專利名稱：用于處理有機固體廢物的復合菌劑及其制備方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物復合菌劑及其制備方法，特別是一種用于有機固體廢物的生物處理，如對農作物秸稈、固體形畜禽糞便、城市有機垃圾等進行生物處理的復合菌劑及其制備方法。該復合菌劑也可用于對污水或廢水進行生物處理。
背景技術：
眾所周知，對有機固體廢物進行生物處理應用于沼氣發酵，已是當前治理有機固體廢物對環境的污染和開發可再生能源十分有效的技術。實際應用過程中發現，在沼氣發酵工藝處理的有機固體廢物中，特別是在各種農作物秸稈、城市有機垃圾中，含有難降解的纖維素和木質素，靠自然環境中的微生物菌群進行分解，其分解速度慢，時間長，發酵效果差。其原因就在于自然環境中處理有機固體廢物的堆垛各部位的溫度差異較大，有的部位是高溫區，只有高溫菌群才能發揮其主要優勢，非高溫區主要是中溫菌群發揮作用，各自的生物特性得不到充分利用。因此，出現上述沼氣發酵效果差的現象。
據國內、外相關文獻報導得知，目前使用的處理有機固體廢物，如農作物秸桿等的菌劑，在處理有機固體廢物過程中有效菌群的配比存在一定的缺陷性，沒有把分解纖維素能力強，酶活力高的優勢菌群合理地組合起來應用，不能充分地發揮各菌群自身的生物特性和相互協調的作用功效。另外，現有菌劑生產過程中，采用的混合菌劑是未經單獨培養混制而成的菌群，因其各個菌群生長的條件、生長速度差異較大，故會造成相互匹配比例失調，起主要功能的微生物生長緩慢、數量減少，從而導致優勢菌群的主要作用不能有效地發揮，影響對農作物秸稈、固體形畜、禽糞、城市有機垃圾等有機固體廢物的生物處理效果，降低沼氣發酵的產氣率和原料利用率。
為增加治理有機固體廢物的作用效果，從根本上消除對環境的污染，提高開發可再生能源的原料利用率，國內、外專家在這方面都作了大量工作。但大多停留在生物處理的工藝流程的調整和設備的改造上，如專利申請號為891058680中公開了一種“自動攪拌高效沼氣發酵新工藝”，這種工藝是根據能量學、動力學和微生物發酵學的基本原理，采用一種由沼氣池內壓力變化而自動啟閉的裝置，使液料定向流動而達到自動攪拌的目的。但是，這種處理工藝的原料為豬糞，不適用全秸桿沼氣發酵。如專利申請號為971253234“沼氣生成新方法及其沼氣快速生成器”中公開了一種帶有攪拌裝置的圓筒形容器，沼氣的生成過程是在一個具有保溫和自聚熱功能的封閉容器內進行的，是以漿液料為原料接種沼氣催化劑，在充分攪拌中使漿液發酵。這種沼氣生成器同樣也不適用全秸桿沼氣發酵。也有的采用研制造氣催化劑或生物活性添加劑的方法，來提高沼氣發酵的效果和原料利用率。如專利號為971078149中公開了一種“城市有機垃圾發酵產沼氣方法”，該方法是利用城市有機垃圾，先進行好氧發酵，然后加入發酵菌液進行厭氧產沼氣發酵。它不適用對秸桿類進行直接厭氧產沼氣發酵。專利號為011290736“沼氣發酵生物活性添加劑”中公開了利用外源導入一定酶活水平、一定配方的水解酶于沼氣發酵體系中，來提高原料分得率，但在出料時，該添加劑會流失，增加了沼氣生產成本。專利號為021223874“混合沼氣發酵料及其制備方法”中雖然公開了一種利用秸桿產沼氣，但其是將鮮品秸桿切碎干燥再粉碎，原料受季節約束，破碎工藝較為復雜、麻煩，入池時需加入木薯粉、糟粕渣作為部分氮源補充，其補充數量較大，原料來源有限，故影響其推廣應用。另外，因原料未經堆漚，入池后產氣慢，特別是在寒冷地區發酵效果更差。專利申請號為2004100128660“一種沼氣配制料”中公開了利用高產氣的農作物秸桿中的一種或幾種為發酵料，并添加米皮糠、葡萄糖、三磷酸腺甙二鈉、氧化鈣等原料為添加劑，組成沼氣配制料。這種沼氣配制料未經堆漚，影響其發酵效果，產沼氣慢，另外，添加物價格比較貴，且該沼氣配料需和糞便等化糞池中的垃圾混合產生沼氣，因此，不利于推廣應用。
迄今為止，還未見用于有機固體廢物生物處理的、單獨培養而混配的復合菌劑的相關報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于處理有機固體廢物的復合菌劑及其制備方法，該復合菌劑從根本上解決了現有技術中存在的混配菌群不能發揮各自優勢的缺陷，其單獨培養而混合在一起的菌群匹配合理，適用范圍廣，能充分地發揮各菌群自身的生物特性和相互協調的作用功效，顯著縮短處理有機固體廢物時間，提高原料利用率和處理效果及其生成物產量和質量，人工培養過程中的菌種穩定，制備方法簡便、菌群生長速度快，有利于對有機固體廢物的治理，無任何環境污染。
本發明的目的是這樣實現的該用于處理有機固體廢物的復合菌劑的技術要點是由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC NO.1364的高溫單胞菌(Thermomonospora)，登記入冊編號為CGMCC NO.1365的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，登記入冊編號為CGMCC NO.1366的木霉菌(Trichoderma)和中國普通微生物菌種保藏管理中心1997年版的菌種目錄中公開的菌種編號為1.813的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)混配而成，所述各組份的重量比為高溫單胞菌∶枯草芽孢桿菌∶木霉菌∶地衣芽孢桿菌＝9～13∶2～4∶3～4∶2～3。
所述各組份的重量比優先選用高溫單胞菌∶枯草芽孢桿菌∶木霉菌∶地衣芽孢桿菌＝11∶3∶3.6∶2.4。
所述用于處理有機固體廢物的復合菌劑的制備方法的技術要點是首先將高溫單胞菌CGMCC1364、枯草芽孢桿菌CGMCC1365、木霉菌CGMCC1366，分別進行單獨培養，生成的菌體經烘干后與記載在菌種目錄中并公開使用的木霉菌CGMCC1.813干品混勻，即得復合菌劑；所述各組份的重量比為高溫單胞菌∶枯草芽孢桿菌∶木霉菌∶地衣芽孢桿菌＝9～13∶2～4∶3～4∶2～3；所述各菌的單獨培養操作步驟如下(1)高溫單胞菌CGMCC1364的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得高溫單胞菌，再回接到經滅菌的培養基上，從斜面培養到培養罐中培養，采用逐級擴大培養法，培養溫度45～60℃下，經生產種培養罐培養24～48小時后得到培養液，與滅過菌的固體培養基混合，培養液∶固體培養基＝1∶3.5～4.0，混合后置入曲池通風培養84～100小時，培養溫度為45℃～55℃，長成高溫單胞菌體后，于55～60℃下烘干備用；所述培養罐中的培養基各組份的重量比為可溶性淀粉0.5～2.5份、KNO30.1～0.2份、MgSO4·7H2O 0.03～0.08份、NaCl 0.3～0.6份、K2HPO40.05～0.1份、FeSO40.0005～0.001份、酵母膏0.1～0.2份；所述固體培養基各組分的重量比為麥麩80～85份，秸稈粉14～19份，尿素0.5～1份；(2)枯草芽孢桿菌CGMCC1365的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得枯草芽孢桿菌，再回接到經滅菌的培養基上，從斜面培養到培養罐的培養，采用逐級擴大培養法，經生產種培養罐培養，培養溫度為45℃～55℃，培養12～24小時后，得到液體培養液，用麥麩吸附，培養液∶麥麩＝1∶2.5～3.0，于55～60℃下烘干備用；培養罐的培養基采用牛肉育0.2～0.3份，蛋白胨0.5～1.0份，蔗糖0.3～0.6份，NaCl 0.2～0.5份；(3)木霉菌CGMCC 1366的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得木霉菌，，再回接到經滅菌的PDA培養基上，從斜面培養到培養罐的培養，采用逐級擴大培養法，斜面種采用PDA培養基；從三角瓶種到曲池培養均采用固體培養基，三角瓶和曲盤用的固體培養基各組分重量比為麥麩90～93份，秸稈粉4.5～6.0份，玉米粉2～3份，(NH4)2SO40.5～1.0份；固體培養基的含水率為55～70％，曲池種的培養基各組分重量比為麥麩85～90份，秸桿粉7～12份，玉米粉2.5～4.0份，尿素0.5～1.0份，培養溫度為26℃～34℃，在35～38℃下烘干，從接種到長孢子培養至少72小時；(4)地衣芽孢桿菌CGMCC1.813的制備地衣芽孢桿菌的制備方法與步驟(2)所述枯草芽孢桿菌的制備方法基本相同，其中培養溫度為30℃～35℃，培養18～24小時。
由于本發明采用的對有機固體廢物進行生物處理的菌劑，是人工單獨培養按比例混配的復合菌劑，可以充分地發揮菌劑中各菌群自身的生物特性和相互協同作用，所以能從根本上解決現有技術中存在的依靠自然環境中的微生物菌群進行分解和未經單獨培養而混配的菌群，不能有效發揮各菌群自身優勢的缺陷。本發明采用分解纖維素的高溫菌(嗜熱菌)中，所選高溫放線菌為高溫單胞菌CGMCC1364(以下簡稱Q-0菌)；所選高溫細菌為枯草芽孢桿菌CGMCC1365(以下簡稱Q-3菌)。在高溫菌中這是兩株有相互協同作用的菌群，兩種菌群組合可以提高纖維素的分解率。采用的中溫菌(嗜溫菌)中，所選中溫真菌為木霉菌CGMCC 1366(以下簡稱Tri-1菌)，其分解纖維素能力較強；所選中溫細菌為分解木質素的地衣芽孢桿菌CGMCC1.813(以下簡稱L-1菌)。在該復合菌劑制備過程中，將種菌單獨培養，最后按適宜比例混配，能很好地保持復合菌劑中的各菌群數量比例相對穩定。另外，在自然環境中處理有機固體廢物，啟動溫度較低，菌劑中的中溫菌是啟動能，中溫菌發酵產熱后才能進入高溫階段，在高溫條件下高溫菌快速生長并加快有機物的降解。另外，處理有機物的堆垛各部位的溫度差異較大，有的部位是高溫區，高溫菌發揮其主要優勢，非高溫區主要是中溫菌發揮作用。本發明的復合菌劑與依靠自然環境進行分解的微生物菌群及與未經單獨培養而混配的菌群相比，采用單獨培養后再混配在一起的菌群，由于可以根據實際需要選擇合理的匹配比例，能充分地發揮菌劑中各菌群自身的生物特性和相互協同作用，所以用其進行生物處理的適用范圍非常廣泛。將該復合菌劑用于對農作物秸稈、固體形畜、禽糞、城市有機垃圾等有機固體廢物進行生物處理，可以顯著縮短生物處理時間，提高沼氣發酵的生成物產量和質量，提高開發可再生能源的原料利用率，有利于對有機固體廢物的治理，在治理過程中不產生任何環境污染。該制備方法與其它生物活性添加劑加工方法相比，操作簡便、菌群生長速度快，可為連續批量生產打下良好基礎。因此，本發明的復合菌劑及其制備方法容易推廣應用。經四川省疾病預防控制中心的小鼠急性毒性檢驗，結果表明該復合菌劑對雌雄小鼠急性經口LD50值大于10000mg/kg，實驗動物經大體解剖各臟器未見異常，參照《食品安全性毒理學評價程序和方法》GB15193.3中急性毒性分級，實際無毒。
具體實施例方式
以下結合實施方式對本發明進行詳細說明。本發明的復合菌劑中，采用的分解纖維素的高溫菌(嗜熱菌)中，所選高溫放線菌為Q-0菌；所選高溫細菌為q-3菌。在高溫菌中這是兩種有相互協同作用的菌群，兩種菌群組合可以提高纖維素的分解率。采用的中溫菌(嗜溫菌)中，所選中溫真菌為Tri-1菌，其分解纖維素能力較強；所選中溫細菌為分解木質素的L-1菌。L-1菌來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心，Q-0、Q-3、Tri-1三種菌是從四川省宜賓垃圾處理廠堆肥中分離而來。Q-0、Q-3、Tri-1菌的分離方法是從堆肥中取回的樣品放入裝有好氧纖維素培養基的三角瓶中，分別放入50℃和30℃下振蕩培養14天，然后采用含纖維素的培養基進行培養器分離。挑取在培養器培養基上出現分解纖維素的透明圈的菌落，分別進行分離純化。最后分離得到這三株菌株。好氧纖維素分解菌的培養基重量比為NaCl 0.6份、MgSO4.7H2O 0.01份、KH2PO40.05份、K2HPO40.1份、Cacl20.01份、酵母膏0.1份、(NH4)2SO40.2份，自制纖維素粉0.1份、水100份，PH 7.2～7.5。如果制備固體培養基加入1.5份的瓊脂。經中國科學院成都生物研究所測試，人工培養的菌株在顯微鏡下觀察，Q-0、Q-3、Tri-1三株菌的生長特征如下菌株Q-0，分解纖維素，該菌有氣生菌絲和基內菌絲，基內菌絲寬0.3～1.0μm，微黃色，多分枝，交結成網；氣生菌絲白色，發達，寬1.4-～2.1μm；孢子單個著生在氣生菌絲的小梗上，孢子直徑0.4～0.7μm，表面光滑，圓形；生長溫度35～60℃，最適生長溫度為50℃、生長pH 6.0～12.0，最適pH 7.5。在50℃下培養時間24～36小時，在固體培養基上(斜面或培養器上)24小時后出現白色的菌落。培養基的組分重量比為可溶性淀粉2份，KNO30.1份，酵母膏0.1份，MgSO4·7H2O 0.05份，NaCl 0.05份，K2HPO40.05份，FeSO40.001份。該菌是一株高溫放線菌。Q-O菌于2005年4月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號CGMCC NO.1364。
Q-3菌細胞呈直桿狀，0.5～2.5μm×1.2～10μm，成對或成鏈狀排列；芽孢橢園、卵園、柱狀；培養溫度35-～55℃。生長pH 7.2。在50℃下培養時間為24～36小時。培養基重量比為牛肉膏0.2份，蛋白胨0.5份，蔗糖0.4份，NaCl 0.5份。Q-3菌是一株高溫細菌，與Q-O混合培養可以提高纖維素的分解率，該菌于2005年4月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號CGMCC NO.1365。
Tri-1菌，菌絲密集如氈，分生孢子梗從菌絲的側枝上生出，直立，分枝，頂端膨大，分生孢子成團；孢子呈球形、淺色或無色。生長溫度27℃～30℃，pH為6.8，斜面培養的培養基為由馬鈴薯、蔗糖為主要成分的PDA培養基，在30℃下培養24小時開始生長菌絲，48小時后開始生長孢子，最后菌落呈綠色，培養時間72～84小時。三角瓶種和曲盤種培養基重量比為麥麩90～93份，秸稈粉4.6～6份，玉米粉2～3份，(NH4)2SO40.5～1.0份。曲池培養的培養基麥麩85～90份，秸稈粉7～12份，玉米粉2.5～4份，尿素0.5～1份。Tri-1菌是一株真菌，2005年4月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，登記入冊編號CGMCCNO.1366。
L-1菌，細胞呈直桿狀，0.5×2.0μm×1.0-12μm，G+，芽孢卵圓、柱狀，為好氧菌。該菌是一株分解木質素的細菌，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)1997年版的菌種目錄第7頁中公開，菌株編號為1.813。培養基重量比為牛肉膏0.3份，蛋白胨0.5份，NaCl 0.5份，蔗糖0.2份，培養溫度30℃。
處理有機固體廢物的復合菌劑的制備方法是先將各菌分別進行培養、烘干，最后按比例配制混合后包裝而成。復合菌劑中各菌的重量比為Q-0菌9～13份，Q-3菌2～4份，Tri-1菌3～4份，L-1菌2～3份。
所述各菌的單獨培養操作步驟如下(1)高溫單胞菌CGMCC1364的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得高溫單胞菌，再回接到經滅菌的培養基上，從斜面培養到培養罐中培養，采用逐級擴大培養法，培養溫度45～60℃下，經生產種培養罐培養24～48小時后得到培養液，與滅過菌的固體培養基混合，培養液∶固體培養基＝1∶3.5～4.0，混合后置入曲池通風培養84～100小時，培養溫度為45℃～55℃，長成高溫單胞菌體后，于55～60℃下烘干備用；所述培養罐中的培養基各組份的重量比為可溶性淀粉0.5～2.5份、KNO30.1～0.2份、MgSO4·7H2O 0.03～0.08份、NaCl 0.3～0.6份、K2HPO40.05～0.1份、FeSO40.0005～0.001份、酵母膏0.1～0.2份；所述固體培養基各組分的重量比為麥麩80～85份，秸稈粉14～19份，尿素0.5～1份；(2)枯草芽孢桿菌CGMCC1365的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得枯草芽孢桿菌，再回接到經滅菌的培養基上，從斜面培養到培養罐的培養，采用逐級擴大培養法，經生產種培養罐培養，培養溫度為45℃～55℃，培養18～24小時后，得到液體培養液，用麥麩吸附，培養液∶麥麩＝1∶2.5～3.0，于55～60℃下烘干備用；培養罐的培養基采用牛肉育0.2～0.3份，蛋白胨0.5～1.0份，蔗糖0.3～0.6份，NaCl 0.2～0.5份；(3)木霉菌CGMCC 1366的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得木霉菌，，再回接到經滅菌的PDA培養基上，從斜面培養到培養罐的培養，采用逐級擴大培養法，斜面種采用PDA培養基；從三角瓶種到曲池培養均采用固體培養基，三角瓶和曲盤用的固體培養基各組分重量比為麥麩90～93份，秸稈粉4.5～6.0份，玉米粉2～3份，(NH4)2SO40.5～1.0份；固體培養基的含水率為55～70％，曲池種的培養基各組分重量比為麥麩85～90份，秸桿粉7～12份，玉米粉2.5～4.0份，尿素0.5～1.0份，培養溫度為26℃～34℃，在35～38℃下烘干，從接種到長孢子培養至少72小時；(4)地衣芽孢桿菌CGMCC1.813的制備地衣芽孢桿菌的制備方法與步驟(2)所述枯草芽孢桿菌的制備方法基本相同，其中培養溫度為30℃～35℃，培養18～24小時。
實施例一 制備處理有機固體廢物的復合菌劑先將各菌分別進行培養、烘干，最后按比例配制混合后包裝而成。復合菌劑中各菌的重量比為Q-0菌9份，Q-3菌4份，Tri-1菌4份，L-1菌3份。
所述各菌的單獨培養操作步驟如下1、Tri-1菌的制備(1)先制備試管斜面種培養基采用PDA培養基，其組分為去皮切成小塊的馬鈴薯200g，蔗糖20g。將馬鈴薯煮熟后過濾，取濾液加水到1000ml，加入蔗糖，加入瓊脂15g后溶化，裝入試管，滅菌制成斜面。將原種接種于斜面上，放于26℃培養箱中培養120小時后才生長孢子。
(2)三角瓶種培養基麥麩90份，秸稈粉6份，玉米粉3份，(NHa)2SO41份，加水使培養培養基的含水率達到55％，混合后裝入500ml三角瓶中，在121℃下滅菌30分鐘，冷卻后，用斜面種作接種，接種后放入30℃培養箱中培養。培養48小時后，培養基布滿菌絲，然后進行扣瓶，再繼續培養48小時，從接種到長孢子約96小時。
(3)曲盤種培養基組分及其配比、加水量等同三角瓶種，經混合后121℃下滅菌，冷卻后用三角瓶種作為接種物，接種后混合均勻，裝入曲盤入曲房，在29℃下培養84小時，即為曲盤種。
(4)曲池種培養基為麥麩85份，玉米粉3份，秸稈粉11份，尿素1份，加水使培養基的含水率為45％，混合后121℃滅菌，冷卻后加入曲盤種，然后入曲池在28℃下通風培養。培養120小時后，從曲池中出料，經35℃下烘干即成半成品。
2、Q-O菌的制備(1)斜面種每百份重量培養基中含有可溶性淀粉0.5份、KNO30.1份、MgSO4.7H2O 0.03份、NaCl 0.5份、K2HPO40.05份、FeSO40.001份、酵母膏0.1份，余量為水，加入瓊脂量為培養基重量的1.8％，溶化后調PH于7.5，分裝于試管中，經121℃滅菌后作成斜面，凝固后接入原種，于45℃下培養48小時。
(2)三角瓶種培養基組分和含量同斜面種，不加瓊脂作成液體，裝入500ml三角瓶中滅菌，冷卻后接入試管種，放入50℃振蕩培養36小時。
(3)一級培養罐(15升)、二級培養罐(150升)、生產種培養罐(1500升)，培養基組分和含量與三角瓶相同，經滅菌的培養基冷卻后，一級培養罐接三角瓶種，經培養36小時后，一級培養罐的種接種到二級培養罐中，二級培養罐中的種又接種到生產種罐中。培養溫度均為50℃，培養36小時。
(4)固體培養經生產種罐培養后的培養液接種到固體培養基，固體培養基各組份為麥麩80份、秸稈粉19份、尿素1份，加水使培養基的含水率達到45％，經混合、滅菌、冷卻，冷卻后加培養液，培養液∶固體培養基＝1∶3.5～4.0，拌均勻后入曲池，50℃下通風培養100小時，最后于58℃下烘干備用。
3、Q-3菌的制備(1)斜面種每百份培養基中含有牛肉膏0.2份、蛋白質0.5份，蔗糖0.3份、NaCl 0.2份、余量為水，瓊脂加入量為培養基的1.8％，PH7.2。制備斜面培養的方法同其它菌的斜面培養基。制成的斜面培養基接種，放入45℃培養箱中培養24小時。
(2)三角瓶中，一級培養罐種、二級培養罐種、生產培養罐種。
①培養基的組分和配比除了不加瓊脂外其它同斜面種。
②從三角瓶到生產種培養罐(1500升)，均采用逐級擴大。
③培養溫度50℃，培養24小時。
④生產培養罐培養好的菌，排出生產培養罐后用麥麩吸附，培養液和麥麩的比例為1∶2.5。
⑤將培養液和麥麩拌均后，58℃條件下烘干備用。
4、L-1菌的制備(1)斜面種每百份培養基中含有牛肉膏0.2份、蛋白質0.5份，蔗糖0.3份、NaCl 0.2份、余量為水，瓊脂加入量為培養基的1.8％，PH7.2。制備斜面培養的方法同其它菌的斜面培養基。制成的斜面培養基接種，放入30℃培養箱中培養24小時。
(2)三角瓶中，一級培養罐種、二級培養罐種、生產培養罐種。
①培養基的組分和配比除了不加瓊脂外其它同斜面種。
②從三角瓶到生產種培養罐(1500升)，均采用逐級擴大。
③培養溫度為30℃，培養24小時。
④生產培養罐培養好的菌，排出生產培養罐后用麥麩吸附，培養液和麥麩的比例為1∶3.0。
⑤將培養液和麥麩拌均后，在35℃條件下烘干備用。
實施例二制備處理有機固體廢物的復合菌劑先將各菌分別進行培養、烘干，最后按比例配制混合后包裝而成。復合菌劑中各菌的重量比為Q-0菌10份，Q-3菌3份，Tri-1菌3份，L-1菌2.5份。
所述各菌的單獨培養操作步驟如下1、Tri-1菌的制備(1)先制備試管斜面種培養基采用PDA培養基，其組分為去皮切成小塊的馬鈴薯200g，蔗糖20g。將馬鈴薯煮熟后過濾，取濾液加水到1000ml，加入蔗糖，加入瓊脂15g后溶化，裝入試管，滅菌制成斜面。將原種接種于斜面上，放于30℃培養箱中培養72小時后才生長孢子。
(2)三角瓶種培養基麥麩91份，秸稈粉6份，玉米粉2.5份，(NHa)2SO40.5份，加水使培養培養基的含水率達到55％，混合后裝入500ml三角瓶中，在121℃下滅菌30分鐘，冷卻后，用斜面種作接種，接種后放入30℃培養箱中培養。培養36小時后，培養基布滿菌絲，然后進行扣瓶，再繼續培養36小時，從接種到長孢子約72小時。
(3)曲盤種培養基組分及其配比、加水量等同三角瓶種，經混合后121℃下滅菌，冷卻后用三角瓶種作為接種物，接種后混合均勻，裝入曲盤入曲房，在29℃下培養84小時，即為曲盤種。
(4)曲池種培養基為麥麩87份，玉米粉2.5份，秸稈粉10份，尿素0.5份，加水使培養基的含水率為50％，混合后121℃滅菌，冷卻后加入曲盤種，然后入曲池在28℃下通風培養。培養96小時后，從曲池中出料，經35℃下烘干即成半成品。
2、Q-0菌的制備(1)斜面種每百份重量培養基中含有可溶性淀粉1.0份、KNO30.15份、MgSO4.7H2O0.05份、NaCl 0.3份、K2HPO40.08份、FeSO40.005份、酵母膏0.15份，余量為水，加入瓊脂量為培養基重量的1.8％，溶化后調PH于7.5，分裝于試管中，經121℃滅菌后作成斜面，凝固后接入原種，于50℃下培養24小時。
(2)三角瓶種培養基組分和含量同斜面種，不加瓊脂作成液體，裝入500ml三角瓶中滅菌，冷卻后接入試管種，放入50℃振蕩培養36小時。
(3)一級培養罐(15升)、二級培養罐(150升)、生產種培養罐(1500升)，培養基組分和含量與三角瓶相同，經滅菌的培養基冷卻后，一級培養罐接三角瓶種，經培養36小時后，一級培養罐的種接種到二級培養罐中，二級培養罐中的種又接種到生產種罐中。培養溫度均為50℃，培養36小時。
(4)固體培養經生產種罐培養后的培養液接種到固體培養基，固體培養基各組份為麥麩85份、秸稈粉14.5份、尿素0.5份，加水使培養基的含水率達到50％，經混合、滅菌、冷卻，冷卻后加培養液，培養液∶固體培養基＝1∶4.0，拌均勻后入曲池，50℃下通風培養72小時，最后于58℃下烘干備用。
3、Q-3菌的制備(1)斜面種每百份培養基中含有牛肉膏0.3份、蛋白質0.8份，蔗糖0.5份、NaCl 0.4份、余量為水，瓊脂加入量為培養基的1.8％，PH7.2。制備斜面培養的方法同其它菌的斜面培養基。制成的斜面培養基接種，放入50℃培養箱中培養18小時。
(2)三角瓶中，一級培養罐種、二級培養罐種、生產培養罐種。
①培養基的組分和配比除了不加瓊脂外其它同斜面種。
②從三角瓶到生產種培養罐(1500升)，均采用逐級擴大。
③培養溫度50℃，培養24小時。
④生產培養罐培養好的菌，排出生產培養罐后用麥麩吸附，培養液和麥麩的比例為1∶2.5。
⑤養液和麥麩拌均后，58℃條件下烘干備用。
4、L-1菌的制備(1)斜面種每百份培養基中含有牛肉膏0.3份、蛋白質0.8份，蔗糖0.5份、NaCl 0.4份、余量為水，瓊脂加入量為培養基的1.8％，PH7.2。制備斜面培養的方法同其它菌的斜面培養基。制成的斜面培養基接種，放入32℃培養箱中培養18小時。
(2)三角瓶中，一級培養罐種、二級培養罐種、生產培養罐種。
①養基的組分和配比除了不加瓊脂外其它同斜面種。
②三角瓶到生產種培養罐(1500升)，均采用逐級擴大。
③培養溫度為32℃，培養18小時。
④生產培養罐培養好的菌，排出生產培養罐后用麥麩吸附，培養液和麥麩的比例為1∶3.0。
將培養液和麥麩拌均后，在35℃條件下烘干備用。
實施例三 制備處理有機固體廢物的復合菌劑先將各菌分別進行培養、烘干，最后按比例配制混合后包裝而成。復合菌劑中各菌的重量比為Q-0菌13份，Q-3菌2份，Tri-1菌2份，L-1菌3份。
所述各菌的單獨培養操作步驟如下1、Tri-1菌的制備(1)先制備試管斜面種培養基采用PDA培養基，其組分為去皮切成小塊的馬鈴薯200g，蔗糖20g。將馬鈴薯煮熟后過濾，取濾液加水到1000ml，加入蔗糖，加入瓊脂15g后溶化，裝入試管，滅菌制成斜面。將原種接種于斜面上，放于26℃培養箱中培養120小時后才生長孢子。
(2)三角瓶種培養基麥麩92份，秸稈粉5份，玉米粉2.2份，(NHa)2SO40.8份，加水使培養培養基的含水率達到60％，混合后裝入500ml三角瓶中，在121℃下滅菌30分鐘，冷卻后，用斜面種作接種，接種后放入34℃培養箱中培養。培養60小時后，培養基布滿菌絲，然后進行扣瓶，再繼續培養60小時，從接種到長孢子約120小時。
(3)曲盤種培養基組分及其配比、加水量等同三角瓶種，經混合后121℃下滅菌，冷卻后用三角瓶種作為接種物，接種后混合均勻，裝入曲盤入曲房，在29℃下培養84小時，即為曲盤種。
(4)曲池種培養基為麥麩90份，玉米粉2.5份，秸稈粉7份，尿素0.15份，加水使培養基的含水率為55％，混合后121℃滅菌，冷卻后加入曲盤種，然后入曲池在30℃下通風培養。培養84小時后，從曲池中出料，經35℃下烘干即成半成品。
2、Q-O菌的制備(1)斜面種每百份重量培養基中含有可溶性淀粉2.0份、KNO30.2份、MgSO4.7H2O 0.08份、NaCl 0.6份、K2HPO40.1份、FeSO40.001份、酵母膏0.2份，余量為水，加入瓊脂量為培養基重量的1.8％，溶化后調PH于7.5，分裝于試管中，經121℃滅菌后作成斜面，凝固后接入原種，于55℃下培養18小時。
(2)三角瓶種培養基組分和含量同斜面種，不加瓊脂作成液體，裝入500ml三角瓶中滅菌，冷卻后接入試管種，放入55℃振蕩培養24小時。
(3)一級培養罐(15升)、二級培養罐(150升)、生產種培養罐(1500升)，培養基組分和含量與三角瓶相同，經滅菌的培養基冷卻后，一級培養罐接三角瓶種，經培養36小時后，一級培養罐的種接種到二級培養罐中，二級培養罐中的種又接種到生產種罐中。培養溫度均為55℃，培養24小時。
(4)固體培養經生產種罐培養后的培養液接種到固體培養基，固體培養基各組份為麥麩82份、秸稈粉17份、尿素1份，加水使培養基的含水率達到45％，經混合、滅菌、冷卻，冷卻后加培養液，培養液∶固體培養基＝1∶3.5，拌均勻后入曲池，50℃下通風培養100小時，最后于58℃下烘干備用。
3、Q-3菌的制備(1)斜面種每百份培養基中含有牛肉膏0.3份、蛋白質1.0份，蔗糖0.6份、NaCl 0.5份、余量為水，瓊脂加入量為培養基的1.8％，PH7.2。制備斜面培養的方法同其它菌的斜面培養基。制成的斜面培養基接種，放入55℃培養箱中培養18小時。
(2)三角瓶中，一級培養罐種、二級培養罐種、生產培養罐種。
⑤培養基的組分和配比除了不加瓊脂外其它同斜面種。
⑥從三角瓶到生產種培養罐(1500升)，均采用逐級擴大。
⑦培養溫度50℃，培養24小時。
⑧生產培養罐培養好的菌，排出生產培養罐后用麥麩吸附，培養液和麥麩的比例為1∶2.5。
⑨將培養液和麥麩拌均后，58℃條件下烘干備用。
4、L-1菌的制備(1)斜面種每百份培養基中含有牛肉膏0.3份、蛋白質1.0份，蔗糖0.6份、NaCl 0.5份、余量為水，瓊脂加入量為培養基的1.5％，PH7.2。制備斜面培養的方法同其它菌的斜面培養基。制成的斜面培養基接種，放入35℃培養箱中培養24小時。
(2)三角瓶中，一級培養罐種、二級培養罐種、生產培養罐種。
⑩培養基的組分和配比除了不加瓊脂外其它同斜面種。
從三角瓶到生產種培養罐(1500升)，均采用逐級擴大。
培養溫度為30℃，培養24小時。
生產培養罐培養好的菌，排出生產培養罐后用麥麩吸附，培養液和麥麩的比例為1∶3.0。
將培養液和麥麩拌均后，在35℃條件下烘干備用。
處理有機固體廢物的復合菌劑已應用于秸稈的處理、垃圾堆肥處理。100Kg秸稈用0.2～0.3Kg菌劑對秸稈進行預處理，秸稈堆漚4～6天后作為沼氣的原料，提高了產氣量，加快了秸稈產沼氣。該菌劑用于城市有機垃圾的堆肥處理，加快了垃圾堆肥腐熟快，堆肥時間縮短到12～15天。
權利要求
1.一種用于處理有機固體廢物的復合菌劑，其特征在于由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的登記入冊編號為CGMCC NO.1364的高溫單胞菌(Thermomonospora)，登記入冊編號為CGMCC NO.1365的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，登記入冊編號為CGMCC NO.1366的木霉菌(Trichoderma)和中國普通微生物菌種保藏管理中心1997年版的菌種目錄中公開的菌種編號為1.813的地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)混配而成，所述各組份的重量比為高溫單胞菌∶枯草芽孢桿菌∶木霉菌∶地衣芽孢桿菌＝9～13∶2～4∶3～4∶2～3。
2.一種根據權利要求1所述的用于處理有機固體廢物的復合菌劑的制備方法，其特征在于首先將高溫單胞菌CGMCC1364、枯草芽孢桿菌CGMCC1365、木霉菌CGMCC 1366，分別進行單獨培養，生成的菌體經烘干后與記載在菌種目錄中并公開使用的地衣芽孢桿CGMCC 1.813干品混勻，即得復合菌劑；所述各組份的重量比為高溫單胞菌∶枯草芽孢桿菌∶木霉菌∶地衣芽孢桿菌＝9～13∶2～4∶3～4∶2～3；所述各菌的單獨培養操作步驟如下(1)高溫單胞菌CGMCC1364的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得高溫單胞菌，再回接到經滅菌的培養基上，從斜面培養到培養罐中培養，采用逐級擴大培養法，培養溫度45～60℃下，經生產種培養罐培養24～48小時后得到培養液，與滅過菌的固體培養基混合，培養液∶固體培養基＝1∶3.5～4.0，混合后置入曲池通風培養84～100小時，培養溫度為45℃～55℃，長成高溫單胞菌體后，于55～60℃下烘干備用；所述培養罐中的培養基各組份的重量比為可溶性淀粉0.5～2.5份、KNO30.1～0.2份、MgSO4·7H2O 0.03～0.08份、NaCl 0.3～0.6份、K2HPO40.05～0.1份、FeSO40.0005～0.001份、酵母膏0.1～0.2份；所述固體培養基各組分的重量比為麥麩80～85份，秸稈粉14～19份，尿素0.5～1份；(2)枯草芽孢桿菌CGMCC1365的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得枯草芽孢桿菌，再回接到經滅菌的培養基上，從斜面培養到培養罐的培養，采用逐級擴大培養法，經生產種培養罐培養，培養溫度為45℃～55℃，培養18～24小時后，得到液體培養液，用麥麩吸附，培養液∶麥麩＝1∶2.5～3.0，于55～60℃下烘干備用；培養罐的培養基采用牛肉育0.2～0.3份，蛋白胨0.5～1.0份，蔗糖0.3～0.6份，NaCl 0.2～0.5份；(3)木霉菌CGMCC 1366的制備將從堆肥中采集的樣品，經分離純化，純化后獲得木霉菌，，再回接到經滅菌的PDA培養基上，從斜面培養到培養罐的培養，采用逐級擴大培養法，斜面種采用PDA培養基；從三角瓶種到曲池培養均采用固體培養基，三角瓶和曲盤用的固體培養基各組分重量比為麥麩90～93份，秸稈粉4.5～6.0份，玉米粉2～3份，(NH4)2SO40.5～1.0份；固體培養基的含水率為55～70％，曲池種的培養基各組分重量比為麥麩85～90份，秸桿粉7～12份，玉米粉2.5～4.0份，尿素0.5～1.0份，培養溫度為26℃～34℃，在35～38℃下烘干，從接種到長孢子培養72～145小時；(4)地衣芽孢桿菌CGMCC1.813的制備地衣芽孢桿菌的制備方法與步驟(2)所述枯草芽孢桿菌的制備方法基本相同，其中培養溫度為30℃～35℃，培養18～24小時。
全文摘要
一種用于處理有機固體廢物的復合菌劑及其制備方法，由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的編號為CGMCC NO.1364的高溫單胞菌，編號為CGMCC NO.1365的枯草芽孢桿菌，編號為CGMCCNO.1366的木霉菌和CGMCC的菌種目錄中公開的菌種編號為1.813的地衣芽孢桿菌混配而成，該復合菌劑從根本上解決了現有技術中存在的混配菌群不能發揮各自優勢的缺陷，其單獨培養而混合在一起的菌群匹配合理，適用范圍廣，能充分地發揮各菌群自身的生物特性和相互協調的作用功效，顯著縮短處理有機固體廢物時間，提高原料利用率和處理效果及其生成物產量和質量，人工培養過程中的菌種穩定，制備方法簡便、菌群生長速度快，有利于對有機固體廢物的治理，無任何環境污染。
文檔編號C12R1/885GK1888045SQ20051007779
公開日2007年1月3日 申請日期2005年6月27日 優先權日2005年6月27日
發明者劉曉風, 顏開, 廖銀章, 張海濤, 袁月祥, 顏麗, 劉克鑫 申請人:北京合百意生態能源科技開發有限公司, 中國科學院成都生物研究所