專利名稱：：應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法
技術領域：
：本發明主要涉及預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，尤其涉及應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法。
背景技術：
：國外曾報道應用早熟染色體凝集技術來研究細胞在接受射線照射后染色體損傷狀況，這是一種快速而精確的研究方法。但是這種方法僅僅應用于研究輻射誘導的染色體損傷，沒有明確提出染色體損傷和細胞輻射敏感性之間的必然關系，而且，沒有早熟染色體誘導效率的相關報道。癌癥是致死率很高的疾病之一。放射生物學家都把研發一種能夠預測腫瘤放射效應的方法作為主要目標。精確的腫瘤放射效應的預測分析方法不僅可以為癌癥的治療提供理論依據，而且能夠給臨床醫生選擇診療方案提供極大的幫助。克隆形成法是一種常用的研究腫瘤放射效應的方法之一(Girin勿T，B咖heimA,Lubin民etal.InternationalJournalofRadiationOncologyBiologyPhysics,1994,30:789;WestCM,DavidsonSE，RobertsSA,etal.BritishJournalofCancer,1997,76:1184;CocoMartin,JM,MoorenE,OttenheimC，etal"InternationalJournalofRadiation,Biology,1999,75:1161;KawataT,ItoH，GeorgeK，改al.RadiationResearch,2003,159:597)，但是作為一種常規的方法，它至少需要14—21天的時間才能形成克隆，對于臨床診斷和治療就不太可行。應用早熟染色體凝集技術來研究腫瘤的輻射效應，從細胞處理到結果統計僅需要2天時間。自從Johnson等(JohnsonRTandRaoPN.Nature,1970,226:717)，Hittelman等(Hi他lman■andRaoPN.MutationResearch,1974，23:251)，Comforth等(CornforthMNandBedfordJS.Science,1983，222:1141)應用早熟染色體凝集(prematurechromosomecondensationPCC)技術研究放射誘導的染色體損傷以來，PCC技術已經成為一種研究輻射誘導各細胞周期時相染色體原初損傷的成熟的方法，尤其在G2期，這一技術效果更佳。G,和G2是細胞周期的兩個階段，G,是和程前間期，G2是分裂前間期。研究資料報道了不同種類的細胞系經不同種類的射線如X射線、Y射線以及重離子束照射后表現出了線性劑量依賴關系。但大多的研究側重于對細胞G2期的研究，對于G,期以及Gt期和G2期相關性的研究報道很少。
發明內容本發明的目的在于避免現有技術的不足之處而提供一種應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法。利用早熟染色體凝集預測研究了Y射線對肝癌細胞SMMC-7721的輻射效應，結果表明G,和G2期細胞內的染色單體和等點染色單體斷裂數與照射劑量之間存在著線性相關性，染色單體斷裂總數與細胞存活率之間存在良好的線性相關性。說明輻射誘導的染色單體斷裂可以作為預測SMMC-7721細胞內在輻射敏感性的指標，也可為臨床診斷和治療肝癌提供依據。本發明的目的可以通過采用以下技術方案來實現一種應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其主要特點包括有如下步驟(1)培養細胞，待其處于對數生長期時開始操作；(2)在照射前5分鐘加入45—55nmol/L早熟染色體凝集誘導劑蛋白絲氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑CalyculinA;(3)分別按照不同劑量對細胞進行照射；(4)用克隆形成法測定照射后細胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各劑量照射點細胞，通過低滲、固定處理，滴片制作早熟染色體凝集染色體樣本；(6)計數染色體斷裂的結果，并和細胞存活分數進行擬合，從而得出染色體斷裂與細胞輻射敏感性之間的關系。所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法還包括有所述的早熟染色體凝集誘導劑CalyculinA的制備，將Calyculin-A溶于濃度大于99.99%的乙醇里制成lmM的儲存液；照射前將其加入需照射細胞的培養液內，終濃度為50nM。所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法還包括有所述的克隆形成法包括細胞培養、消化、細胞種植、形成克隆。所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法所述的染色體的制備，細胞經照射后在37°C，5%C02的恒溫培養箱內繼續培養30~120分鐘；收集細胞，75mMKCl低滲處理15"25分鐘，卡諾氏液固定，最后以少量固定液懸浮細胞，滴片，在熱蒸汽上烘干，溫度在85"90。C，2%-5%姬姆薩Giemsa染色。所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，包括有按照Savage(SavageJRK.JournalofMedicalGenetics,1975,13:103)報道的標準，每個劑量點不少于40個的G2期細胞染色體，并計算其染色單體和等點染色單體的斷裂數，同時，記錄在此過程中出現的G,期細胞，每個等點染色單體斷裂被計為兩個斷裂。這是因為一個等點染色體斷裂是指發生在兩條染色單體同一位置的兩個斷裂。本發明還包括有G,和G2期細胞內的染色單體和等點染色單體斷裂數與照射劑量之間的關系為Gi期細胞的數量遠小于G2期細胞的數量，兩者之間的比值介于12.5和20之間。由于改進了國外報道的技術方法，首次測定了化學誘導劑誘導細胞在經射線照射后發生早熟染色體凝集的誘導效率，即化學誘導劑CalyculinA花萼海綿素誘導的02早熟染色體凝集是G,早熟染色體凝集的5到8倍，即Gi期細胞的數量遠小于G2期細胞的數量，兩者之間的比值介于12.5和20之間。這樣就避免了檢測所有細胞周期時相早熟染色體凝集的工作量大、而且除G2期外其他時相早熟染色體凝集損傷不易分辨和計數的缺點，在以后的工作中，只要檢測G2早熟染色體凝集，就可以來判定受試細胞的輻射敏感性。所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，包括有染色單體斷裂總數與細胞存活率之間的關系為S=exp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和(3值分別為0.03和0.06。本發明的有益效果是，公開了一種應用于生物
技術領域：
的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法。本發明可以快速、精確地預測腫瘤細胞的輻射敏感性；耗時短，24小時之內可以給出結果；工作量小，只需要檢測40個G2期細胞內的染色體斷裂類型和數目就可以給出結果。本發明廣泛地應用到腫瘤臨床放射治療機構，用于放射治療計劃的制定。圖1為SMMC-7721細胞存活曲線；圖2為G,與G2期染色單體斷裂劑量效應關系；圖3為G2期細胞等點染色單體斷裂與照射劑量之間的關系；圖4為G2期染色單體斷裂數和等點染色單體斷裂數與細胞存活之間的關系。具體實施例方式以下結合附圖所示之最佳實施例作進一步詳述實施例l:一種應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，有如下步驟(1)培養細胞，待其處于對數生長期時開始操作；細胞培養人類肝癌細胞系SMMC-7721(購自CCTCC)用含有10%胎牛血清的RMPI-1640培養液在37aC，5%C02的恒溫培養箱內培養。(2)在照射前5分鐘加入50nmol/L早熟染色體凝集誘導劑蛋白絲氨酸維氨酸磷酸酶抑制劑CalyculinA;(2)分別按照不同劑量對細胞進行照射；細胞照射指數生長期的人類肝癌細胞SMMC-7721在蘭州醫學院第一附屬醫院6()0)源產生的Y射線(劑量率0.20^111111)進行照射。(4)用克隆形成法測定照射后細胞的存活率；克隆形成法包括細胞培養、消化、細胞種植、形成克隆等步驟。(5)胰酶消化，收集各劑量照射點細胞，通過低滲、固定處理，滴片制作早熟染色體凝集染色體樣本。(6)計數染色體斷裂的結果，并和細胞存活分數進行擬合，從而得出染色體斷裂與細胞輻射敏感性之間的關系。觀察每個劑量點不少于40個的G2期細胞染色體，并計算其染色單體和等點染色單體的斷裂數，同時，記錄在此過程中出現的G!期細胞,每個等點染色單體斷裂被計為兩個斷裂。實施例2:本發明早熟染色體凝集誘導劑CalyculinA的制備方法，將Calyculin-A溶于100%的乙醇里制成lmM的儲存液；照射前將其加入需照射細胞的培養液內，終濃度為50nM。實施例3:本發明染色體的制備方法，細胞經照射后在37'C，5n/oC02的恒溫培養箱內繼續培養30分鐘。收集細胞，75mM，KC1低滲處理20minutes,卡諾氏液固定，最后以少量固定液懸浮細胞，滴片，在熱蒸汽上烘干，溫度在85^9(TC，5。/。Giemsa姬姆薩染色。實施例4:包括有G，和G2期細胞內的染色單體和等點染色單體斷裂數與照射劑量之間的關系為G,期細胞的數量遠小于G2期細胞的數量，兩者之間的比值介于12.5和20之間。Calyculin-A是一種蛋白絲氨膨酪氨酸磷酸酶抑制劑，是一種有效的PCC誘導劑，它可以在細胞周期的各個時相誘導染色體凝集，尤其在G2期其誘導效率更高。Calyculin-A在50nM的濃度下可使混合細胞發生早熟染色體凝集，被凝集的染色體中，G,期細胞約占20W，80%左右為02期細胞，把這兩個時相細胞數的比例稱為PCC誘導效率。Calyculin-A誘導02期染色體凝集的效率是G,期的5—8倍，在各個劑量點，.當計數40個G2期細胞時，分別有5到8個G,期細胞進入計數范圍，說明在此實驗中PCC誘導效率是12.5%~20%，結果見表l。表1G,期與G2期早熟染色體凝集細胞數及比例<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>該結果顯示G,期細胞的數量遠小于G2期細胞的數量，兩者之間的比值介于12.5和20之間，通過重復實驗，我們發現了這一規律，因此，我們認為可以利用這一比值關系的確定性來只采用G2期PCC分析染色體斷裂的結果，從而避免了大量繁重的工作，這也是該方法最有價值之處。實施例5:包括有染色單體斷裂總數與細胞存活率之間的關系為SDcp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和p值分別為0.03和0.06。圖1為SMMC-7721經Y射線照射后的存活曲線。該曲線經線性平方擬合后結果良好，方程為S=exp(-0.03D-0.06D2)，R2=l，a和p值分別為0.03和0.06。|3值大于a值表明在細胞殺傷貢獻方面，高劑量輻射較好地克服了細胞修復即時效應，存活率以指數形式衰減，而不像低劑量輻射時以線性衰減為主。在G期和G2期，染色單體斷裂數的增加與細胞存活率的下降都具有良好的線性相關性。圖2顯示了G,期和G2期細胞染色單體斷裂數與照射劑量之間的關系。不論在G,期還是G2期，染色單體斷裂數與劑量呈線性增長關系。在同一劑量點，Gi期平均每細胞染色單體斷裂數要少于G2期，兩者之間的比值介于12.5和20之間。圖3為G2期細胞等點染色單體斷裂與照射劑量之間的關系。經線性回歸分析，其回歸方程為j^ftW+ft2c，/2=0.卯，說明兩者之間具有良好的線性相關。圖4為G2期染色單體斷裂數和等點染色單體斷裂數與細胞存活之間的關系。應用直線回歸分析，在G2期細胞中，染色單體斷裂數和等點染色單體斷裂數與細胞存活率之間具有比較好的相關性。盡管個別數據點小幅偏離擬合曲線，但斷裂數隨著細胞存活率下降而增長的趨勢是明顯的。權利要求1.一種應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其特征包括有如下步驟(1)培養細胞，待其處于對數生長期時開始操作；(2)在照射前5分鐘加入45-55nmol/L早熟染色體凝集誘導劑蛋白絲氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑CalyculinA；(3)分別按照不同劑量對細胞進行照射；(4)用克隆形成法測定照射后細胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各劑量照射點細胞，通過低滲、固定處理，滴片制作早熟染色體凝集染色體樣本；(6)計數染色體斷裂的結果，并和細胞存活分數進行擬合，從而得出染色體斷裂與細胞輻射敏感性之間的關系。2.如權利要求1所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其特征還包括有所述的早熟染色體凝集誘導劑CalyculinA的制備，將Calyculin-A溶于濃度大于99.99n/。的乙醇里制成lmM的儲存液；照射前將其加入需照射細胞的培養液內，終濃度為50nM。3.如權利要求1所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其特征還包括有所述的克隆形成法包括細胞培養、消化、細胞種植、形成克隆。4.如權利要求1所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其特征包括有所述的染色體的制備，細胞經照射后在36—37.5°C，4.5—5.5n/oC02的恒溫培養箱內繼續培養3O"120分鐘；收集細胞，75mMKCl低滲處理15—25分鐘，卡諾氏液固定，最后以少量固定液懸浮細胞，滴片，在熱蒸汽上烘干，溫度在85—9(TC，2%-5%姬姆薩染色。5.如權利要求1所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其特征包括有觀察每個劑量點不少于40個的G2期細胞染色體，并計算其染色單體和等點染色單體的斷裂數，同時，記錄在此過程中出現的G;期細胞，每個等點染色單體斷裂被計為兩個斷裂。6.如權利要求5所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其特征包括有G,和G2期細胞內的染色單體和等點染色單體斷裂數與照射劑量之間的關系為G,期細胞的數量遠小于G2期細胞的數量，兩者之間的比值介于12.5和20之間。7.如權利要求1所述的應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其特征包括有染色單體斷裂總數與細胞存活率之間的關系為:S=exp(-0.03D-0.06D2)，其中R2=l，a和p值分別為0.03和0.06。全文摘要本發明主要涉及預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，尤其涉及應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法。一種應用早熟染色體凝集預測腫瘤細胞輻射敏感性的方法，其主要特點包括有如下步驟(1)培養細胞，待其處于對數生長期時開始操作；(2)在照射前5分鐘加入早熟染色體凝集誘導劑蛋白絲氨酸/酪氨酸磷酸酶抑制劑CalyculinA；(3)分別按照不同劑量對細胞進行照射；(4)用克隆形成法測定照射后細胞的存活率；(5)胰酶消化，收集各劑量照射點細胞，通過低滲、固定處理，滴片制作早熟染色體凝集染色體樣本；(6)計數染色體斷裂的結果，并和細胞存活分數進行擬合，從而得出染色體斷裂與細胞輻射敏感性之間的關系。本發明可以快速、精確地預測腫瘤細胞的輻射敏感性；耗時短，24小時之內可以給出結果；工作量小，只需要檢測40個G₂期細胞內的染色體斷裂類型和數目就可以給出結果。文檔編號C12Q1/02GK101126719SQ20061010503公開日2008年2月20日申請日期2006年8月15日優先權日2006年8月15日發明者李文建,楊建設申請人:中國科學院近代物理研究所