專利名稱：一種復合菌劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于農業微生物技術領域，涉及一種復合菌劑及其應用。
背景技術：
秸稈類生物質是纖維素組分含量很高的農作物殘留物，包括玉米、水稻、麥、棉花 等的秸稈。秸稈作為一種天然纖維素，可被生物降解利用，能夠適應符合環境要求的產品的 開發。它的化學成分主要含纖維素、半纖維素和木質素。幾十年來人們在纖維素以及相關 酶的理論研究和實踐應用方面均取得了較大進步，但迄今尚無一種微生物或一套酶系按傳 統方法用于大規模降解纖維素，并取得顯著經濟效益，目前其利用率僅有左右，限制其 利用的主要原因是生物轉化的成本高和降解酶的催化效率低。農林廢棄物這種纖維素資源 的轉化利用研究將在為人類解決能源、糧食和環境污染等問題中起著巨大的作用，也是我 國可持續發展戰略的一項重要內容。我國有十分豐富的農林廢棄物資源，每年僅農業生產中形成的農作物殘渣(稻 草、秸稈等)就約有7億噸，其中除很小的一部分被直接還原至自然界和用作動物飼料外， 絕大部分都被焚燒掉，不但污染環境，又造成資源的巨大浪費。因此，如何科學、合理地開發 利用這一資源，成為全世界重要的研究課題之一。更高效的利用秸稈，對緩解人類的糧食和 能源危機，加速我國天然資源再生利用的發展和緩解三農問題具有重大意義，同時在環境 污染的防治和良性生態系統的建立上也會發揮重要作用，其社會效益非常顯著。據統計，我 國目前的秸稈利用率為33 %，但經過一定技術處理后利用的僅占2. 6 %，其余大部分只是 作為燃料等直接利用，開發前景非常廣闊。經技術處理后利用普遍存在成本過高，利用率低 等問題。發達的畜牧業是現代農業的標志，乳制品占畜產品的比重是衡量畜牧業發達與否 的重要指標。近年來我國奶牛業發展保持了旺盛的增長勢頭，截止2004年，我國奶牛飼養 量已經達到1000萬頭。規?；B殖業在為發展農村經濟，提高城鄉居民生活水平做出巨大 貢獻的同時，隨著糞污相對集中排放，也帶來系列的環境問題。由于技術和經濟的原因，我 國有相當數量的奶牛養殖場糞污沒有得到有效處理，糞污處理問題已經嚴重影響了自身的 持續發展，糞污綜合治理迫在眉睫。由于沼氣技術(厭氧消化)在實現奶牛糞污資源化循 環利用、改善農村能源、環境、衛生條件和有利于溫室氣體減排方面的獨特作用，日益受到 世界各國政府的重視，諸多因素將使沼氣技術有更好的發展空間。據統計每頭奶牛日產鮮牛糞約30公斤，牛尿和沖洗廢水150公斤，奶牛糞便已成 為我國農村環境主要污染源之一。沼氣發酵是奶牛糞便最有應用前景的處理工藝之一，在 使奶牛糞便無害化的同時，產生的沼液沼渣可作為有機肥料，沼氣可作為能源。但是由于奶 牛糞便有機質濃度高，作為原料進行沼氣發酵時，普遍存在調試啟動慢，運行過程不穩定， 易出現酸化和不產氣或產氣率低等問題，這已經在很大程度上制約了沼氣發酵在奶牛糞便 處理中的應用。專利號為CN 1888073A(200510077792. 3)公開了一種復合菌劑預處理秸稈的沼氣發酵方法，復合菌劑為高溫單胞菌、枯草芽孢桿菌、木酶菌和地衣芽孢桿菌，向潮濕后的 秸稈加入復合菌劑和作為秸稈堆慪的氮源碳氫銨并補加水，用塑料布覆蓋堆慪，然后將堆 慪好的秸稈投入沼氣池，同時加入碳酸氫銨和甲烷的接種物，密閉2-7天，即產沼氣。預處 理后的秸稈發酵速度和產氣速度快，初始產氣時間縮短，產氣率提高30%左右，能使所有的 玉米秸稈、稻草、麥稈等農作物秸稈作為沼氣發酵的原料，適用范圍廣。該方法的局限性在 于預處理時方法復雜，復合菌劑只能在預處理秸稈時使用，不能直接促進沼氣產生，限制了 其推廣。目前國內利用復合菌劑處理牛糞的專利較少，專利CN 1332795公開了一種能降 解動物排泄物的稱作JSB98. 0的混合微生物群，由谷氨酸桿菌H0777，克氏微球菌H0778，脫 氮副球菌H0779，谷氨酸桿菌H0780以及蕈狀芽孢桿菌H0781五個活性菌株組成。需要將該 微生物群在15°C以分批方式加入到微生物培養系統中，并以半連續方式或連續方式加入含 排泄物的水性基質，其方式限制了微生物菌劑處理動物排泄物的能力且降解能力不高，限 制了該方法的推廣。南京加德綠色能源研發有限公司擁有一項選擇特定功能微生物降解目標物質的 “計算機輔助菌禾中選擇技術(Computer-Assisted Strain Construction and Development Engineering :CASCADE)，它可將微生物新陳代謝途徑中遺傳與化學信息相關聯，應用基于 計算機知識模式搜索的篩選思路，對符合降解目標的特定微生物的代謝能力進行評定，從 中選擇最優的微生物菌種，最大化產生所期望的目標產物。本發明所提供的復合菌劑即通 過應用該技術后得到的。

發明內容
本發明的目的是為了克服現有技術秸稈和牛糞發酵產氣量的不足，提供一種復合 菌劑。本發明的另一目的是提供該復合菌劑在處理秸稈和/或牛糞發酵產甲烷中的應用。一種復合微生物菌劑，該復合微生物菌劑主要由大腸桿菌(Escherichia, coli) 發酵液，木霉(Trichoderma virens)發酵液,熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens) 發酵液和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發酵液組成，4種發酵液中的有效活菌數分 別都在10億個/毫升以上。所述的復合微生物菌劑配比如下大腸桿菌發酵液1 12重量份，木霉發酵液 2 12重量份，熒光假單胞菌發酵液1 15重量份，枯草芽孢桿菌發酵液4 15重量份， 4種發酵液中的有效活菌數分別都在10億個/毫升以上；優選大腸桿菌發酵液1 3重量 份，木霉發酵液2 3重量份，熒光假單胞菌發酵液1 4重量份，枯草芽孢桿菌發酵液4 6重量份；4種發酵液中的有效活菌數分別都在10億個/毫升以上。本發明所述的復合微生物菌劑在處理秸稈和/或牛糞產沼氣中的應用。其中，將所述復合微生物菌群與加入產甲烷接種物的秸稈和/或牛糞接觸，促進 秸稈和/或牛糞降解產生沼氣。所述的產甲烷接種物選自糞坑沉渣、沼氣池底沼渣、黑色陰溝污泥或垃圾填埋場 污泥至少1種或多種。
所述的秸稈和/或牛糞需補充水份，將含水率調整到91 % -97 %，進行濕式厭氧發
酵產沼氣。應用方法一本發明復合微生物菌劑應用于以作物秸稈為原料的厭氧發酵，具體步驟如下1、選用占沼氣池容積20-40% (Kg/L)的無有毒物質污染的作物秸稈如稻草、玉米 桿、麥草等用人工或者機械方法鍘短，長度在3cm以下。2、將破碎后的秸稈按料水重量比1 1 3加水潤濕，成分攪拌后過夜使秸稈溶脹。3、將溶脹后的秸稈加入秸稈原料質量0. 5 5%的生石灰(氧化鈣)，混合均勻后 進行堆慪，堆慪溫度保持在40 60°C，維持時間為4 8天。4、將堆慪好的秸稈投入沼氣池中，加水調配成含水率91% -97%左右的混合物， 加入干重占秸稈和水混合物質量10-20% (g/g)的產甲烷接種物，調節pH至7. 4-7. 8。5、最后，按秸稈和水混合物質量5-10% (g/g)的量加入本發明復合菌劑，攪拌均
勾？封蓋。應用方法二 1.取質量占沼氣池容積30-60% (Kg/L)新鮮牛糞，加水調配成含水率91 % -97% 左右的混合物，加入沼氣池中。2.加入干重占牛糞與水混合物質量5-10% (g/g)的產甲烷接種物，調節pH至 6. 8-7. 4。3.按占牛糞與水混合物質量1 10% (g/g)的接種量加入本發明復合菌劑。4. 35°C左右厭氧發酵，封蓋并定時攪拌。本發明與現有技術相比的有益效果1.本發明復合菌劑應用于秸稈和牛糞發酵產沼氣具有速效、長效、成本低、使用方 法簡單、易于普及等優點，受到用戶的歡迎。2.加入本發明復合菌劑的秸稈產氣效果良好，在中溫35°C左右加入復合菌劑后， 秸稈的產氣速率大大提高，并且秸稈的產氣量較不加菌提高50-150%。加入本發明復合菌 劑的牛糞發酵產氣效果良好，在中溫35°C左右加入復合菌劑后，發酵物的產氣速率大大提 高，并且產氣量較不加菌提高200-400%。3.采用本發明復合菌劑，發酵罐采用連續運行的方式，可保證發酵罐產氣長期使 用，并且復合菌劑促進沼氣生產的作用不出現明顯的衰減。4.利用本發明復合菌劑處理秸稈，厭氧發酵后較不加菌含固量減量提高30%左
右o5.本發明復合菌劑中各微生物起協同作用，能夠與秸稈和牛糞中的微生物菌群協 同配合，促進秸稈和牛糞中產甲烷菌的生長，不會出現菌種間相互抑制現象。
具體實施例方式實施例1微生物發酵液的制備本實施例僅以大腸桿菌(ATCC10795)，木霉(ATCC10045)，熒光假單胞菌 (ATCC11150)，枯草芽孢桿菌(ATCC10774)為例對發明的具體內容做詳細描述，并不限制本發明復合微生物菌劑中四種微生物來源的選擇。(1)將以上4種微生物分別活化至保藏用斜面培養基，25_37°C培養24-48小時。4 種微生物的斜面培養及組成為大腸桿菌、熒光假單胞菌斜面培養基采用LB培養基，液體培養基組成為蛋白胨 10克，酵母膏5克，氯化鈉10克，自來水1000毫升，瓊脂15克，pH = 7. 2 ；木霉菌種斜面培養基采用PDA培養基，培養基組成為馬鈴薯汁lOOOmL，葡萄糖20 克，瓊脂20克，pH = 7.0 ；枯草芽孢桿菌斜面培養基采用LB培養基，液體培養基組成為蛋白胨10克，酵母 膏5克，氯化鈉10克，自來水1000毫升，瓊脂15克，pH = 7. 0 ；(2)分別將活化好的菌種接種到各自的液體培養基，23_37°C，轉速為160轉/分， 連續培養25-37小時，得搖瓶培養液。四種微生物的搖瓶及發酵罐培養基配方如下大腸桿菌蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化鈉10克，自來水1000毫升，pH = 7. 2 ；木霉菌馬鈴薯汁1000毫升，葡萄糖20克，pH = 7. 0 ；熒光假單胞菌蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化鈉10克，自來水1000毫升，pH = 7. 2 ；枯草芽孢桿菌蛋白胨10克，酵母膏5克，氯化鈉10克，自來水1000毫升，pH = 7. 0 ；(3)種子罐100升，裝料量80升，分別按上述4種微生物液體培養基配方投料， 然后121°c滅菌20分鐘，冷卻后分別加入0.8升上述培養至對數期的種子液。培養溫度 28-37°C，攪拌轉速120轉/分，通氣量1 1. 2 (與發酵液體積比)，培養25-37小時至對數 期，得發酵種子液。(4)生產發酵罐1000升，裝料量800升，生產罐培養基配方同種子罐培養基，然后 121°C滅菌20分鐘，冷卻后分別加入8升上述發酵種子液。培養溫度28-37°C，攪拌轉速120 轉/分，通氣量1 1. 2 (與發酵液體積比)，培養25-37小時至對數期，分別得上述四種微 生物的發酵液。通過檢測，以上4種發酵液中的有效活菌數分別都在10億個/毫升以上。實施例2 利用復合微生物菌劑處理牛糞厭氧發酵產沼氣(1)實施例1制備的四種微生物發酵液按如下重量份混合均勻成為復合微生物菌 劑大腸桿菌液1份，木霉菌液2份，熒光假單胞菌液2份，枯草芽孢桿菌4份。(2)取奶牛場的新鮮牛糞600千克，加水調配成含水率95%左右的混合物，按照質 量等分成兩份分別加入兩個相同的發酵罐(容積為1000升)中。(3)加入干重占牛糞與水混合物質量10% (g/g)的產甲烷接種物(選自糞坑沉 渣)，調節pH至6. 8-7.2。(4)在其中一個厭氧發酵罐中按牛糞和水混合物質量的5% (g/g)的接種量加入 (1)制備的復合菌劑，另一個作空白對照加入等量的水。攪拌均勻，封蓋，保持35°C中溫厭 氧發酵。定時攪拌，防腐型氣體流量計記錄氣體產量。2個厭氧發酵罐產氣情況如表1所
7J\ o表1牛糞厭氧發酵對照
實施例3 利用復合微生物菌劑處理秸稈厭氧發酵產沼氣(1)實施例1制備的四種微生物發酵液按如下重量份混合均勻成為復合微生物菌 劑大腸桿菌液2份，木霉菌液2份，熒光假單胞菌液2份，枯草芽孢桿菌5份。(2)選用無有毒物質污染的稻草秸稈400kg，用人工或者機械方法鍘短，長度在 3cm以下。(3)在鍘碎的秸稈中加入相當于秸稈質量2倍的水潤濕，充分攪拌后過夜使秸稈 溶脹。(4)將溶脹后的秸稈加入秸稈原料質量的生石灰(氧化鈣)，混合均勻后進行 堆慪，堆慪溫度保持在50°C，維持時間為6天。(5)將堆慪好的秸稈按照質量等分為兩份，分別投入兩個相同的發酵罐(容積為 1000升)中，加水調配成含水率93%左右的混合物，分別加入干重占秸稈和水混合物質量 10% (g/g)的產甲烷接種物(選自黑色陰溝污泥)，調節pH至7. 4-7. 8。(6)在其中一個厭氧發酵罐中按占秸稈和水混合物質量10% (g/g)的接種量加入 (1)制備的復合菌劑，另一個作空白對照加入等量的水。攪拌均勻，封蓋。35°C厭氧發酵，并 定時攪拌，防腐型氣體流量計紀錄氣體產量。兩個厭氧發酵罐的產氣情況如表2所示表2.秸稈厭氧發酵對照 實施例4 利用復合微生物菌劑處理牛糞和秸稈混合物厭氧發酵產沼氣(1)實施例1制備的四種微生物發酵液按如下重量份混合均勻成為復合微生物菌 劑大腸桿菌液3份，木霉菌液3份，熒光假單胞菌液1份，枯草芽孢桿菌4份。(2)分別選用無有毒物質污染的稻草秸稈200kg，用人工或者機械方法鍘短，長度 在3cm以下。(3)在鍘碎的秸稈中加入相當于秸稈質量2倍的水潤濕，充分攪拌后過夜使秸稈 溶脹。(4)將溶脹后的秸稈加入秸稈原料質量1 %的生石灰(氧化鈣)，混合均勻后進行 堆慪，堆慪溫度保持在50°C，維持時間為6天。(5)將堆慪好的秸稈按照質量等分成兩份分別投入兩個相同的發酵罐(容積為 1000升)中，再分別向每個發酵罐中加入取自奶牛場的新鮮牛糞400千克。加水調配秸稈和牛糞混合物成含水率94%左右，分別加入干重占秸稈、牛糞和水混合物質量10% (g/g) 的產甲烷接種物(選自沼氣池底沼渣)，調節PH至7. 2-7. 4。(6)在其中一個厭氧發酵罐中按秸稈、牛糞和水混合物質量10% (g/g)的接種量 加入(1)制備的復合菌劑，另一個作空白對照加入等量的水。攪拌均勻，封蓋。35°C厭氧發 酵，并定時攪拌，防腐型氣體流量計紀錄氣體產量。兩個厭氧發酵罐的產氣情況如表3所 示表3.秸稈牛糞厭氧混合物發酵對照 實施例5實施例1制備的四種微生物發酵液按如下重量份混合均勻成為復合微生物菌劑 大腸桿菌液7份，木霉菌液8份，熒光假單胞菌液4份，枯草芽孢桿菌6份。按照實施例3的方法利用本實施例制備的復合微生物菌劑處理秸稈產沼氣，產氣 情況如表4 表4秸稈厭氧發酵對照 實施例6實施例1制備的四種微生物發酵液按如下重量份混合均勻成為復合微生物菌劑 大腸桿菌液10份，木霉菌液12份，熒光假單胞菌液8份，枯草芽孢桿菌15份。按照實施例2的方法利用本實施例制備的復合微生物菌劑處理奶牛糞產沼氣，產 氣情況如表5 表5牛糞厭氧發酵對照 實施例7實施例1制備的四種微生物發酵液按如下重量份混合均勻成為復合微生物菌劑大腸桿菌液12份，木霉菌液5份，熒光假單胞菌液15份，枯草芽孢桿菌13份。按照實施例3的方法利用本實施例制備的復合微生物菌劑處理秸稈產沼氣，產氣 情況如表6 表6秸稈厭氧發酵對照
權利要求
一種復合微生物菌劑，其特征在于該復合微生物菌劑主要由大腸桿菌(Escherichia.coli)發酵液，木霉(Trichoderma virens)發酵液，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)發酵液和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發酵液組成，4種發酵液中的有效活菌數分別都在10億個/毫升以上。
2.根據權利要求1所述的復合微生物菌劑，其特征在于所述的復合微生物菌劑中4種 菌的發酵液配比如下大腸桿菌發酵液1 12重量份，木霉發酵液2 12重量份，熒光假 單胞菌發酵液1 15重量份，枯草芽孢桿菌發酵液4 15重量份；4種發酵液中的有效活 菌數分別都在10億個/毫升以上。
3.根據權利要求2所述的復合微生物菌劑，其特征在于所述的復合微生物菌劑中4種 菌的發酵液配比如下大腸桿菌發酵液1 3重量份，木霉發酵液2 3重量份，熒光假單 胞菌發酵液1 4重量份，枯草芽孢桿菌發酵液4 6重量份；4種發酵液中的有效活菌數 分別都在10億個/毫升以上。
4.權利要求1所述的復合微生物菌劑在處理秸稈和/或牛糞產沼氣中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于將所述復合微生物菌劑與加入產甲烷接種 物的秸稈和/或牛糞接觸，促進秸稈和/或牛糞降解產生沼氣。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述的產甲烷接種物選自糞坑沉渣、沼氣 池底沼渣、黑色陰溝污泥或垃圾填埋場污泥至少1種。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于所述的秸稈和/或牛糞需補充水份將含水 率調整到91% -97%，進行濕式厭氧發酵產沼氣。
全文摘要
本發明屬于農業微生物技術領域，公開了一種復合菌劑及其應用。它是由大腸桿菌(Escherichia.coli)發酵液1～3份，木霉(Trichoderma virens)發酵液2～3份，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)發酵液1～4份，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)發酵液4～6份混合而成。本發明提供的復合微生物菌劑不僅可以提高秸稈和牛糞的沼氣產量，提高產氣速率，而且可以進一步將固廢含量降低30％。本方法具有速效、成本低、使用方法簡單、易于普及等優點，可以推廣使用。
文檔編號C12N1/20GK101864363SQ20101017831
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月19日 優先權日2010年5月19日
發明者周楚新, 孫珊, 支銀芳 申請人:南京加德綠色能源研發有限公司