3. 4g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，泛酸鈣 0. 5g/L，維生素 0. 2g/L，溶劑為水。其中，所述的菌體快速增殖培養(yǎng)條件為接種量5% -20% (v/v)，初始pH5. 5-7. 5， 溫度20-28°C，培養(yǎng)48-72h，轉(zhuǎn)速100_250rpm，通氣量O. 2_2vvm ;優(yōu)選的培養(yǎng)條件為接種量 10% (v/v)，初始 ρΗ5· 5-7. 5，溫度 25。。，培養(yǎng) 48 60h，轉(zhuǎn)速 125rpm。其中，所述的碳源豐富而其它營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基配方為葡萄糖濃度 20-60g/L,泛酸|丐O. Ι-lg/L,維生素O. l_lg/L,溶劑為水；優(yōu)選的培養(yǎng)基配方為葡萄糖濃度40-60g/L，泛酸鈣O. 25g/L，維生素O. lg/L，溶劑為水。其中，油脂快速積累培養(yǎng)條件為pH5-8，溫度20-28 °C，培養(yǎng)時間24_60h，轉(zhuǎn)速100-250rpm，通氣量O. 2_2vvm ;優(yōu)選的培養(yǎng)條件為ρΗ6· 0-6. 5，溫度25 °C，培養(yǎng)時間 48-60h，轉(zhuǎn)速 125rpm。其中，所述的缺碳的培養(yǎng)基配方為酵母膏l(xiāng)_4g/L，KH2PO4 O. 5-1. 5g/L， NaNO3O. 5-1. 5g/L，MgSO4 · 7H20 0. 1-lg/L，泛酸鈣 0. 2-lg/L，維生素 0. 1-0. 5g/L，溶劑為水； 或NaCl O. 9-3g/L，泛酸鈣O. l_lg/L，維生素O. l_lg/L，溶劑為水。所述的培養(yǎng)基配方優(yōu)選 酵母膏 2. 5g/L，KH2PO4 O. 8g/L，NaNO3 O. 7g/L，MgSO4 · 7H20 0. 15g/L，泛酸鈣 0. 25g/L，維生素0. lg/L，溶劑為水；或似(1 0.9g/L，泛酸鈣O. 25g/L，維生素O. lg/L，溶劑為水。其中，所述的花生四烯酸快速積累培養(yǎng)條件為溫度15_25°C，培養(yǎng)時間12_60h， 轉(zhuǎn)速100-250rpm，通氣量O. 2_2vvm ;培養(yǎng)條件優(yōu)選溫度25 °C，培養(yǎng)時間36_60h，轉(zhuǎn)速 125rpm。其中，所述的收集菌體條件為發(fā)酵液離心后，用無菌生理鹽水洗滌、離心，重復(fù)洗滌、離心操作I 2次，收集菌體。將花生四烯酸快速積累培養(yǎng)后得到的菌體真空抽濾收集，烘干，稱重及提取油脂， GC-MS檢測花生四烯酸。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明建立一種基于培養(yǎng)基成分階段性變化促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，先在碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基上培養(yǎng)進行菌體快速增殖，然后在碳源豐富而其它營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基上培養(yǎng)進行油脂快速積累，最后在缺碳的培養(yǎng)基上培養(yǎng)進行花生四烯酸的快速積累。實現(xiàn)對花生四烯酸油脂發(fā)酵過程各個階段的精確調(diào)控。本發(fā)明成功解決了老化工藝(黃和，金明杰，任璐靜等.花生四烯酸油脂的制備方法[P].CN: 101109015. 2008)中花生四烯酸生產(chǎn)周期太長和分批發(fā)酵工藝中花生四烯酸生產(chǎn)強度太低的問題。老化工藝中花生四烯酸生產(chǎn)周期276h，生產(chǎn)強度0.072g/(L*h);分批發(fā)酵工藝花生四烯酸生產(chǎn)周期180h，生產(chǎn)強度0.029g/(L*h);本發(fā)明花生四烯酸生產(chǎn)周期144h，生產(chǎn)強度O. 079g/(L · h)。具有操作簡單，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)強度高，成本低等特點，易于在工業(yè)化中應(yīng)用。


圖I為本發(fā)明方法的工藝流程圖。圖2為不同糖濃度對油脂積累的影響。圖3為不同培養(yǎng)時間對油脂積累的影響。圖4不同pH對油脂積累的影響。圖5為缺碳條件下脂肪酸GC-MS分布圖。
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。以下實施例使用的菌株為高山被孢霉(Mortierella alpina)(保藏編號為CCTCC NO M 207067)實施例I :菌種活化。菌種活化種子在PDA斜面培養(yǎng)基上25°C培養(yǎng)168h，斜面培養(yǎng)基由下列物質(zhì)制成 土豆200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,水IOOOmLo種子活化將斜面上的菌絲體從斜面接入250mL種子搖瓶中進行種子活化培養(yǎng)， 搖瓶裝液量為20% (v/v)，種子活化培養(yǎng)基配方為葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH2P043g/L， NaNO3 3g/L, MgSO4 ·7Η20 O. 5g/L，溶劑為水；pH6. 0，培養(yǎng)條件為溫度 25。。，轉(zhuǎn)速 125rpm，培養(yǎng)時間20h。實施例2 :第一階段菌體快速增殖培養(yǎng)。將實施例I活化后的種子以10% (v/v)的接種量接到7000mL裝有葡萄糖濃度分別為40、60、80和100g/L的碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量為70% (v/v)，碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基除碳源外的營養(yǎng)成分配方為酵母膏 I lg/L, ΚΗ2Ρ043· 8g/L，NaNO3 3. 4g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，泛酸鈣 0. 5g/L，維生素 0. 2g/ L，溶劑為水。培養(yǎng)條件為溫度25°C，轉(zhuǎn)速125rpm，培養(yǎng)時間以能把糖盡量耗完為準(zhǔn)。實驗結(jié)果如表I所示。可見在初糖60g/L時，在60h時葡萄糖耗完，生產(chǎn)強度達(dá)到最大為O. 47g/(L-h),菌體干重為27. 43g/L，在100g/L時菌體干重達(dá)到最大為33. 9g/L，生產(chǎn)強度最低為 O. 20g/ (L · h),所以選擇初糖60g/L為最佳初糖濃度。表I不同初糖濃度對菌體增殖的影響
權(quán)利要求
1.一種促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，將高山被孢霉 (Mortierella alpina)菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后，在碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基上進行菌體快速增殖培養(yǎng)，收集菌體，再在碳源豐富而其它營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基上進行油脂快速積累培養(yǎng)，收集菌體，最后在缺碳的培養(yǎng)基上進行花生四烯酸快速積累培養(yǎng)，收集菌體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的活化培養(yǎng)條件為將菌種接種在PDA斜面培養(yǎng)基上，20-28°C下培養(yǎng)120-192h，然后再將斜面上的菌絲體接入搖瓶種子活化培養(yǎng)基中，20-28°C、100-250rpm下活化培養(yǎng)18_24h ;其中，所述的搖瓶種子活化培養(yǎng)基的配方為葡萄糖20-60g/L，酵母膏3-6g/L，KH2PO4 2_5g/ L, NaNO3 2-5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3-1. 5g/L，溶劑為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基配方為葡萄糖40-80g/L，酵母膏6-15g/L，KH2PO4 2-6g/L，NaNO3 2_6g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5-1. 5g/L，泛酸鈣 0. l_2g/L，維生素 0. 2-lg/L，溶劑為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的菌體快速增殖培養(yǎng)條件為:接種量5% -20%卜八)，初始？冊.5-7.5，溫度20-281，培養(yǎng) 48-72h，轉(zhuǎn)速 100-250rpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的碳源豐富而其它營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基配方為葡萄糖濃度20-60g/L,泛酸|丐O. 1-lg/L, 維生素O. Ι-lg/L，溶劑為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，油脂快速積累培養(yǎng)條件為ΦΗ5-8，溫度20-28°C，培養(yǎng)時間24_60h，轉(zhuǎn)速100-250rpm。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的缺碳的培養(yǎng)基配方為酵母膏 l_4g/L，KH2PO4 O. 5-1. 5g/L，NaNO3 O. 5-1. 5g/L，MgSO4 · 7H200.1-lg/L，泛酸鈣 0. 2-lg/L，維生素 0. 1-0. 5g/L，溶劑為水；或 NaCl O. 9_3g/L，泛酸鈣O.1-lg/L，維生素O. 1-lg/L，溶劑為水。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的花生四烯酸快速積累培養(yǎng)條件為溫度15-25°C，培養(yǎng)時間12-60h，轉(zhuǎn)速100_250rpm。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，其特征在于，所述的收集菌體條件為發(fā)酵液離心后，用無菌生理鹽水洗滌、離心，重復(fù)洗滌、離心操作I 2次， 收集菌體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進花生四烯酸油脂高效積累的方法，將高山被孢霉(Mortierella alpina)菌種經(jīng)活化培養(yǎng)后，在碳源和其它營養(yǎng)物質(zhì)豐富的培養(yǎng)基上進行菌體快速增殖培養(yǎng)，收集菌體，再在碳源豐富而其它營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的培養(yǎng)基上進行油脂快速積累培養(yǎng)，收集菌體，最后在缺碳的培養(yǎng)基上進行花生四烯酸快速積累培養(yǎng)，收集菌體。本發(fā)明技術(shù)實現(xiàn)對花生四烯酸油脂發(fā)酵過程各個階段的精確調(diào)控，具有操作簡單，生產(chǎn)周期短，花生四烯酸生產(chǎn)強度大，油脂品質(zhì)好等特點，易于在工業(yè)化中應(yīng)用。
文檔編號C12P7/64GK102586351SQ20121005613
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月6日
發(fā)明者叢蕾蕾, 彭超, 紀(jì)曉俊, 聶志奎, 鄧中濤, 黃和, 黎志勇 申請人:南京工業(yè)大學(xué)