專利名稱：酵母和l-乳酸的制造方法
技術領域：
本發明涉及L-乳酸的制造方法。另外本發明還涉及導入了編碼L-乳酸脫氫酶的基因的酵母。本發明還涉及包括對導入了編碼L-乳酸脫氫酶的基因的酵母進行培養的L-乳酸的制造方法。

背景技術：
最近，對資源有效活用，資源使用后再利用引起社會的注目，特別是聚焦在以植物為原料的聚合物。其中聚乳酸作為植物原料的聚合物具有的優越性質正在變得明朗起來。
作為聚乳酸的原料乳酸在現有技術中一直是通過培養總稱之乳酸菌的微生物制造的。乳酸菌以乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬(Lactococcus)為代表。這些乳酸菌雖然在由糖生產乳酸的收率有優勢，但對酸的耐性低，由于作為酸性物質的乳酸大量蓄積，必須一邊用碳酸鈣或氫氧化銨、或氫氧化鈉等堿中和，一邊進行培養。
然而，如果使用該手段，由于要通過用堿的中和操作，生成乳酸鈉或乳酸鈣等乳酸鹽，所以在后面的純化步驟中需要將乳酸鹽回復為乳酸的操作，這樣的處理使得成本提高。
其中有以降低中和成本為目的嘗試用耐酸的酵母生產乳酸的報道(參照專利文獻1～5、非專利文獻1～3)。由于酵母本來不具備生產乳酸的能力，為了通過酵母生產乳酸，必須要利用基因重組技術將編碼使丙酮酸轉換為L-乳酸的L-乳酸脫氫酶的基因(以下有時略記為L-ldh基因)導入酵母中。
導入酵母的L-ldh基因到現在為止據報道已研究了來自牛的L-ldh基因(參照專利文獻3、專利文獻5和非專利文獻1～3)，比來自乳酸菌的L-ldh基因更合適。來自牛的L-ldh基因，L-乳酸的對等收率低，需要進一步使對糖收率提高(參照非專利文獻3)。另外也進行了通過使酵母具有的基因突變使L-乳酸的生產效率提高的嘗試。然而，如果使酵母具有的基因突變，則存在著發酵時間變長，糖的消費速度低下等不好的狀況(參照專利文獻3、專利文獻6)。
如上所述，使用酵母制造L-乳酸是有用的方法。但希望進一步提高生產效率。
專利文獻1特開2001-204464號公報
專利文獻2特開2001-204468號公報
專利文獻3特表2001-516584號公報
專利文獻4特開2003-93060號公報
專利文獻5特開2003-259878號公報
專利文獻6特開2006-006271號公報
非專利文獻1Danilo Porro等人Biotechnol.Prog，11p294-298(1955)
非專利文獻2Danilo Porro等人Aplied and EnvironmentalMicrobiology，65(9)p4211-4211(1999)
非專利文獻3Satoshi Saitoh等人Appied and EnvironmentalMicrobiology，71(5)p2789-2792(2005)

發明內容
本發明是導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母。
本發明優選導入了編碼來自智人(Homo sapiens)或非洲爪蟾(Xenopus laevis)的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母。
另外，本發明優選 (1)酵母，其為導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，且為具有突變型PDR13基因的酵母，其中所述突變型PDR13基因包含野生型PDR13基因的DNA序列的一部分通過缺失、插入或替換而被突變的可翻譯成該基因編碼的蛋白質的一部分的DNA序列， (2)酵母，其為導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，且為具有突變型醇脫氫酶的、該突變型醇脫氫酶顯示通過改變培養溫度而使細胞內醇脫氫酶活性消失或降低的溫度感受性的酵母，其中所述突變型醇脫氫酶為包含野生型醇脫氫酶的氨基酸序列的一部分被替換、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突變型醇脫氫酶，或 (3)酵母，其為導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，且為編碼丙酮酸脫羧酶1的基因缺失、具有包含編碼野生型丙酮酸脫羧酶5的基因的堿基序列的一部分被缺失、插入、替換和/或添加的堿基序列的突變型丙酮酸脫羧酶5基因的酵母。
附圖的簡單說明

圖1是表示本發明中使用的L-ldh基因染色體導入用PCR片段制作方法的一例的概念圖。
圖2是表示作為本發明中使用的一例表達質粒-質粒pTRS11的構建圖。
圖3是表示作為本發明中使用的一例表達質粒-質粒pTRS57的構建圖。
符號說明 1導入目的位點上游側的同源序列(添加部分) 2共有序列 3酵母用選擇標志基因 4導入目的位點上游側的同源序列(添加部分) 5L-ldh基因的染色體導入用PCR片段 用于實施發明的最佳方案 本發明是導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母。
本發明中所謂的L-ldh基因指的是編碼具有將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和丙酮酸轉換為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和L-乳酸的活性的蛋白質的基因。作為本發明使用的編碼L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)，可以是來自人或蛙的基因，并沒有特別限定。作為來自人的，如來自智人(Homo sapiens)的L-ldh基因，作為來自蛙的，如來自屬于樹蛙科(Rhacophoridae)、赤蛙科(Ranidae)、雨蛙科(Hylidae)、姬蛙科(Microhylidae)、蟾蜍科(Bufonidae)、葦蛙科(Hyperoliidae)、鋤足蟾科(Pelobatinae)、盤舌蟾科(Discoglossidae)、負子蟾科(Pipidae)的蛙的L-ldh基因。作為來自蛙的L-ldh基因，其中優選使用來自屬于負子蟾科(Pipidae)的蛙的L-ldh基因，而在屬于負子蟾科的蛙中優選來自非洲爪蟾(Xenopus laevis)的L-ldh基因。
編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)中已知有ldhA基因、ldhB基因、ldhC基因這3種同工型，本發明中可以使用任一種，優選ldhA基因。
具體來說，本發明的編碼來自人的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)是具有序列編號1所示核酸序列的L-ldb基因。而本發明的編碼來自蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)優選具有序列編號2所示核酸序列的L-ldh基因。
本發明的編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)中還包含遺傳的多態性和由于誘發突變等產生的突變型的基因。本說明書中，所謂遺傳的多態性指的是由于基因上的自然突然突變，基因的堿基序列一部分變化的產物。而所謂誘發突變指的是通過人工方式對基因導入突變。誘發突變有例如使用位點特異的突變導入用試劑盒(Mutan-K(Takara Bio公司生產))的方法和使用隨機突變導入用試劑盒(BD多樣化PCR隨機誘變(CLONTECH公司生產))的方法等。另外，本發明中使用的來自人或蛙的L-ldh基因只要編碼具有將NADH和丙酮酸轉換為NAD+和L-乳酸的活性的蛋白質即可，即使堿基序列的一部分存在缺失或插入也沒關系。
本發明的導入編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母優選地是通過具有突變基因可以以高的對糖收率制造L-乳酸。
本發明的導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母優選地為具有突變型PDR13基因的酵母，其中所述突變型PDR13基因包含野生型PDR13基因的DNA序列的一部分通過缺失、插入或替換而被突變的、可翻譯成野生型PDR13基因編碼的蛋白質的一部分的DNA序列。
本發明的野生型PDR13基因的堿基序列優選包含序列編號64所示堿基序列的基因。本發明的酵母具有的突變型PDR13基因優選地為包含序列編號22所示堿基序列的基因。而由野生型PDR13基因或突變型PDR13基因編碼的蛋白質的一部分優選是包含序列編號23所示的氨基酸一級序列。
本發明的導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母優選可部分生產PDR13蛋白質的酵母。部分生產PDR13蛋白質的酵母具有在編碼PDR13蛋白質的基因中產生突變的突變型PDR13基因。作為突變，例如酵母的編碼PDR13蛋白質的染色體DNA的一部分缺損的突變，以及在蛋白質的氨基酸序列中1個以上的氨基酸被缺失或替換的突變等。
本發明中所謂編碼PDR13蛋白質的染色體DNA的一部分缺損，如在染色體DNA的堿基序列中，至少具有使C末端側的39個氨基酸殘基不翻譯的突變的突變DNA。所謂在PDR13蛋白質的氨基酸序列中至少C末端側的39個氨基酸缺失的突變指的是對于編碼PDR13蛋白質的染色體DNA，通過位點特異的突變導入法缺失可導入數的氨基酸的突變。
位點特異的突變的導入如使用位點特異的突變導入用試劑盒(Mutan-K(Takara Bio公司生產))的突變導入方法，本發明中突變導入方法并不限定于此。
本發明的導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母優選地為具有突變型醇脫氫酶，所述突變型醇脫氫酶包含野生型醇脫氫酶的氨基酸序列的一部分被替換、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列。
本發明的導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母優選地為野生型醇脫氫酶通過改變培養溫度而使細胞內的醇脫氫酶活性表現出消失或下降的溫度感受性的酵母。
本發明中所謂醇脫氫酶是具有將乙醛轉換為乙醇的活性的蛋白質。
作為編碼醇脫氫酶的基因，酵母有多個同源基因。本發明中，優選使用在生產中使用的在酵母細胞內具有最高醇脫氫酶活性的醇脫氫酶基因。
具體來說，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，作為登錄在酵母基因組數據庫(Saccharomyces Genome Database)的醇脫氫酶基因的同源基因，已知有ADH1、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7等。其中優選使用ADH1基因。
本發明的導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母優選編碼丙酮酸脫羧酶1的基因缺失、具有包含編碼野生型丙酮酸脫羧酶5的基因的堿基序列的一部分被缺失、插入、替換和/或添加的堿基序列的突變型丙酮酸脫羧酶5基因的酵母。
本發明的導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母優選地為使PDC1基因缺失的酵母。通過使PDC1基因缺失，與PDC1基因野生型的比較，丙酮酸脫羧酶活性降低。已知如果使PDC1基因、PDC5基因一起缺失，可以使丙酮酸脫羧酶活性進一步降低，但在含有葡萄糖的培養基中，生長變得極差。因此，本發明中優選通過在PDC5基因導入突變，可以使來自PDC5基因的丙酮酸脫羧酶活性適度降低，使得控制酵母向乙醇的代謝途徑成為可能。
具體來說，本發明的酵母優選酵母細胞內的丙酮酸脫羧酶的比活性降低到野生型酵母細胞內的比活性的3分之1以下。酵母細胞內的丙酮酸脫羧酶的比活性通過使PDC1基因缺失，有可能降低到野生型酵母的比活性的3分之1以下。酵母細胞內的丙酮酸脫羧酶的比活性可以通過下面的方法測定。
本發明中使用的酵母只要是可導入來自人或蛙的L-ldh基因的酵母即可，并沒有限制，如屬于酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)或克魯維酵母屬(Kluyveromyces)的酵母。優選釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具體來說優選NBRC10505株、NBRC10506株。
下面對本發明的酵母的制備法進行更具體的說明，本發明的酵母的制備法可通過各種各樣的方法實施。在此首先就酵母制備中使用的各種方法進行說明。
對于目的基因的克隆，如根據已知的基因情報，使用PCR(聚合酶鏈反應)法擴增取得必要的遺傳區域的方法，或由基因組文庫或cDNA文庫以同源性或酶活性作為指標進行克隆的方法等。另外，根據已知的蛋白質情報也可使用化學合成或基因工程合成的方法。
作為整合克隆的目的基因的質粒，可以使用在酵母中廣泛利用的質粒。在酵母中廣泛利用的質粒具有在酵母細胞內自主復制必需的序列、在大腸桿菌細胞內自主復制必需的序列、酵母選擇標志和大腸桿菌選擇標志。而用于使整合的目的基因表達的表達質粒希望具有調節目的基因的表達的操縱基因、啟動子、終止子或增強子等所謂的調節序列。所謂在酵母細胞內自主復制必需的序列，例如酵母的自主復制起點(ARS1)和著絲粒序列的組或酵母的2μm質粒的復制起點，所謂大腸桿菌內自主復制必需的序列是例如大腸桿菌的ColE1復制起點。
作為酵母選擇標志，如URA3、LEU2、TRP1、HIS3等營養缺陷型互補的基因或G418抗性基因或新霉素抗性基因等藥物抗性基因。作為大腸桿菌的選擇標志如氨芐青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等抗生素抗性基因。
作為調節序列，只要是可表達目的基因的序列即可，并沒有特別的限制，如已知在酵母高表達的編碼醇脫氫酶(ADH)、丙糖磷酸脫氫酶(TDH)、丙酮酸脫羧酶(PDC)、細胞色素C1(CYC1)等基因的啟動子和終止子區。但表達質粒不限于這些。
將上述質粒、表達質粒、線性化質粒、線性化表達質粒、PCR片段等DNA導入酵母的方法有轉化、轉導、轉染、共轉染和電穿孔等方法，具體來說，例如可通過使用乙酸鋰的方法(Journal of bacteriology、1983年、153卷、p163-168)和原生質體法(原島俊等人，Molecular Cell Biology、1984年、4卷、p771-778)等轉化方法進行。另外也可使用BIO101公司生產的ALKALI CATION YEAST TRANSFORMATION KIT等實施。其中，在本發明中優選利用乙酸鋰法的方法，但并不限定于此。
通過上述轉化方法得到的轉化酵母的培養方法可以運用例如(Methods In Yeast Genetics、1990年、M.D.Rose等人)等所述的公知的方法。選擇培養基只要是不含有對應于在質粒、表達質粒和PCR片段導入的指標中利用的標志基因的營養成分的最小培養基，可以是任一種培養基。在本發明中最好是以下組成的培養基使用無氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogen base without amino acids)(DIFCO公司生產)0.67％，葡萄糖2.0％，除去標志基因的營養成分的撤除成分混合物(dropout mixture)(前面Methods in Yeast Genetics)所述的培養基，不限定于此。
另外作為目的基因的缺失方法，可通過使用通常酵母中使用的營養缺陷型標志基因或使用藥物抗性基因等選擇標志的目的基因座的同源重組進行。例如，可以利用URA3、LEU2、TRP1、HIS3等營養缺陷型標志基因(Methods in Enzymology，101卷，p.202-211，G-418)或藥物抗性基因(Gene，1083年，26卷，p243-253)，不限定于此。
本發明的將來自人或蛙的L-ldh基因導入酵母的方法，例如克隆來自人或蛙的L-ldh基因，用整合了克隆有該基因的表達質粒轉化酵母的方法，通過同源重組將克隆的該基因插入到染色體上的目的部位的方法等，但不限定于此。
通過在上述表達質粒的啟動子下游導入來自人或蛙的L-ldh基因，獲得可表達該基因的質粒。利用后述的方法通過用得到的來自人或蛙的L-ldh基因表達質粒轉化酵母，可以將來自人或蛙的L-ldh基因導入酵母。
本發明的酵母優選編碼L-乳酸脫氫酶的基因以在染色體上的丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子下游可表達的狀態導入的酵母。
作為通過同源重組將來自人或蛙的L-ldh基因插入到染色體上的目的部位，優選插入到丙酮酸脫羧酶1基因(PDC1基因)的啟動子下游的方法，例如使用所設計的為了在來自人或蛙的L-ldh基因的上游和下游添加與導入目的部位同源的部分的引物進行PCR(聚合酶鏈反應)，通過后述的方法用得到的PCR片段轉化酵母的方法，但并不限定于該方法。另外，為了使轉化酵母的選擇容易進行，優選在上述PCR片段中含有酵母選擇標志。
這里使用的制備PCR片段的方法可以通過例如下面(1)～(3)的步驟1～3的程序進行。其梗概如圖1所示。
(1)步驟1以在來自人或蛙的L-ldh基因的下游連接了終止子的質粒作為模板，以引物1、引物2作為引物組，通過PCR對含有來自人或蛙的L-ldh基因和終止子的片段進行擴增。引物1按照能夠添加40bp以上的與導入目的部位的上游側同源的序列那樣設計，引物2以從終止子開始的來自于下游質粒的序列為基礎進行設計。添加在引物1的與導入目的部位的上游側同源的序列優選是與PDC1基因上游同源的序列。
(2)步驟2以具有酵母選擇標志的質粒例如pRS424、pRS426等作為模板，以引物3、引物4作為引物組，通過PCR對含有酵母選擇標志的片段進行擴增。引物3按照能夠添加30bp以上的與從步驟1的PCR片段的終止子開始的下游序列有同源性的序列那樣進行設計，至于引物4按照能夠添加40bp以上的與導入目的部位的下游側同源的序列那樣進行設計。添加在引物4的與導入目的部位下游側同源的序列最好是與PDC1基因的下游同源的序列。
(3)步驟3通過以將步驟1，2得到的PCR片段混合后的混合物作為模板，以引物1、引物4作為引物組進行PCR，可以得到在兩末端添加了與導入目的部位的上游側和下游側同源的序列的含有來自人或蛙的L-ldh基因、終止子和酵母選擇標志的PCR片段。上述PCR片段優選是在兩末端添加了與PDC1基因的上游以及下游同源的序列的含有來自人或蛙的L-ldh基因、終止子和標志基因的PCR片段。
將上述得到的來自人或蛙的L-ldh基因表達質粒或PCR片段導入酵母，當導入酵母選擇標志時，以其標志為指標可以得到轉化酵母。
通過對本發明的導入了來自人或蛙的L-ldh基因的酵母進行培養，在培養基中可以制造L-乳酸。當使導入的表達質粒保持在酵母內時，通過上述轉化酵母的培養法可以在培養基中制造L-乳酸。在本發明中，所謂L-乳酸脫氫酶活性是表現出將丙酮酸和NADH轉換為L-乳酸與NAD+的活性。L-乳酸脫氫酶活性有時以比活性作為指標進行比較。即，對L-ldh基因導入方法和遺傳背景相同的酵母在相同條件下進行培養，使用從培養菌體提取的蛋白質，測定伴隨著NADH的減少在340nm處的吸光度的變化。此時，通過在室溫下以每1分鐘使1μmol的NADH減少的酶量定義為1單位(Unit)，L-乳酸脫氫酶的比活性用數式1表示。其中，Δ340表示每1分鐘的340nm的吸光度的減少量，6.22是NADH的毫摩爾分子吸光系數。


......(式1) 以下，對編碼PDR13蛋白質的基因的一部分有突變的酵母的制作方法進行說明。
制備方法如 [1]使用在酵母的染色體DNA上通過轉座子實施插入突變的基因突變酵母文庫，從該文庫選擇與親本株相比乳酸生產能力提高的酵母的方法， [2]使用同源重組法等，制造編碼PDR13蛋白質的基因的一部缺損的酵母的方法，以及 [3]使用同源重組法等制造在染色體上具有這樣的DNA的微生物的方法等，所述DNA編碼具有在PDR13蛋白質的氨基酸序列中至少C末端側的39個氨基酸殘基不被翻譯的缺失、替換或插入等突變的氨基酸序列。
上述[1]方法中所謂親本株指的是供上述基因突變處理的原株，親本株可以是野生型酵母，也可以是實施了產業上有用的改良的突變酵母、細胞融合酵母或使用基因重組技術制作的重組酵母。
作為[1]的基因突變文庫的制作法，如由使用Yeast mTn PlasmidCollection(Open Biosystems公司生產)提供的轉座子序列插入基因組文庫通過限制性酶處理制備插入了轉座子序列的DNA片段后，通過利用二次同源重組將該DNA片段導入染色體DNA而構建基因突變文庫的方法。
通過將上述的基因突變文庫作為篩選源使用，對轉座子序列插入部位進行鑒定，可以觀察向明確被限定的基因區域的插入突變對乳酸酸生產能力的影響。
作為從上述文庫選擇乳酸生產能力提高的酵母的方法，如對在該文庫的各菌株中導入了編碼乳酸生成酶的基因的表達質粒后得到的轉化酵母進行培養，對生成的乳酸進行定量的方法。隨著培養時間的推移的同時，乳酸蓄積越多，可認為乳酸的生成量越多。
在從上述文庫選擇乳酸生產能力提高的酵母中，可以以導入了L-ldh基因的酵母作為親本株實施。導入的L-ldh的種類沒有特別限制，但優選使用具有序列編號1、序列編號2或序列編號3所示的核酸序列的來自人、蛙或牛的L-ldh基因。
圖3是表示本發明中使用的來自牛的L-Ldh表達用質粒pTRS57的結構圖，圖2是本發明中使用的質粒pTRS11的構建圖。
作為L-ldh基因的表達方式，只要是在可以使基因表達的啟動子的調控下連接該基因，通過向染色體導入進行表達或通過質粒進行表達等沒有特別限定。例如，在醇脫氫酶1基因啟動子的調控下，將連接了來自牛的L-Ldh基因的基因結構連接入pRS426的多拷貝表達質粒pTRS57、將來自人的L-Ldh基因連接入pTRS11的多拷貝表達質粒pTRS48。
按照常規方法將pTRS57導入文庫的各菌株后制作轉化酵母，通過對該轉化酵母和供轉化用的親本株分別進行培養，然后通過測定生成的乳酸的生成量，可以選擇較親本株的乳酸生產能力提高的酵母。
具有pTRS57的轉化酵母的培養只要是L-乳酸脫氫酶表達的培養法即可，并沒有特別的限定，通過轉化酵母的培養法可以實施。
培養液中的乳酸濃度可以通過使用HPLC的方法進行定量。例如，對培養液進行離心分離，取培養液上清，以該上清作為分析樣品，使用乳酸分析用陰離子交換柱，通過測定電傳導性對培養液的乳酸濃度進行定量。
通過進行同一時間培養，選擇較親本株表現出高的乳酸生產率的酵母，可以獲得較親本株的乳酸生產能力提高的酵母。
作為通過上述方法取得的乳酸生產能力提高的酵母，如在染色體DNA上具有將轉座子DNA片段插入到編碼PDR13蛋白質的基因(以下有時略稱為PDR13基因)的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[2]作為使用同源重組法等制造編碼PDR13蛋白質的基因的一部分缺損的酵母的方法，如使用通過直鏈DNA可進行的染色體上同源重組的酵母的方法。作為直鏈DNA，例如，在TRP1基因的兩端配置有與PDR13基因的內部或近旁的序列有同源性的DNA的直鏈DNA。
通過常規方法將該直鏈DNA導入到可通過直鏈DNA在染色體上進行同源重組的酵母，通過選擇色氨酸缺陷型回復株，可以制作PDR13基因部分缺失酵母。
[3]作為使用同源重組法等制造在染色體上具有這樣的DNA的微生物的方法，所述DNA編碼具有PDR13蛋白質的氨基酸序列中至少C末端側的39個氨基酸殘基不被翻譯的缺失、替換或插入等突變的氨基酸序列，如通過對PDR13基因導入位點特異的突變，制作編碼在該基因編碼的氨基酸序列中至少C末端側的39個氨基酸殘基不被翻譯的缺失、替換或插入的氨基酸序列的突變型基因，通過使用同源重組法制作具有PDR13基因被替換為突變型PDR13基因的染色體DNA的酵母的方法等。
通過使用上述[1]、[2]、[3]公開的方法，可以制作這樣的酵母，其為導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因、且具有包含野生型PDR13基因的DNA序列的一部分缺失、插入或替換而被突變的、該基因編碼的蛋白質的一部分被翻譯的DNA序列的突變型PDR13基因的酵母。
本發明的酵母優選為具有包含野生型醇脫氫酶的氨基酸序列的一部分被替換、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突變型醇脫氫酶的、該突變型醇脫氫酶顯示通過改變培養溫度而使細胞內醇脫氫酶活性消失或降低的溫度感受性的酵母。
本發明的酵母更優選具有包含野生型醇脫氫酶的氨基酸序列的一部分氨基酸的1個或數個氨基酸通過替換、缺失、插入和/或添加而被突變的氨基酸序列的突變型醇脫氫酶。其中替換、缺失、插入、添加的突變任一種可單獨突變，或它們中的多個組合。
作為突變型醇脫氫酶，優選由ADH1基因編碼的野生型醇脫氫酶的突變型，更優選包含序列編號39所示氨基酸一級序列的野生型醇脫氫酶1的突變型。還更優選突變型醇脫氫酶是在序列編號39所示的由野生型醇脫氫酶1的氨基酸序列中包含1個至數個氨基酸被替換、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突變型醇脫氫酶。
本發明的酵母具有的優選的突變型醇脫氫酶是包含序列編號40、序列編號41或序列編號42所示氨基酸序列的突變型醇脫氫酶。
所謂本發明的酵母具有的突變型醇脫氫酶的溫度感受性指的是具有突變型醇脫氫酶的酵母與具有野生型醇脫氫酶的酵母比較，在某一培養溫度時雖然表現出同等程度的醇脫氫酶活性，但如使培養溫度變化，達到特定的培養溫度以上時，表現出醇脫氫酶活性消失或降低的性質。由于細胞內醇脫氫酶的活性降低，糖同化能力下降，酵母在含糖培養基中的生長速度顯著變慢，所以可以通過觀察在含糖培養基的生長速度判斷有無感受性。發明的酵母優選突變型醇脫氫酶在培養溫度為攝氏30度以上，更優選在攝氏32度以上，進一步更優選在攝氏34度以上表現出溫度感受性的酵母。
以下，有關具有有溫度感受性的突變型醇脫氫酶的酵母的制作方法，雖然是以有溫度感受性的突變型ADH1基因的酵母的情況為例敘述的，但這并不意味導入突變的基因限定于ADH1基因，另外上述酵母的制作方法也并不限定于此。
首先制作缺失了野生型ADH1基因的酵母。缺失可通過上述目的基因的缺失方法實施。酵母如果缺失了在細胞內擔負主要的醇活性的ADH1基因座，對包含葡萄糖的糖的同化能力降低，在含糖培養基中的生長速度顯著變慢。利用這一性質，可以由隨機導入突變的ADH1基因群體篩選溫度感受性的突變型ADH1基因。如果將導入了隨機突變導入ADH1基因的轉化酵母組在含葡萄糖的培養基上于通常的培養溫度(室溫～攝氏30度)進行培養，由于具有因導入突變而活性消失的ADH1基因的酵母變得不能生長，所以通過觀察生長性，只選擇在這個溫度具有活性的ADH1基因的酵母。然后，將選擇的酵母組在通常的培養溫度以外(攝氏30度以上、或室溫以下)使用含葡萄糖培養基進行培養，由于具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母不能生長，就有可能進行導入了溫度感受性突變型ADH1基因的酵母的負篩選。具體來說，例如將轉化體在攝氏25度培養，對于生長的酵母，確認攝氏30度、34度、37度在含葡萄糖培養基中的生長，可以制作對于各個溫度表現出感受性的酵母，培養溫度并不限定于這些溫度。
溫度感受性突變酵母的制作方法有從自然界篩選、利用亞硝基胍、甲磺酸乙酯等藥物處理、紫外線照射等突然突變的手法和利用PCR反應的基因工程的手法等。
作為利用基因工程手法在特定的基因導入突變的方法，有隨機導入突變的方法和位點特異導入突變的方法。作為前者的隨機導入突變的方法，通過使用隨機突變導入用試劑盒(BD多樣化PCR隨機誘變(CLONTECH公司生產))；作為位點特異地導入突變的方法，通過使用位點特異的突變導入用試劑盒(Mutan-K(Takara Bio公司生產))的方法，制備具有突變的基因。其中，優選利用基因工程手法的制作方法，但并不限定于該方法。
至于這樣得到的突變型ADH1基因的導入，可以利用缺口修復法(“酵母分子遺傳學實驗法”、學會出版中心、1996年)，即如果將突變型ADH1基因DNA片段和在克隆了ADH1基因的有自主復制能力的質粒中ADH1基因內缺失后線性化的產物同時導入酵母細胞，通過突變型ADH1基因DNA片段與缺失部分兩端的同源性序列發生同源重組，進行缺失部分的修復，同時質粒閉環，恢復自主復制能力。具體來說，使用將克隆了ADH1基因的質粒用適當的限制性酶切得到的消除了突變導入靶區域DNA的質粒、以及使用適當的引物就ADH1基因區域在導入隨機突變同時擴增的片段，通過同時導入到ADH1缺失的酵母，可以得到在突變導入靶區域導入了隨機突變的突變型ADH1基因被克隆的環狀質粒。
利用缺口修復法導入突變中使用的質粒可以使用在上述酵母中廣泛利用的質粒。優選使用在酵母細胞內的拷貝數少的、例如YCp50、pRS315、pRS316、pAUR112或pAUR123等質粒，但不限定于此。此時在導入的ADH1基因區域，最好還含有存在于這個基因的上游區和下游區的調節該基因表達的操縱基因、啟動子、終止子和增強子等所謂的調節序列。這樣操作可以制作克隆到質粒的溫度感受性突變型ADH1基因。
以下就具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母的制作進行說明。
上述得到的溫度感受性突變型ADH1基因已被克隆的質粒可以由經轉化酵母取得。取得的方法沒有特別限定，可以使用市售的酵母質粒回收試劑盒，例如YEASTMAKER酵母質粒分離試劑盒(Clonetech公司)等。如果用不切斷得到的質粒的ADH1基因序列內的限制性酶消化、線性化后的產物轉化上述那樣制作的adh1缺失酵母，在與ADH1基因座鄰接的DNA序列和線性化質粒的DNA序列的同源區域發生重組，在缺失ADH1的同時被替換為所用的標志基因和溫度感受性突變型ADH1基因，可以得到具有目的的溫度感受性突變型ADH1基因的酵母。這可通過應用“pop-in/pop-out法”(Methods in Enzymology、1987年、第154卷、p.164-174所述)實施。
作為確認醇脫氫酶表現出溫度感受性的方法，如對于在感受性溫度下培養的酵母細胞的破碎物，觀測醇脫氫酶催化的由乙醇向乙醛的氧化反應，與具有野生型基因的酵母細胞比較，以具有突變型基因的酵母細胞的破碎物表現出的活性低作為指標的方法。
醇脫氫酶的活性在考慮了各醇脫氫酶同工酶催化反應的環境后決定測定的溫度和pH條件，通過測定在該條件下的對乙醇的底物親和性進行評價。例如，釀酒酵母的ADH1基因編碼的醇脫氫酶的培養溫度在攝氏34度的酶活性使用培養溫度攝氏34度培養得到的培養的破碎物，用Tris鹽酸緩沖液將pH調整到pH8.8，于反應溫度定在攝氏30度的環境下以乙醇作為底物測定。活性可通過觀測起因于與從乙醇向乙醛的氧化反應同時發生的氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)轉換為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)的還原反應的波長340nm處吸光度變化進行評價。此時通過將室溫下每1分鐘使1μmol的NADH減少的酶量定義為1單位(unit)，醇脫氫酶的比活性可用式(2)表示。其中Δ340nm表示每1分鐘的波長340nm的吸光度的減少量，6.22是在光路長1cm時的NADH的毫摩爾分子吸光系數。


對于在各培養溫度培養的本發明的突變型酵母細胞和野生型酵母細胞的破碎液，通過對在同樣條件下進行醇脫氫酶活性的測定，對算出的醇脫氫酶的比活性進行比較，可以對在該培養溫度的突變型醇脫氫酶的溫度感受性進行評價。
通過使用上述公開的方法，可以制作導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母，所述酵母具有包含野生型醇脫氫酶的氨基酸序列的一部分被替換、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突變型醇脫氫酶，該突變型醇脫氫酶由于改變培養溫度，表現出細胞內的醇脫氫酶活性消失或降低的溫度感受性。
作為編碼酵母的丙酮酸脫羧酶的基因群體(PDC)，已知有編碼丙酮酸脫羧酶1的基因(PDC1基因)、編碼丙酮酸脫羧酶5的基因(PDC5基因)和編碼丙酮酸脫羧酶6的基因(PDC6基因)這3種。其中，具有作為丙酮酸脫羧酶的主要功能的基因是PDC1基因和PDC5基因。
本發明的酵母優選PDC1基因缺失，而且具有包含野生型PDC5基因的堿基序列的一部分被缺失、插入、替換和/或添加的堿基序列的突變型PDC5基因的酵母。其中一部分堿基的缺失、插入、替換和/或添加的突變可以是任一種單獨的突變，或它們的多個的組合。
本發明的酵母更優選編碼野生型丙酮酸脫羧酶5的基因的堿基序列包含序列編號51所示的堿基序列的基因。
作為本發明的酵母具有的突變型PDC5基因，優選包含序列編號51所示的堿基序列的野生型PDC5基因的突變體。本發明的酵母更優選地編碼突變型丙酮酸脫羧酶5的基因為包含序列編號52或53中任一個所示的堿基序列的基因。
本發明的酵母具有的突變型丙酮酸脫羧酶5最好是溫度感受性的。這里的所謂丙酮酸脫羧酶5的溫度感受性指的是具有突變型丙酮酸脫羧酶5的酵母與具有野生型丙酮酸脫羧酶5的酵母比較，在某一培養溫度時，雖然表現出相同程度的丙酮酸脫羧酶活性，但如果使培養溫度變化，達到特定的培養溫度以上，丙酮酸脫羧酶5活性表現出消失或降低的性質。由于酵母細胞內的丙酮酸脫羧酶活性一旦降低，糖同化能力下降，在含糖培養基中的生長速度顯著變慢，所以通過觀察在含糖培養基中的生長速度可以判斷有無感受性。本發明中優選突變型丙酮酸脫羧酶5在攝氏34度以上表現出溫度感受性的酵母。
為了在PDC5基因導入突變，可利用通常運用的方法，通過改變PDC5基因的DNA序列實現。作為改變PDC5基因的方法，利用由那些突變株組制作具有溫度感受性的ADH1基因的突變株的方法也可得到該酶活性下降的酵母。沒有檢測到丙酮酸脫羧酶活性的酵母當以葡萄糖作為唯一碳源時，生長顯著變慢。如果利用這一性質制作了丙酮酸脫羧酶的酶活性低下酵母，在非限制溫度條件下，由于丙酮酸脫羧酶活性殘留，表現出與野生型酵母同等程度的生長能力。如果在限制溫度條件下，制作由于該酶活性下降，生長能力顯著下降的突變株，可以得到希望的具有溫度感受性的突變型PDC5基因。
以下，對在本發明的導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母中，PDC1基因缺失、具有突變型PDC5基因的酵母的制作方法進行更具體的說明。首先為了進行本發明的突變型PDC5基因的篩選，制作使PDC1基因與PDC5基因兩方都缺失的Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母。其中記號“Δ”意思是“缺失”。
Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母的制作的方法可通過上述目的基因的缺失方法實施，但不限定于此。酵母如果是屬于酵母屬的酵母，使用目的基因的缺失方法，制作Δpdc1單獨缺失株、Δpdc5單獨缺失株，通過四分子分離法從它們的2倍體也可以制作Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母。
以下就突變型PDC5基因的制備方法進行敘述。制備的方法可通過上述溫度感受性突變株的制作方法實施。雖然給出了通過利用PCR反應的基因工程的手法的制作方法，但并不限定于該方法。通過使用隨機突變導入用試劑盒BD多樣化PCR隨機誘變試劑盒(CLONTECH公司生產)的方法也可以得到突變型PDC5基因。
對于在像上述那樣得到的突變型PDC5基因的導入，可以通過使用上述同樣的缺口修復法(“酵母分子遺傳學實驗法”、學會出版中心、1996年)實施。即，將突變型PDC5基因DNA片段和克隆了PDC5基因的有自主復制能力的質粒中PDC5基因內缺失后線性化的質粒同時導入Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母中，可以得到在突變導入靶區域導入了隨機突變的突變型PDC5基因被克隆的環狀質粒。
以下，就具有突變型PCD5基因、缺失了PDC1基因的Δpdc1改變pdc5酵母的制作進行說明。從經轉化酵母可取得上述得到的克隆了突變型PDC5基因的質粒。取得的方法沒有特別限定，可以使用市售的酵母質粒回收試劑盒、例如YEASTMAKER酵母質粒分離試劑盒(Clonetech公司)等。然后使用“pop-in/pop-out法”，通過用不切斷得到的質粒的PDC5基因序列內的限制性酶進行消化、線性化的質粒轉化像上述那樣制作的Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母，可以得到目的的Δpdc1改變pdc5酵母。
以下，就通過突變型PDC5基因的導入，細胞內的丙酮酸脫羧酶活性變化的酵母的挑選方法進行說明。
作為丙酮酸脫羧酶活性變化的確認方法，對用缺口修復法得到的各個轉化細胞進行培養的破碎物測定丙酮酸脫羧酶比活性，可以以與具有野生型PDC5基因的酵母比較的變化作為指標進行挑選。
與具有野生型PDC5基因的酵母相比，丙酮酸脫羧酶比活性低下的具有突變型PDC5基因的轉化酵母細胞的挑選可以測定具有突變型PDC5基因的酵母的丙酮酸脫羧酶比活性，挑選與具有野生型PDC5基因的酵母相比，該酶比活性低下的細胞。另外，或者通過挑選突變型PDC5基因表現出溫度感受性的轉化酵母，可以挑選更理想的酵母。
以下對具有突變型PCD5基因、PDC1基因缺失的Δpdc1改變pdc5酵母的制作進行說明。
從經轉化酵母取得上述得到的突變型PDC5基因被克隆的質粒。取得的方法并沒有特別限定，可以使用市售的酵母質粒回收試劑盒、例如YEASTMAKER酵母質粒分離試劑盒(Clonetech公司)等。如果用不切斷得到的質粒的PDC5基因序列內的限制性酶消化、線性化的質粒轉化上述那樣制作的Δpdc1Δpdc5二重缺失酵母，PDC5基因座鄰接的DNA序列與線性化質粒的DNA序列的同源區域發生重組，在缺失PDC5的同時被替換為所使用的標志基因和突變型PDC5基因，可以得到目的的Δpdc1改變pdc5酵母。這可通過應用“pop-in/pop-out法”(Methods inEnzymology)、1987年、第154卷、p.164-174」所述)實施。
對上述挑選的酵母細胞內的丙酮酸脫羧酶活性的評價方法進行說明。該酶活性可以將以下(1)～(3)給出概略的Pronk等人的方法(Yeast，1996年，第12卷，1607-1633頁)適當改變之后進行測定。
(1)在丙酮酸脫羧酶催化下由底物丙酮酸生成乙醛。
(2)醇脫氫酶以還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)作為輔酶將(1)中生成的乙醛轉換為乙醇。
(3)測定(2)中醇脫氫酶將乙醛轉換為乙醇時減少的NADH量。
其中，如果(2)中減少的乙醛的量與(1)中生成的乙醛的量相等，(3)中測定的NADH的減少量與(1)中丙酮酸的減少量應當相等。即酵母細胞內的丙酮酸脫羧酶活性可以由上述反應體系的NADH減少量測定。
另外，酵母細胞內的丙酮酸脫羧酶活性可以以比活性作為指標進行比較。即從在相同條件下培養的酵母提取蛋白質，使用該提取液測定伴隨著NADH的減少于波長340nm的吸光度的變化。此時，通過將在30℃時每1分鐘使1μmol的NADH減少的酶量定義為1單位(Unit)，丙酮酸脫羧酶的比活性可以用下面的數式3表示。其中Δ340是每1分鐘的波長340nm的吸光度的減少量，6.22是光路長1cm的NADH的毫摩爾分子吸光系數。通過在相同條件下進行測定、算出的丙酮酸脫羧酶的比活性可以對該酶活性進行比較。


......(式3) 通過使用上述公開的方法，可以制作導入了編碼來自人或非洲爪蟾的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，編碼丙酮酸脫羧酶1的基因缺失、具有包含編碼野生型丙酮酸脫羧酶5的基因的堿基序列的一部分被缺失、插入、替換和/或添加的堿基序列的突變型丙酮酸脫羧酶5基因的酵母。
本發明是導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，但還包括至少包含下述的(1)～(3)特征中的任意2個以上特征的酵母。
(1)酵母，其為導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，且為具有突變型PDR13基因的酵母，其中所述突變型PDR13基因包含野生型PDR13基因的DNA序列的一部分通過缺失、插入或替換而被突變的可翻譯成該基因編碼的蛋白質的一部分的DNA序列， (2)酵母，其為導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，且為具有突變型醇脫氫酶的、該突變型醇脫氫酶顯示通過改變培養溫度而使細胞內醇脫氫酶活性消失或降低的溫度感受性的酵母，其中所述突變型醇脫氫酶為包含野生型醇脫氫酶的氨基酸序列的一部分被替換、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突變型醇脫氫酶，和 (3)酵母，其為導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，且為編碼丙酮酸脫羧酶1的基因缺失、具有包含編碼野生型丙酮酸脫羧酶5的基因的堿基序列的一部分被缺失、插入、替換和/或添加的堿基序列的突變型丙酮酸脫羧酶5基因的酵母。
對至少含有兩個上述(1)～(3)特征的突變基因的酵母的制備法進行說明。
具體來說，以具有一個突變基因的酵母作為親本株，通過使用上述給出的具有另外的突變基因的酵母的制備方法可以制作。更具體來說，例如當制作同時具有突變型PDR13和突變型ADH1基因的酵母時，以具有突變型PDR13基因的酵母作為親本株，如果做成具有突變型ADH1基因的酵母，就可以制作同時具有突變型PDR13與突變型ADH1基因的酵母。有關其它的突變基因的組合也可同樣制作。
而酵母如果是屬于酵母屬的酵母，也可以由具有各個突變型基因的酵母接合后的2倍體通過四分子分離法制作。具體來說，當制作例如同時具有突變型PDR13與突變型ADH1基因的酵母時，由具有突變型PDR13的酵母與突變型ADH1基因的酵母接合后的2倍體通過四分子分離法可以制作同時具有突變型PDR13與突變型ADH1基因的酵母。其它突變基因的組合也可同樣制作。
本發明還提供有效的L-乳酸的制造法。本發明的L-乳酸的制造方法優選包括對本發明的導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因(L-ldh基因)的酵母進行培養。
在對本發明的酵母進行培養制造L-乳酸的方法中，作為培養酵母的培養基，只要是含有該酵母可吸收利用的碳源、氮源、無機鹽類等，可有效進行該酵母培養的培養基即可，可以使用天然培養基、合成培養基中的任一種。
作為碳源，只要是該酵母可吸收利用的即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖等糖類、含有這些糖類的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物。碳源可以在培養開始時一起添加，或在培養中分批地，或連續地添加，可以使用10g/l～200g/l的濃度。
作為氮源，可以使用氨、氯化銨、硫酸銨、乙酸銨等無機酸或有機酸的銨鹽、胨、肉膏、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆粕、大豆粕水解物、各種發酵菌體消化物等。
作為無機鹽類，可以使用磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。
培養可以通過振蕩培養或攪拌培養等進行。氧供給條件并沒有特別限定，可以在好氧條件下或微好氧條件下進行。培養溫度在攝氏25～35度為好，培養時間通常為24小時～5天。培養中的培養液pH希望保持在2.5～5.0，pH的調整可以使用堿溶液、氨、碳酸鈣等進行。
在制造L-乳酸時，首先通過對本發明的酵母進行前培養，然后將前培養液轉移到新的培養基后進行本培養，可以在培養液中制造L-乳酸。培養溫度只要是菌株的增殖沒有被實質抑制，能夠生產乳酸的范圍即可，并沒有特別限制，優選攝氏20～40度范圍的溫度，更優選攝氏25～37度范圍的溫度，最優選攝氏30～34度。培養可以采用靜置、攪拌或振蕩中的任一種方法。
通過在上述那樣的條件下進行培養，在培養基中可以得到1～20％的乳酸。對于得到的L-乳酸的測定法沒有特別限制，例如有使用HPLC的方法，或使用F-試劑盒(Roche公司生產)的方法等。
得到的培養液中的乳酸可以通過現有已知的方法進行純化。例如，將對微生物進行離心分離的發酵液調整到pH1以下后用二乙醚或乙酸乙酯等萃取的方法，吸附于離子交換樹脂、進行清洗后，進行洗脫的方法，在酸催化劑存在下與醇反應，成酯后進行蒸餾的方法，做成鈣鹽或鋰鹽晶析的方法等。
根據本發明，通過對導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母進行培養，與現有的導入了來自牛的編碼L-乳酸脫氫酶的基因的酵母的培養相比，可以以高的對糖收率制造L-乳酸。另外作為來自導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母，通過對該酵母基因導入突變，進行培養，有可能進一步使收率提高。
實施例 以下通過實施例對本發明的實施方案進行說明，這些例子只是例示，對本發明沒有任何限制。
下面有關分子遺傳學的實施手法，只要沒有特別指出，都是根據“分子克隆第3版(Molecular cloning，第3版)、1991年、(美國)”、“Methodsin Enzymology、1991年、美國、第194卷”、“Method in Yeast Genetics2000出版、2000年、美國”。
另外，PCR法只要沒有特別指出，都是使用KOD-Plus聚合酶(東洋紡公司生產)或LA-Taq(寶酒造公司生產)，詳細操作根據附帶的程序進行。
(實施例1來自人或蛙的L-ldh基因表達質粒的制作) 在本發明中，作為來自人的L-ldh基因，使用具有序列編號1所示的核酸序列的L-ldh基因，而作為來自蛙的L-ldh基因使用具有序列編號2所示的核酸序列的來自于非洲爪蟾(Xenopus laevis)的L-ldh基因。來自人或蛙的L-ldh基因的克隆通過PCR法進行。作為取得來自人的L-ldh基因的PCR的模板，使用來自人乳癌株化細胞cDNA。由人乳癌株化細胞制備cDNA是通過對人乳癌株化細胞(MCF-7)進行培養回收后，使用TRIZOL試劑(Invitrogen公司生產)提取總RNA，以得到的總RNA作為模板，通過使用SuperScript選擇系統(Invitrogen公司生產)的逆轉錄反應進行cDNA的合成。這些詳細的操作根據附帶的各個程序進行。作為取得來自蛙的L-ldh基因的PCR的模板，使用由非洲爪蟾的腎臟的cDNA文庫(STRATAGENE公司生產)制備的噬菌粒DNA。噬菌粒DNA的制備根據附帶的程序進行。
對于來自人的L-ldh基因擴增用引物(序列編號4，5)，按照在5末端側添加XhoI識別序列、3末端側添加NotI識別序列那樣制作，對于來自蛙的L-ldh基因擴增用引物(序列編號6，7)，按照在5末端側添加SalI識別序列、3末端側添加NotI識別序列那樣制作。對PCR擴增片段進行純化，對末端用T4多核苷酸激酶(Takara Bio公司生產)進行磷酸化后，與pUC118質粒(用限制性酶HincII切，對切斷處進行脫磷酸化處理的產物)連接。連接使用DNA連接試劑盒Ver.2(Takara Bio公司生產)進行。用連接溶液轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞(Takara Bio公司生產)，播在含有50μg/mL抗生素氨芐青霉素的LB板上，培養過夜。對于生長的菌落，回收質粒DNA，用限制性酶XhoI與NotI或SalI與NotI切，挑選插入了來自人或蛙的L-ldh基因的質粒。這一系列操作都根據附帶的程序進行。
將上述的插入了來自人或蛙的L-ldh基因的pUC118質粒用限制性酶XhoI與NotI或SalI與NotI切，通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段，根據通用的方法純化含有來自人或蛙的L-ldh基因的片段。將得到的含有L-ldh基因的片段與圖2所示的表達質粒pTRS11的XhoI/NotI酶切位點連接，用與上述同樣的方法回收質粒DNA，通過用限制性酶XhoI與NotI切，挑選插入了來自人或蛙的L-ldh基因的表達質粒。以后將這樣制作的整合了來自人的L-ldh基因的表達質粒定為pTRS48、而將整合了來自蛙的L-ldh基因的表達質粒定為pTRS102。
(比較例1來自牛L-ldh基因的表達質粒的制作) 作為比較對象，制備導入了來自牛的L-ldh基因的酵母。
來自牛的L-ldh基因(序列編號3)的克隆用PCR法進行。由來自牛骨骼肌的cDNA文庫(STRATAGENE公司生產)根據附帶的程序制備的噬菌粒DNA作為模板，與實施例1同樣進行PCR。而對于基因擴增用引物(序列編號8，9)，按照在5末端側添加XhoI識別序列、在3末端側添加NotI識別序列那樣制作。
以下，通過與實施例1的插入了來自人的L-ldh基因的表達質粒同樣的方法制作插入了來自牛的L-ldh基因的表達質粒。以后將這樣制作的整合了來自牛的L-ldh基因的表達質粒定為pTRS49。
(實施例2pdc1基因缺失株的制作) 使用同源重組法制備將存在于釀酒酵母NBRC10505株的基因組DNA上的PDC1基因替換為TRP1基因的株(以下略記為Δpdc1株)。Δpdc1株像以下那樣制作。通過以質粒pRS424為模板，使用包含序列編號10和11表示的堿基序列的DNA作為引物組的PCR，對在TRP1基因的5’上游添加了序列編號12所示的序列、3’下游添加了序列編號13所示的序列的DNA片段進行擴增。對擴增的DNA片段進行純化，使用該DNA1μg對NBRC10505株進行色氨酸非缺陷型轉化。將得到的轉化株定為SW029株。
(實施例3來自人或蛙的L-ldh基因表達質粒向酵母的導入) 使用實施例1得到的pTRS48或pTRS102對SW029株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。來自人或蛙的L-ldh基因表達質粒導入這樣得到的轉化株的確認通過從轉化株提取基因組，以它作為模板的PCR進行。對于確認用引物，使用克隆各個L-ldh基因時使用的引物(來自人的L-ldh基因序列編號4，5、來自蛙的L-ldh基因序列編號6，7)。結果在用pTRS48或pTRS102轉化的株中，確認了分別導入了來自人或蛙的L-ldh基因。以下將上述導入pTRS48或pTRS102的轉化株分別定為SW029/pTRS48株、SW029/pTRS102株。
(比較例2來自牛的L-ldh基因表達質粒向酵母的導入) 使用像比較例1那樣得到的pTRS49，對SW029進行尿嘧啶非缺陷型轉化。而來自牛的L-ldh基因表達質粒導入的確認用與實施例3同樣的方法進行，作為引物使用序列編號8，9所示的寡核苷酸。以下將上述導入了pTRS49的轉化株定為SW029/pTRS49株。
(實施例4來自人或蛙的L-ldh基因向酵母染色體的導入) 通過以實施例1得到的pTRS48或pTRS102作為擴增模板，寡核苷酸(來自人的L-ldh基因序列編號14，16、來自蛙的L-ldh基因序列編號15，16)作為引物組的PCR對含有來自人或蛙的L-ldh基因和GAPDH終止子序列的約1.3kb的DNA片段進行擴增(相當圖1的步驟1)。其中序列編號14和15按照添加序列編號17所示的相當于PDC1基因的上游60bp的序列那樣設計。
接下來，通過以質粒pRS424作為擴增模板，以寡核苷酸(序列編號18，19)作為引物組的PCR對含有作為酵母選擇標志的TRP1基因的約1.2kb的DNA片段進行擴增(相當于圖1的步驟2)。其中序列編號19按照添加序列編號20所示的相當于PDC1基因的下游60bp的序列那樣設計。
對各個DNA片段進行純化，通過將得到的含有L-ldh基因的各1.3kb片段、含有TRP1基因的1.2kb片段的混合物作為擴增模板，以寡核苷酸(來自人的L-ldh基因序列編號14，19、來自蛙的L-ldh基因序列編號15，19)作為引物組的PCR法對連接了來自人或蛙的L-ldh基因、GAPDH終止子和TRP1基因的約2.5kb的DNA片段進行擴增(相當于圖1的步驟3)。
通過使用對上述約2.5kb的DNA片段進行了純化的片段轉化NBRC10505株，用沒有添加色氨酸的培養基進行培養，選擇來自人或蛙的L-ldh基因被導入到染色體上PDC1基因啟動子下游的轉化株。
像上述那樣得到的轉化株是在染色體上的PDC1基因啟動子的下游導入了來自人或蛙的L-ldh基因的酵母的確認像下面那樣進行。首先提取轉化株的基因組，通過以此基因組作為擴增模板，以寡核苷酸(來自人的L-ldh基因序列編號14，21、來自蛙的L-ldh基因序列編號15，21)作為引物組進行PCR，確認得到的約2.8kb的擴增DNA片段。而在非轉化株通過上述PCR得到約2.1kb的擴增DNA片段。以下將上述的在染色體上的PDC1基因啟動子的下游導入了來自人的L-ldh基因的轉化株定為L5株、在染色體上的PDC1基因啟動子的下游導入了來自蛙的L-ldh基因的轉化株定為B2株。
(實施例5、比較例3L-乳酸發酵試驗1) 使用像實施例3、比較例2那樣得到的SW029/pTRS48株、SW029/pTRS102株和SW029/pTRS49株進行L-乳酸生產率試驗。
將從表1所示組成的培養基(以下作為乳酸發酵培養基)除去了尿嘧啶的培養基10mL加入到試管中，在試管中分別接種少量的SW029/pTRS48株、SW029/pTRS102株與SW029/pTRS49株，于30℃下培養過夜(前前培養)。然后將除去尿嘧啶的新鮮的乳酸發酵培養基100mL加入到500ml容量的三角燒瓶中，將各前前培養液分別全量接種，于30℃下振蕩培養24小時(前培養)。然后在投入了1L的除去了尿嘧啶的乳酸發酵培養基的小型發酵罐(丸菱バイオエンジ公司生產、容量5L)，將從前培養開始24小時后的前培養液分別全量接種，在攪拌速度(120轉/分鐘)、通氣量(0.1L/分鐘)、溫度(30℃)、pH(pH5)的條件下進行培養(本培養)。對本培養開始后40小時的培養液進行離心分離，對得到的上清進行膜過濾后，于下述所示的條件下通過HPLC測定L-乳酸量。
柱Shim-PackSPR-H(島津公司生產) 移動相5mM對甲苯磺酸(流速0.8mL/分鐘) 反應液5mM對甲苯磺酸、20mM bis-Tris、0.1mM EDTA·2Na(流速0.8mL/分鐘) 檢測方法電傳導性 溫度45℃。
葡萄糖濃度的測定使用葡萄糖Test Wako C(和光純藥)。
由測定結果算出的L-乳酸的對糖收率如表2所示。
表1


單位(/升) 表2
根據表2的結果，通過對導入了來自人或蛙的L-ldh基因的酵母進行培養，與導入了來自牛的L-ldh基因的酵母進行培養相比，可以以高的對糖收率制造L-乳酸。
(實施例6L-乳酸發酵試驗2) 使用像實施例4那樣得到的L5株和B2株，通過與實施例5同樣的方法進行L-乳酸生產率試驗。作為培養基使用表1給出的乳酸發酵培養基。
將乳酸發酵培養基10mL加入到試管中，在試管中分別接種少量的B2株和L5株，于30℃培養過夜(前前培養)。然后將新鮮的乳酸發酵培養基100mL加入到500ml容量的三角燒瓶中，將各前前培養液分別全量接種，于30℃振蕩培養24小時(前培養)。然后在加入了1L乳酸發酵培養基的小型發酵罐(丸菱バイオエンジ公司生產、容量5L)中，將從前培養開始24小時后的前培養液分別全量接種，在攪拌速度(120轉/分鐘)、通氣量(0.1L/分鐘)、溫度(30℃)、pH(pH5)的條件下進行培養(本培養)。對本培養開始后30小時的培養液進行離心分離，對得到的上清進行膜過濾后，在與實施例5同樣條件下通過HPLC測定L-乳酸量。由測定結果算出的L-乳酸的對糖收率如表3所示的。
表3
根據表2和表3的結果，通過對在染色體上的PDC1基因啟動子的下游導入了來自人或蛙的L-ldh基因的酵母進行培養，可以以與導入了L-ldh基因表達質粒的酵母進行培養的同等以上的對糖收率制造L-乳酸。
(實施例7、比較例4L-乳酸脫氫酶的活性) 使用實施例3、比較例2中得到的SW029/pTRS48株，SW029/pTRS102株和SW029/pTRS49株，比較pH5～7時的來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶活性和來自牛的L-乳酸脫氫酶活性。
(a)從菌體提取蛋白質 在試管中加入10mL的SC-Ura培養基，然后接種少量的SW029/pTRS48株、SW029/pTRS102株和SW029/pTRS49株，于30℃培養過夜(前培養)。然后將20mL的SC-Ura培養基加入到100mL容量的坂口燒瓶中，然后以2％接種量接種前培養液，振蕩培養24小時(本培養)。通過對10mL的本培養液進行離心、集菌，用10mL的磷酸緩沖液清洗后，懸浮于1mL的磷酸緩沖液。將上述菌體懸濁液移到Eppendorf管，再加等量的玻璃珠(SIGMA公司生產、直徑0.6mm)，用MicroTubeMixer(TOMY公司生產)于4℃破碎菌體。像上述那樣操作破碎菌體后，將離心得到的上清作為L-乳酸脫氫酶液(以下略記為L-Ldh酶液)。
(b)L-乳酸脫氫酶活性測定 以牛IgG(1.38mg/mL、BIO-RAD公司生產)作為標準制作的校準線作為基礎，使用BCA蛋白測試試劑盒(PIERCE公司生產)測定(a)中得到的L-Ldh酶液的濃度，各L-Ldh酶液按照終濃度達到0.5mg/mL那樣用滅菌水稀釋。然后，將表4所示的6水準比例的混合液(除去L-Ldh酶液和NADH)分注到半微量比色杯，在開始測定前加L-Ldh酶液和NADH，并混合。這里所謂2xBR緩沖液是用5N NaOH分別將0.08M乙酸、磷酸、硼酸溶液調到pH5，6，7的緩沖液。
表4

用分光光度計(Ultrospec3300Pro Amersham公司制)測定各水準下340nm處的吸光度的減少，將得到的Δ340的值帶入式(1)，分別算出比活性。測定在pH5，6，7等3水準下進行。在上述測定中，作為比較對象的L-乳酸脫氫酶的比活性與來自牛的L-乳酸脫氫酶的比活性相比，當3個pH水準中2個水準以上高時，確定在pH5～7，作為該比較對象的L-乳酸脫氫酶比來自牛的L-乳酸脫氫酶活性具有更高的活性。算出結果如表5所示。
表5
由該結果可知在pH5～7，來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶活性比來自牛的L-乳酸脫氫酶的活性高。另外，由表2的結果可知通過對本發明的導入了來自人或蛙的L-ldh基因的酵母進行培養，可以以比對導入了來自牛的L-ldh基因的酵母進行培養還高的對糖收率制造L-乳酸。
由表2和表5的結果可知通過對導入了編碼在pH5～7的L-乳酸脫氫酶活性比來自牛的L-乳酸脫氫酶活性高的L-乳酸脫氫酶的酵母進行培養，可以以比對導入了來自牛的L-ldh基因的酵母進行培養還高的對糖收率制造L-乳酸。
(實施例8通過轉座子序列插入進行基因突變株文庫的制作) 用同源重組制備存在于NBRC10505株的基因組DNA上的PDC1基因座缺失的基因重組株(以下略記為pdc1Δ0株)。pdc1Δ0株像以下那樣制備。通過以NBRC10505株的基因組DNA作為模板，使用包含序列編號24和25表示的堿基序列的引物組的PCR，對由含有PDC1基因的5’上游約500堿基對的序列編號26表示的堿基序列構成的DNA片段進行擴增。另外通過使用由序列編號27和28表示的堿基序列構成的引物組的PCR對由含有PDC1基因的3’下游500堿基對的序列編號29表示的堿基序列構成的DNA片段進行擴增。對擴增的DNA片段進行純化，通過將2種該DNA片段等量混合，以該混合液作為模板，使用包含序列編號24和28表示的堿基序列的引物組的PCR，對包含連接了PDC1基因的5’上游500堿基對和3’下游500堿基對的序列編號30表示的堿基序列的DNA片段進行擴增。對擴增的DNA片段進行純化，將該DNA用限制性酶KpnI處理，將得到的DNA片段與質粒pRS416連接(以下略記為pdc1-pRS416)。將pdc1-pRS416質粒DNA用限制性酶EcoRV消化，使用該DNA片段100ng對NBRC10505株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。將得到的轉化體涂布于1g/L的添加了5-氟乳清酸的培養基，以生長下來的轉化體的基因組DNA作為模板，使用包含序列編號31和32表示的堿基序列的引物組進行PCR，選擇缺失了PDC1基因的株。
然后，使用pTRS57質粒DNA10ng對pdc1Δ0株進行色氨酸非缺陷型轉化。pTRS57是將在ADH1啟動子的調控下連接了來自牛的L-ldh基因的結構導入到pRS424的多拷貝表達質粒，圖3給出了它的結構。
接下來，以用pTRS57轉化的株作為宿主，將由Yeast mTn PlasmidCollection(Open Biosystems公司生產)制備的轉座子文庫用限制性酶NotI處理，使用得到的DNA片段進行尿嘧啶非缺陷型轉化。
(實施例9以乳酸生產作為指標的L-乳酸生產能力提高的酵母株的篩選) 將實施例8中制作的重組株用SC-Ura培養基于30℃溫度振蕩培養過夜。將10μl的該培養液接種在1ml的SC-Ura培養基，于30℃溫度振蕩培養。培養開始40小時后，對培養液進行離心分離，測定上清的乳酸濃度。乳酸的定量使用F-kit(L-乳酸)(J·K International公司生產)。
測定結果就像表6所示那樣，作為親本株的pdc1Δ0株導入了pTRS57的株在40小時生成3.6g/l的乳酸。在此，作為在反應40小時乳酸的生成比pdc1Δ0/pTRS57株更多的株，選擇在PDR13基因插入了轉座子的株(以下略記為pdr13::mTn株)。
表6
(實施例10PDR13基因插入突變株的制作和L-乳酸生產能力的評價) DNA堿基序列解析的結果表明實施例9取得的pdr13::mTn株，轉座子序列被插入到了從基因組DNA上的PDR13基因的起始密碼子開始第1599位與第1560位堿基間。為了再構建對PDR13基因的插入突變，通過以質粒pRS424為模板，使用包含序列編號33和34表示的堿基序列的DNA作為引物組的PCR，對在TRP1基因的5’上游添加了序列編號35表示的序列、3’下游添加了序列編號36表示的序列的DNA片段進行擴增。對PCR擴增片段進行純化，使用10μg該DNA對pdc1Δ0株進行色氨酸非缺陷型轉化。將得到的轉化株定為pdr13_1599株。然后使用實施例1中得到的pTRS48對pdr13_1599株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。將得到的轉化株定為pdr13_1599/pTRS48株。
將制作的重組株pdr13_1599/pTRS48株使用10mlSC-Ura培養基于30℃溫度振蕩培養過夜。將100μl的該培養液接種在10ml的SC-Ura培養基，于30℃溫度振蕩培養。于培養開始16小時后、24小時后和40小時后分別取1ml培養液樣品，對該培養液進行離心分離，測定上清的乳酸濃度。乳酸的定量使用F-kit(L-乳酸)(J·K International公司制)。結果如表7所示。
表7
(實施例11PDR13基因部分缺失株的制作和L-乳酸生產能力的評價) 制備缺失PDR13基因的1560堿基至1716堿基區域的突變株pdr13_100株，測定乳酸生產率。將pdc1Δ0/pTRS48株和pdr13_1599/pTRS48株用10ml的SC-Ura液體培養基于30℃溫度振蕩培養過夜。將100μl該培養液接種在10ml的新的SC-Ura液體培養基，從培養開始16小時后、24小時后和40小時后分別取1ml樣品，通過利用實施例5所述的HPLC的方法對乳酸的產量進行定量。
結果就像表8所示的那樣，與作為親本株的pdc1Δ0/pTRS48株相比乳酸生成量增加了。
表8
上述區域缺損株像以下那樣制作。通過以質粒pRS424為模板，使用包含序列編號33和37表示的堿基序列的DNA作為引物對進行PCR，使TRP1基因的5’上游添加了序列編號35表示的序列、3’下游添加了序列編號38表示的序列的DNA片段擴增。對PCR擴增片段進行純化，用該DNA1μg對pdc1Δ0株進行色氨酸非缺陷型轉化。將得到的轉化株定為pdr13_100株。然后用pTRS48對pdr13_100株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。將得到的轉化株定為pdr13_100/pTRS48株。
(實施例12PDR13基因部分缺失株的制作和L-乳酸生產能力的評價) 通過以質粒pRS423為模板，使用包含序列編號33和37表示的堿基序列的DNA作為引物對的PCR，使在HIS3基因的5’上游添加了序列編號35表示的序列、3’下游添加了序列編號38表示的序列的DNA片段擴增。純化PCR擴增片段，用該DNA1μg對實施例2得到的SW029株進行組氨酸非缺陷型轉化。將得到的轉化株定為Δpdr13100株。接下來用pTRS48對Δpdr13_100株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。將得到的轉化株定為pdr13_100/pTRS48株。
將制作的重組株pdr13_100/pTRS48株于10ml SC-Ura培養基在30℃溫度振蕩培養24小時。將10ml的該培養液接種至100ml的SC-Ura培養基，于30℃溫度振蕩培養24小時。將100ml的該培養液接種至2.0L的SC-Ura培養基，于30℃溫度使用小型發酵罐進行培養，對L-乳酸的產量進行定量。培養在以下的條件下進行。
·發酵裝置Bioneer-N(丸菱バイオエンジ公司制) ·培養溫度30℃ ·通氣量0.5vvm ·攪拌速度800轉/分鐘 ·pH5.0 ·中和劑2N NaOH溶液 結果如表9和表10所示的那樣，與作為親本株的Δpdc1/pTRS48株相比，L-乳酸的生成量增加了。
表9
表10
(實施例13具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母的制作) 利用同源重組制備將存在于NBRC10505株的基因組DNA的ADH1基因替換為URA3基因的酵母。通過以質粒pRS313為模板，使用包含序列編號43和序列編號44表示的堿基序列的DNA作為引物對的PCR，使在HIS3基因的5’上游添加了序列編號45表示的序列、3’下游添加了序列編號46表示的序列的DNA片段擴增。對擴增的DNA片段進行純化，用1μg該DNA對NBRC10505株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。將得到的轉化株定為Δadh1株。
然后以NBRC10505株的基因組DNA為模板，使用序列編號47與序列編號48所示的引物使含有ADH1基因的上游區700bp與ADH1結構基因、以及下游區200bp的DNA片段擴增。基因擴增用引物(序列編號47，48)按照在5末端側添加SacI識別序列、在3末端側添加SmaI識別序列那樣制作。將擴增的片段與pUC118的HincII/BAP處理片段連接。根據通用的方法得到目的質粒pUC118_ADH1。
然后將pUC118_ADH1用限制性酶SacI/SmaI切，對反應溶液進行瓊脂糖電泳。將約2kb的片段切出，從切出的凝膠提取DNA片段。將提取的DNA片段通過連接反應插入到pRS316，得到目的質粒pRS316_ADH1。
然后為了使用缺口修復法向質粒上的ADH1基因導入突變，對于pRS316_ADH1用限制性酶BalI與PflFI切，制作ADH1結構基因內缺失的開環質粒。限制性酶反應溶液進行瓊脂糖電泳，切出約7kb的片段，從切出的凝膠中提取DNA片段。再根據常法進行乙醇沉淀。
接下來，制作用于利用缺口修復法導入突變的突變導入ADH1基因片段。片段的制作使用序列編號49與50所示的引物和隨機突變導入用試劑盒BD多樣化PCR隨機誘變試劑盒(CLONTECH公司生產)進行。詳細操作根據附帶的說明書進行。得到的片段根據常法進行乙醇沉淀，濃縮至200ng/μl。
用得到的開環質粒500ng與突變導入ADH1基因片段1mg對Δadh1株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。作為宿主的Δadh1株由于是糖的吸收利用能力低下的株，所以在含有葡萄糖的培養基中不能很快生長。因此，轉化后，將在SC-Ura培養基上在第2天為止形成菌落的株當作處于導入的pRS316_ADH1的DNA上的突變型ADH1基因在培養的溫度具有醇脫氫酶活性的株進行挑選。
將挑選的具有pRS316_ADH1的轉化體按照每1板100個菌落程度那樣涂布在SC-Ura培養基上，于25℃培養48小時，將它復制在4塊新的SC-Ura平板培養基，于25℃、30℃、34℃、37℃進行培養，對生長狀況進行對比比較。將在30℃、34℃、37℃任一培養溫度都不生長的菌落當作質粒上的ADH1變成了溫度感受性的株進行分離。其中，取得了于34℃變為溫度感受性的酵母株“pADH1ts-1株”、“pADH1ts-2株”、“pADH1ts-3株”這3株。
對于得到的3株溫度感受性pADH1ts株，分別提取質粒。使用提取的質粒轉化大腸桿菌DH5α，根據常法從培養液取得質粒。將得到的質粒用限制性酶SacI/SmaI切，使用切斷溶液進行ΔADH1株的轉化。得到的培養液涂在YPAD平板培養基上，于25℃培養48小時。由于Δadh1株在含有葡萄糖的板不生長，生長的菌落當作Δadh1基因座重組了溫度感受性ADH1基因，將它作為溫度感受性ADH1基因被整合在染色體上的酵母(ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株)。
另外，對于得到的溫度感受性酵母ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株具有的溫度感受性ADH1ts基因座，確定DNA堿基序列，由該序列確定氨基酸序列，判明分別具有序列編號40、41、42所示的氨基酸一級序列。
(實施例14具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母的醇脫氫酶活性的測定) 對于實施例13得到的具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株，測定醇脫氫酶活性。將各株分別接種于20mL的YPD液體培養基，于30℃培養20小時。對培養液進行集菌，加50mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)200μl和玻璃珠(SIGMA公司生產，直徑0.6mm)0.2g，于4℃進行30分鐘渦旋。渦旋后通過離心分離收取上清。對于各個破碎液上清，以牛IgG(1.38mg/mL，BioRad公司制)作為標準制作的校準線為基礎通過BCA蛋白測試試劑盒(Pierce公司生產)進行測定，確定蛋白質濃度。
然后測定各株的醇脫氫酶活性。活性測定是通過在含有53mM磷酸鉀緩沖液(pH7.0)、20mM丙酮酸鈉、0.19mM還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、0.21mM硫胺素焦磷酸、5.3mM氯化鎂的反應液190μl中添加10μl得到的上清，通過分光光度計(Ultraspec3300Pro，Amersham Bioscience公司制)測定添加后于波長340nm處的吸光度的變化。將得到的吸光度變化量相當于上面式(2)的Δ340nm，通過將醇脫氫酶活性分別用各個蛋白質濃度除，算出各醇脫氫酶比活性。結果如表11所示。
(比較例5野生型酵母的醇脫氫酶活性的測定) 然后對于NBRC10505，與實施例14同樣測定醇脫氫酶活性。測定結果如表11所示。
表11
根據表11所示的實施例14和比較例5的結果判明實施例13中得到的具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母(ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株)在30℃的醇脫氫酶活性比野生株(NBRC10505株)低。
(實施例15通過具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母進行乳酸發酵) 向實施例13中制作的轉化體導入L-ldh基因，使用得到的酵母利用小型發酵罐進行發酵試驗，測定L-乳酸產量，測定具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母的乳酸產量和乙醇產量。
在本實施例中，作為L-ldh基因使用具有序列編號1所示的核酸序列的來自人的L-ldh基因。
用與實施例4同樣的方法，制備將來自人的L-ldh基因分別導入到ADH1ts-1株、ADH1ts-2株、ADH1ts-3株染色體上PDC1基因啟動子下游的轉化株。另外，來自人的L-ldh基因被導入到染色體上PDC1基因啟動子下游的酵母的確認也用與實施例4同樣的方法進行。以下將上述來自人的L-ldh基因導入到染色體上PDC1基因啟動子的下游的轉化株分別定為ADH1ts-1-L株、ADH1ts-2-L株、ADH1ts-3-L株。
將10mL乳酸發酵培養基加到試管中，然后接種少量ADH1ts-1-L株、ADH1ts-2-L株、ADH1ts-3-L株，于30℃、120轉/分鐘振蕩培養過夜，作為前前培養液。然后，將100mL新鮮的乳酸發酵培養基加到500mL容量的三角燒瓶中，將各前前培養液全量接種，于30℃振蕩培養24小時(前培養)。然后使用加入了1L乳酸發酵培養基的小型發酵罐進行培養，對L-乳酸的產量進行定量。使用小型發酵罐的培養按照以下條件進行。
·發酵裝置Bioneer-N(丸菱バイオエンジ公司生產) ·培養溫度30℃ ·通氣量0.1vvm ·攪拌速度120轉/分鐘 ·pH5.0 ·中和劑1N NaOH溶液 收集培養開始后40小時的培養液，測定L-乳酸和乙醇產量。另外，乙醇產量的測定使用Shimadzu GC-2010毛細管GC TC-1(GL science)15meter L.*0.53mm I.D.，df＝1.5μm，通過氫焰離子化檢測器檢測、評價。這些結果如表12所示。
(比較例6通過具有野生型ADH1基因的酵母進行乳酸發酵) 使用實施例4制作的具有野生型醇脫氫酶的L5株與實施例15同樣通過小型發酵罐進行發酵試驗，測定L-乳酸產量和乙醇產量。這些結果如表12所示。
(實施例16通過具有在培養溫度32℃的溫度感受性突變型ADH1基因的酵母進行乳酸發酵) 使用實施例15中制作的轉化體ADH1ts-1-L株，在ADH1ts-1-L株具有的醇脫氫酶表現出溫度感受性的培養溫度32℃利用小型發酵罐進行發酵試驗，測定L-乳酸產量，測定具有溫度感受性突變型ADH1基因的酵母的乳酸產量與乙醇產量。
將10mL乳酸發酵培養基加到試管中，然后接種少量ADH1ts-1-L株，于30℃、120轉/分鐘振蕩培養過夜，作為前前培養液。然后，將100mL新鮮的乳酸發酵培養基加到500mL容量的三角燒瓶中，將各前前培養液全量接種，于30℃振蕩培養24小時(前培養)。然后使用加入了1L乳酸發酵培養基的小型發酵罐進行培養，對L-乳酸的產量進行定量。培養按照以下條件進行。
·發酵裝置Bioneer-N(丸菱バイオエンジ公司生產) ·培養溫度32℃ ·通氣量0.1vvm ·攪拌速度120轉/分鐘 ·pH5.0 ·中和劑1N NaOH溶液 采取培養開始后40小時的培養液，測定L-乳酸和乙醇產量。結果如表12所示。
表12
就像表12所示那樣，具有本發明的溫度感受性突變型ADH1基因的酵母(ADH1ts-1-L株、ADH1ts-2-L株、ADH1ts-3-L株)在培養溫度30℃培養(實施例15)來說，與具有野生型醇脫氫酶的酵母(L5株)在同樣溫度培養(比較例6)比較，確認獲得了L-乳酸產量上升，乙醇產量降低的效果。
另外就具有本發明的溫度感受性突變型ADH1基因的酵母(ADH1ts-1-L株)在培養溫度32℃培養(實施例16)來說，與培養溫度30℃的發酵試驗結果(實施例15)相比，確認獲得了L-乳酸產量進一步上升，乙醇產量降低的效果。
(實施例17Δpdc1、Δpdc5二重缺失株的制作) 像下述那樣制作缺失了存在于NBRC10506株的基因組DNA上的PDC5基因的酵母。通過以質粒pRS406作為擴增模板，寡核苷酸(序列編號54，55)作為引物組的PCR對1.3kb的URA3基因DNA片段進行擴增。對擴增的DNA片段進行純化，用該DNA片段對NBRC10506株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。得到的轉化細胞應當是基因組DNA上的PDC5基因被URA3基因替換的Δpdc5缺失株。為了確認是否替換，通過對以基因組DNA作為擴增模板，序列編號56和序列編號57表示的寡核苷酸作為引物組的PCR得到的擴增產物進行瓊脂糖電泳。當基因組DNA上的PDC5基因被URA3基因替換時，可得到1.2kb的擴增產物。而當沒有被替換時，可得到1.9kb產物。根據得到的1.2kb產物，將該轉化體定為PDC5基因缺失的SW011株。Δpdc1Δpdc5二重缺失株像下面那樣制作。使上述得到的SW011株和實施例2中得到的SW029株接合獲得2倍體細胞。使該2倍體細胞在子囊形成培養基中形成子囊。用顯微操作設備解剖子囊，用YPAG培養基使各個胞子生長，得到各自的一倍體細胞。對得到的一倍體細胞的營養缺陷型進行研究。目的Δpdc1Δpdc5二重缺失株應當表現出尿嘧啶和色氨酸非缺陷型。研究營養供給性的結果顯示尿嘧啶和色氨酸非缺陷型。通過以得到的尿嘧啶和色氨酸非缺陷型株的基因組DNA作為擴增模板，序列編號58與序列編號59表示的寡核苷酸、以及序列編號56與序列編號57表示的寡核苷酸作為引物組的PCR可確認PDC1基因和PDC5基因被缺失。將這個Δpdc1Δpdc5二重缺失株定為SW012株。確認SW012株在以葡萄糖作為唯一碳源不能生長。
通過以質粒pRS403作為擴增模板，以序列編號54和序列編號55表示的寡核苷酸作為引物組的PCR對1.3kb的HIS3基因DNA片段進行擴增。對擴增的DNA片段進行純化、用該DNA片段對NBRC10506株進行組氨酸非缺陷型轉化。得到的轉化細胞應當為基因組DNA上的PDC5基因被HIS3基因替換的Δpdc5缺失株。為了確認，對通過以基因組DNA作為擴增模板，序列編號56和序列編號57表示的寡核苷酸作為引物組的PCR得到的擴增產物進行電泳。當基因組DNA上的PDC5基因被HIS3基因替換時可得到1.3kb的擴增產物。而當未被替換時可得到1.9kb產物。根據得到的1.3kb產物可將該轉化體定為pdc5缺失的SW013株。Δpdc1Δpdc5二重缺失株像下面那樣制作。使上述得到的SW013株和實施例2中得到的SW029株接合，得到2倍體細胞。使該2倍體細胞在子囊形成培養基形成子囊。用顯微操作設備解剖子囊，在YPAG培養基中使各個子囊生長，得到各自的一倍體細胞。對得到的一倍體細胞的營養缺陷型進行研究。目的Δpdc1Δpdc5二重缺失株應當表現出組氨酸和色氨酸非缺陷型。研究營養供給性的結果表明通過以得到的組氨酸和色氨酸非缺陷型株的基因組DNA作為擴增模板，序列編號58與序列編號59表示的寡核苷酸、以及序列編號56與序列編號57表示的寡核苷酸作為引物組的PCR可確認PDC1和PDC5基因缺失。將該Δpdc1Δpdc5二重缺失株定為SW014株。確認SW014株在以葡萄糖作為唯一碳源不能生長。
(實施例18pdc5溫度感受性突變基因的取得) 通過以BY4741株的基因組DNA作為模板，序列編號60與序列編號61表示的寡核苷酸作為引物組的PCR可得到含有PDC5基因的2.7kb的擴增DNA片段。將該片段用NotI消化，插入到預先用NotI消化的質粒pRS316的NotI間隙。用得到的質粒pRS316-PDC5對SW013株進行尿嘧啶非缺陷型轉化。確認該轉化體以葡萄糖作為唯一碳源，生長能力恢復，而且在37℃下具有生長能力。利用常法從該轉化體回收質粒pRS316-PDC5，利用常法確定插入到pRS316的2.7kb的堿基序列，確認pRS316-PDC5含有PDC5基因。
然后通過以質粒pRS316-PDC5作為擴增模板，序列編號62與序列編號63表示的寡核苷酸作為引物組，使用BD多樣化PCR隨機誘變試劑盒(Clonetech公司生產)的PCR得到編碼PDC5的1.7kb的擴增DNA片段。通過使用該試劑盒的PCR，在DNA擴增時導入突變頻率變高，上述得到的1.7kb片段與通過通常的PCR得到的片段比較，含有含突變的片段的頻率高。用得到的1.7kb片段與將質粒pRS316-PDC5用限制性酶Van91I、Bpu1102I消化成線性的質粒片段對SW014株進行尿嘧啶非缺陷型轉化，通過使用SC-Ura培養基，于25℃保溫，選擇生長的轉化體。通過應用缺口修復法的方法引起上述1.7kb片段與線性化質粒同源重組，只有獲得了再環化的質粒的細胞在生長。將得到的轉化體群體在新鮮的SC-Ura培養基中繁殖，于34℃保溫。在繁殖的轉化體群體中，選擇2株在34℃不生長的轉化體，作為pdc5溫度感受性突變pdc5ts-9、和pdc5ts-11。利用常法從該轉化體回收質粒，確定對應于上述1.7kb擴增DNA片段的堿基序列。結果表明pdc5ts-9是序列編號52表示的結構基因DNA的第1697位的堿基由C替換為T的一堿基替換突變，而pdc5ts-11是序列編號53表示的結構基因DNA的第701位的堿基由C替換為T的一堿基替換突變。將各個該質粒定為具有pdc5溫度感受性突變等位基因的pRS316-pdc5ts9和pRS316-pdc5ts11。
(實施例19pdc5ts突變株的制作) 將質粒pRS316-pdc5ts9和pRS316-pdc5ts11用NotI消化，得到含有pdc5ts9和pdc5ts11突變基因的2.7kb片段。用該片段對SW012株進行尿嘧啶缺陷型轉化，選擇在5-FOA培養基于25℃保溫時生長的轉化體。將得到的轉化體群體在新鮮的SC培養基繁殖，于34℃保溫。在繁殖的轉化體群體中選擇于34℃下不生長的轉化體，定為pdc5ts9溫度感受性突變株SW015株、pdc5ts11溫度感受性突變株SW016株。
(實施例20pdc5ts突變株的諸性質) 對PDC野生型株、Δpdc1缺失株和Δpdc1pdc5溫度感受性株的PDC活性進行測定。
(a)從菌體提取蛋白質 從瓊脂培養基上分別取少量NBRC10505株、SW029株、SW015株和SW016株，接種到3mL的YPD液體培養基，培養過夜(前培養)。在20mL新的YPD液體培養基中以1％接種量接種前培養液，使用100mL容量的坂口燒瓶于30℃溫度振蕩培養24小時(本培養)。通過對10mL本培養液進行離心分離集菌，用10mL的磷酸緩沖液清洗后，懸浮于1mL的磷酸緩沖液。將上述菌體懸濁液移至Eppendorf管，再加等量的玻璃珠(SIGMA公司生產、直徑0.6mm)，使用MicroTubeMixer(TOMY公司生產)于4℃破碎菌體。通過這樣操作破碎菌體后，將離心分離得到的上清作為PDC酶液。
(b)PDC活性測定 以牛IgG(1.38mg/mL、BIO-RAD公司生產)作為標準制作的校準線為基礎，使用BCA蛋白測試試劑盒(PIERCE公司生產)測定上述(a)中得到的PDC酶液的濃度，用滅菌水按照各個PDC酶液終濃度達到2mg/mL那樣進行稀釋。然后，按照表13給出的比例將除去PDC酶液和NADH的混合液分注到半微量比色杯，在開始測定前加PDC酶液和NADH，并混合。
表13

用分光光度計(Ultrospec3300Pro，Amersham公司生產)測定各PDC酶液在340nm處吸光度的減少，將得到的Δ340值帶入式(1)，就5mM丙酮酸鈉算出各PDC的比活性。結果如表14所示。
表14
上述結果表明具有突變型PDC5基因的pdc5ts9溫度感受性突變株SW015株、pdc5ts11溫度感受性突變株SW016株的PDC比活性為NBRC10505株的1/3以下，而且比SW029株更低，通過取得PDC5基因的溫度感受性突變酵母，可以得到PDC比活性低下的酵母。
(實施例21使用pdc5溫度感受性突變株的乳酸發酵試驗(1)) 進行上述取得的pdc5溫度感受性突變株的乳酸發酵試驗。通過使用實施例1中得到的來自人的L-ldh基因表達質粒pTRS48對SW015株和SW016株進行尿嘧啶非缺陷型轉化，將來自人的L-ldh基因導入pdc5溫度感受性突變株。乳酸發酵試驗使用表1所示的乳酸發酵培養基。
產物乳酸的濃度的評價通過實施例5所述的HPLC法進行。
另外，L-乳酸的光學純度測定在以下條件下通過HPLC法測定。
柱TSK-gel Enantio L1(東曹公司生產) 移動相1mM硫酸銅水溶液 流速1.0ml/分鐘 檢測方法UV254nm 溫度30℃。
而L-乳酸的光學純度用下式計算。
光學純度(％)＝100×(L-D)/(L+D) 其中，L表示L-乳酸的濃度、D表示D-乳酸的濃度。
葡萄糖濃度測定使用葡萄糖Test Wako C(和光純藥)。
以下給出了乳酸發酵試驗條件。
發酵裝置Bioneer-N(丸菱バイオエンジ公司生產) 培養基1L乳酸發酵培養基 培養溫度30℃ 通氣量100ml/分鐘 攪拌速度2001/分鐘 pH5.0 中和劑1N NaOH溶液。
首先，將pTRS48轉化的SW015和SW016株在試管于5ml的乳酸發酵培養基振蕩培養過夜(前前培養)。將前前培養液接種到100ml新鮮的乳酸發酵培養基，用500ml容量的坂口燒瓶振蕩培養24小時(前培養)。將前培養液接種到發酵裝置，進行乳酸發酵試驗。結果如表15所示。
(實施例22使用pdc5溫度感受性突變株的乳酸發酵試驗(2)) 對上述取得的pdc5溫度感受性突變株進行乳酸發酵試驗。通過用實施例1中得到的來自蛙的L-ldh基因表達質粒pTRS102轉化SW015株、和SW016株，導入來自蛙的L-ldh基因。乳酸發酵試驗中對表1所示的乳酸發酵培養基進行高壓蒸氣滅菌(121℃、15分)。
產物乳酸濃度的評價通過實施例5所述的HPLC法進行。
而L-乳酸的光學純度測定通過實施例21所述的HPLC法進行。
首先，將經pTRS102轉化的SW015和SW016株在試管中于5ml的乳酸發酵培養基振蕩培養過夜(前前培養)。將前前培養液接種于100ml新鮮的乳酸發酵培養基，用500ml容量的坂口燒瓶振蕩培養24小時(前培養)。于發酵裝置中接種前培養液，進行乳酸發酵試驗。其結果如表15所示。
(比較例7使用PDC5野生型株的乳酸發酵(1)) 另外，作為對照比較例，進行使用PDC5野生型株的發酵試驗。使用實施例3中得到的SW029/pTRS48，在與pdc5溫度感受性突變株同樣的條件下進行發酵試驗。試驗結果如表15所示。
(比較例8使用PDC5野生型株的乳酸發酵(2)) 進一步地，作為對照比較例使用實施例3中得到的SW029/pTRS102，在與pdc5溫度感受性突變株同樣的條件下進行發酵試驗。試驗結果如表15所示。
表15
以上結果表明如果使用導入了來自人或蛙的L-ldh基因的pdc5ts9溫度感受性突變株SW015株、pdc5ts11溫度感受性突變株SW016株進行乳酸發酵，與使用PDC5基因缺失的SW029株相比，乳酸的對糖收率提高了。這表明通過使用本發明的具有突變型PDC5基因的比活性低下的酵母可以有效地進行乳酸的生產。
產業上利用的可能性 本發明的酵母以及通過使用該酵母的乳酸的制造方法得到的乳酸可用在酒、豆醬、醬油、咸菜、乳制品等釀造制品以及作為代替檸檬酸、酒石酸的酸味料用于清涼飲料、醫藥品等中，具有廣泛用途。另外，在樹脂領域中，非常適合作為聚乳酸的原料，是極其有用的物質。
如果使用本發明的酵母、以及用該酵母制造乳酸的制造法來制造乳酸，由于可以有效地制造有廣泛用途的乳酸，所以可以提供價格更便宜的乳酸。
序列表
<110>東麗株式會社
<120>酵母和L-乳酸的制造方法
<130>06042
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
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<210>2
<211>999
<212>DNA
<213>非洲爪蟾(Xenopus laevis)
<400>2
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<210>3
<211>999
<212>DNA
<213>牛(Bos taurus)
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tatttttcgt tacataaaaa tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc 60
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<213>釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>22
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gtcagagaaa aactatacac tttgggtacc aagttgatgt aa 1602
<210>23
<211>533
<212>PRT
<213>釀酒酵母
<400>23
Met Lys Tyr Met Val Val Ser Ser Pro Ile Gln Glu Val Leu Arg Leu
1 5 10 15
His Lys Tyr Ile Glu Ile Ser Thr Thr Thr Ile Thr Val Lys Ile Thr
20 25 30
Asn Lys Met Ser Ser Pro Val Ile Gly Ile Thr Phe Gly Asn Thr Ser
35 4045
Ser Ser Ile Ala Tyr Ile Asn Pro Lys Asn Asp Val Asp Val Ile Ala
50 55 60
Asn Pro Asp Gly Glu Arg Ala Ile Pro Ser Ala Leu Ser Tyr Val Gly
65 70 75 80
Glu Asp Glu Tyr His Gly Gly Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ile Arg Asn
85 90 95
Pro Lys Asn Thr Ile Ile Asn Phe Arg Asp Phe Ile Gly Leu Pro Phe
100 105 110
Asp Lys Cys Asp Val Ser Lys Cys Ala Asn Gly Ala Pro Ala Val Glu
115 120 125
Val Asp Gly Lys Val Gly Phe Val Ile Ser Arg Gly Glu Gly Lys Glu
130 135 140
Glu Lys Leu Thr Val Asp Glu Val Val Ser Arg His Leu Asn Arg Leu
145 150 155 160
Lys Leu Ala Ala Glu Asp Tyr Ile Gly Ser Ala Val Lys Glu Ala Val
165 170 175
Leu Thr Val Pro Thr Asn Phe Ser Glu Glu Gln Lys Thr Ala Leu Lys
180 185 190
Ala Ser Ala Ala Lys Ile Gly Leu Gln Ile Val Gln Phe Ile Asn Glu
195 200 205
Pro Ser Ala Ala Leu Leu Ala His Ala Glu Gln Phe Pro Phe Glu Lys
210 215 220
Asp Val Asn Val Val Val Ala Asp Phe Gly Gly Ile Arg Ser Asp Ala
225 230 235 240
Ala Val Ile Ala Val Arg Asn Gly Ile Phe Thr Ile Leu Ala Thr Ala
245 250 255
His Asp Leu Ser Leu Gly Gly Asp Asn Leu Asp Thr Glu Leu Val Glu
260 265 270
Tyr Phe Ala Ser Glu Phe Gln Lys Lys Tyr Gln Ala Asn Pro Arg Lys
275 280 285
Asn Ala Arg Ser Leu Ala Lys Leu Lys Ala Asn Ser Ser Ile Thr Lys
290 295 300
Lys Thr Leu Ser Asn Ala Thr Ser Ala Thr Ile Ser Ile Asp Ser Leu
305 310 315 320
Ala Asp Gly Phe Asp Tyr His Ala Ser Ile Asn Arg Met Arg Tyr Glu
325 330 335
Leu Val Ala Asn Lys Val Phe Ala Gln Phe Ser Ser Phe Val Asp Ser
340 345 350
Val Ile Ala Lys Ala Glu Leu Asp Pro Leu Asp Ile Asp Ala Val Leu
355 360 365
Leu Thr Gly Gly Val Ser Phe Thr Pro Lys Leu Thr Thr Asn Leu Glu
370 375 380
Tyr Thr Leu Pro Glu Ser Val Glu Ile Leu Gly Pro Gln Asn Lys Asn
385 390 395 400
Ala Ser Asn Asn Pro Asn Glu Leu Ala Ala Ser Gly Ala Ala Leu Gln
405 410 415
Ala Arg Leu Ile Ser Asp Tyr Asp Ala Asp Glu Leu Ala Glu Ala Leu
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Ile Gly Ala Lys Gly Glu Phe His Pro Val Leu Leu Ala Glu Thr Ser
450 455 460
Phe Pro Val Gln Lys Lys Leu Thr Leu Lys Gln Ala Lys Gly Asp Phe
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Leu Ile Gly Val Tyr Glu Gly Asp His His Ile Glu Glu Lys Thr Leu
485 490 495
Glu Pro Ile Pro Lys Glu Glu Asn Ala Glu Glu Asp Asp Glu Ser Glu
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Gly Thr Lys Leu Met
530
<210>24
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>24
atgcggtacc gtgatgaggc tcgtggaaaa 30
<210>25
<211>66
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>25
tgcttataaa actttaacta ataattagag attaaatcgc gatatctttg attgatttga 60
ctgtgt66
<210>26
<211>530
<212>DNA
<213>釀酒酵母
<400>26
atgcggtacc gtgatgaggc tcgtggaaaa aatgaataat ttatgaattt gagaacaatt 60
ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat aatcaatcaa ttgaggattt tatgcaaata120
tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt acttttcttc ataattgcat aatattgtcc180
gctgcccctt tttctgttag acggtgtctt gatctacttg ctatcgttca acaccacctt240
attttctaac tatttttttt ttagctcatt tgaatcagct tatggtgatg gcacattttt300
gcataaacct agctgtcctc gttgaacata ggaaaaaaaa atatataaac aaggctcttt360
cactctcctt gcaatcagat ttgggtttgt tccctttatt ttcatatttc ttgtcatatt420
cctttctcaa ttattatttt ctactcataa cctcacgcaa aataacacag tcaaatcaat480
caaagatatc gcgatttaat ctctaattat tagttaaagt tttataagca 530
<210>27
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>27
gatatcgcga tttaatctct aattattagt 30
<210>28
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>28
atgcggtacc gcaccaagtg gcgtagaaat 30
<210>29
<211>482
<212>DNA
<213>釀酒酵母
<400>29
gatatcgcga tttaatctct aattattagt taaagtttta taagcatttt tatgtaacga 60
aaaataaatt ggttcatatt attactgcac tgtcacttac catggaaaga ccagacaaga120
agttgccgac agtctgttga attggcctgg ttaggcttaa gtctgggtcc gcttctttac180
aaatttggag aatttctctt aaacgatatg tatattcttt tcgttggaaa agatgtcttc240
caaaaaaaaa accgatgaat tagtggaacc aaggaaaaaa aaagaggtat ccttgattaa300
ggaacactgt ttaaacagtg tggtttccaa aaccctgaaa ctgcattagt gtaatagaag360
actagacacc tcgatacaaa taatggttac tcaattcaaa actgccagcg aattcgactc420
tgcaattgct caagacaagc tagttgtcgt agatttctac gccacttggt gcggtaccgc480
at 482
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
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atgcggtacc gtgatgaggc tcgtggaaaa aatgaataat ttatgaattt gagaacaatt 60
ttgtgttgtt acggtatttt actatggaat aatcaatcaa ttgaggattt tatgcaaata120
tcgtttgaat atttttccga ccctttgagt acttttcttc ataattgcat aatattgtcc180
gctgcccctt tttctgttag acggtgtctt gatctacttg ctatcgttca acaccacctt240
attttctaac tatttttttt ttagctcatt tgaatcagct tatggtgatg gcacattttt300
gcataaacct agctgtcctc gttgaacata ggaaaaaaaa atatataaac aaggctcttt360
cactctcctt gcaatcagat ttgggtttgt tccctttatt ttcatatttc ttgtcatatt420
cctttctcaa ttattatttt ctactcataa cctcacgcaa aataacacag tcaaatcaat480
caaagatatc gcgatttaat ctctaattat tagttaaagt tttataagca tttttatgta540
acgaaaaata aattggttca tattattact gcactgtcac ttaccatgga aagaccagac600
aagaagttgc cgacagtctg ttgaattggc ctggttaggc ttaagtctgg gtccgcttct660
ttacaaattt ggagaatttc tcttaaacga tatgtatatt cttttcgttg gaaaagatgt720
cttccaaaaa aaaaaccgat gaattagtgg aaccaaggaa aaaaaaagag gtatccttga780
ttaaggaaca ctgtttaaac agtgtggttt ccaaaaccct gaaactgcat tagtgtaata840
gaagactaga cacctcgata caaataatgg ttactcaatt caaaactgcc agcgaattcg900
actctgcaat tgctcaagac aagctagttg tcgtagattt ctacgccact tggtgcggta960
ccgcat 966
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<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
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gaagggacaa ccaggacgta20
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
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tagagattgt actgagagtg cac83
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
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ctgtgcggta tttcacaccg 80
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>合成的DNA
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tag 63
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<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>36
gaattgggaa ttaaaaacgc taacggtgtt gaaattatct ttaacattaa caaagacggt 60
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>37
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ctgtgcggta tttcacaccg 80
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成的DNA
<400>38
agcgctctaa gaaaaacggt atgtatacgt atatagaaaa atacatacat gatggaacta 60
<210>39
<211>348
<212>PRT
<213>Saccharomyces cerevisiae
<400>39
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
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Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
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His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
Thr Arg Tyr Val Arg Ala Asn Gly Thr Thr Val Leu Val Gly Met Pro
260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Val Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
325 330 335
Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
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<210>40
<211>348
<212>PRT
<213>釀河槽酵母
<400>40
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
20 25 30
Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
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His Ala Trp His Gly Asp Trp Pro Leu Pro Val Lys Leu Pro Leu Val
50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
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Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Ser Cys Met Ala Cys Glu Tyr Cys Glu Leu Gly Asn Glu Ser Asn Cys
100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Thr Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
210 215 220
Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
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260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Ala Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
305 310 315 320
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<210>41
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<212>PRT
<213>釀酒酵母
<400>41
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Lys Ala Leu Lys Pro Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
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Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
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His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
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Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Ala Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
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Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
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Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys Met Glu Lys Gly
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Gln Ile Val Gly Arg Tyr Val Val Asp Thr Ser Lys
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<211>348
<212>PRT
<213>釀酒酵母
<400>42
Met Ser Ile Pro Glu Thr Gln Lys Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His
1 5 10 15
Gly Lys Leu Glu Tyr Lys Asp Ile Pro Val Pro Lys Pro Lys Ala Asn
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Glu Leu Leu Ile Asn Val Lys Tyr Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu
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50 55 60
Gly Gly His Glu Gly Ala Gly Val Val Val Gly Met Gly Glu Asn Val
65 70 75 80
Lys Gly Trp Lys Ile Gly Asp Tyr Ala Gly Ile Lys Trp Leu Asn Gly
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100 105 110
Pro His Ala Asp Leu Ser Gly Tyr Thr His Asp Gly Ser Phe Gln Gln
115 120 125
Tyr Ala Thr Ala Asp Ala Val Gln Ala Ala His Ile Pro Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Leu Ala Gln Val Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Ile Thr Val Tyr
145 150 155 160
Lys Ala Leu Lys Ser Ala Asn Leu Met Ala Gly His Trp Val Ala Ile
165 170 175
Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Gly Ser Leu Ala Val Gln Tyr Ala Lys
180 185 190
Ala Met Gly Tyr Arg Val Leu Gly Ile Asp Gly Gly Glu Gly Lys Glu
195 200 205
Glu Leu Phe Arg Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
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Glu Lys Asp Ile Val Gly Ala Val Leu Lys Ala Thr Asp Gly Gly Ala
225 230 235 240
His Gly Val Ile Asn Val Ser Val Ser Glu Ala Ala Ile Glu Ala Ser
245 250 255
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260 265 270
Ala Gly Ala Lys Cys Cys Ser Asp Val Phe Asn Gln Ala Val Lys Ser
275 280 285
Ile Ser Ile Val Gly Ser Tyr Val Gly Asn Arg Ala Asp Thr Arg Glu
290 295 300
Ala Leu Asp Phe Phe Ala Arg Gly Leu Val Lys Ser Pro Ile Lys Val
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325 330 335
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340 345
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ctacatataa 70
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<211>70
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>44
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tggccgcatc 70
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<211>50
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<213>釀酒酵母
<400>45
gcacaatatt tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca50
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<213>釀酒酵母
<400>46
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<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>49
atgtctatcc cagaaactca aaaag 25
<210>50
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<213>人工的
<220>
<223>引物
<400>50
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<213>釀酒酵母
<400>51
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aaaggtatga gatgggctgg taacgctaac gaattgaacg ctgcctatgc tgctgatggt180
tacgctcgta tcaagggtat gtcctgtatt attaccacct tcggtgttgg tgaattgtct240
gctttgaatg gtattgccgg ttcttacgct gaacatgtcg gtgttttgca cgttgttggt300
gttccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc atcatacctt gggtaacggt360
gacttcactg ttttccacag aatgtctgcc aacatttctg aaaccactgc catgatcact420
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ttggaaactc caattgactt gtctttgaag ccaaacgacg ctgaagctga agctgaagtt600
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cacggtcctc atgccgaata taatgaaatt caaggttggg accacttggc cttattgcca 1500
acttttggtg ctagaaacta cgaaacccac agagttgcta ccactggtga atgggaaaag 1560
ttgactcaag acaaggactt ccaagacaac tctaagatta gaatgattga agttatgttg 1620
ccagtctttg atgctccaca aaacttggtt aaacaagctc aattgactgc cgctactaac 1680
gctaaacaat aa 1692
<210>52
<211>1692
<212>DNA
<213>釀酒酵母
<400>52
atgtctgaaa taaccttagg taaatattta tttgaaagat tgagccaagt caactgtaac 60
accgtcttcg gtttgccagg tgactttaac ttgtctcttt tggataagct ttatgaagtc120
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ccagtctttg atgctccaca aaacttggtt aaacaagctc aattgactgc cgctactaac 1680
gctaaacaat aa 1692
<210>53
<211>1692
<212>DNA
<213>釀酒酵母
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<400>64
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gatttgaaaa ctggtaatgc tgtaaagggt gaatta 171權利要求
1.導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母。
2.權利要求1所述的酵母，其中編碼L-乳酸脫氫酶的基因是編碼來自人(Homo sapiens)的L-乳酸脫氫酶的基因。
3.權利要求1所述的酵母，其中編碼L-乳酸脫氫酶的基因是編碼來自非洲爪蟾(Xenopus laevis)的L-乳酸脫氫酶的基因。
4.權利要求1或2所述的酵母，其中編碼來自人的L-乳酸脫氫酶的基因是具有序列編號1所示核酸序列的基因。
5.權利要求1或3所述的酵母，其中編碼來自蛙的L-乳酸脫氫酶的基因是具有序列編號2所示的核酸序列的基因。
6.權利要求1～3中任一項所述的酵母，其中編碼L-乳酸脫氫酶的基因被導入到可表達編碼L-乳酸脫氫酶的基因的啟動子的下游。
7.權利要求1～3中任一項所述的酵母，其中編碼L-乳酸脫氫酶的基因是以可表達的狀態被導入到染色體上的丙酮酸脫羧酶1基因的啟動子下游。
8.權利要求1～3中任一項所述的酵母，其具有突變型PDR13基因，所述突變型PDR13基因包含對野生型PDR13基因的DNA序列的一部分通過缺失、插入或替換而被突變的、可翻譯成野生型PDR13基因編碼的蛋白質的一部分的DNA序列。
9.權利要求8所述的酵母，其中野生型PDR13基因的堿基序列包含序列編號64所示的堿基序列的基因。
10.權利要求8所述的酵母，其中突變型PDR13基因為包含序列編號22所示的堿基序列的基因。
11.權利要求8或9所述的酵母，其中野生型PDR13基因或突變型PDR13基因編碼的蛋白質的一部分包含序列編號23所示的氨基酸一級序列。
12.權利要求1～3中任一項所述的酵母，其是具有突變型醇脫氫酶的酵母，該突變型醇脫氫酶包含野生型醇脫氫酶的氨基酸序列的一部分被替換、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列，該突變型醇脫氫酶表現出通過改變培養溫度，細胞內的醇脫氫酶活性消失或降低的溫度感受性。
13.權利要求12所述的酵母，其中突變型醇脫氫酶當培養溫度在攝氏34度以上時表現出溫度感受性。
14.權利要求12所述的酵母，其中突變型醇脫氫酶當培養溫度在攝氏30度以上時表現出溫度感受性。
15.權利要求12所述的酵母，其中突變型醇脫氫酶是包含在序列編號39所示的野生型醇脫氫酶1的氨基酸序列中1個至數個氨基酸被替換、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列的突變型醇脫氫酶。
16.權利要求12所述的酵母，其中突變型醇脫氫酶是包含序列編號40、序列編號41或序列編號42中任一序列所示的氨基酸序列的突變型醇脫氫酶。
17.權利要求1～3任一項中所述的酵母，其中編碼丙酮酸脫羧酶1的基因缺失、具有包含編碼野生型丙酮酸脫羧酶5的基因的堿基序列的一部分被缺失、插入、替換和/或添加的堿基序列的突變型丙酮酸脫羧酶5基因。
18.權利要求17所述的酵母，其中酵母細胞內的丙酮酸脫羧酶的比活性降低到野生型酵母細胞內的比活性的3分之1以下。
19.權利要求17所述的酵母，其中突變型丙酮酸脫羧酶5是溫度感受性的。
20.權利要求17所述的酵母，其中突變型丙酮酸脫羧酶5在攝氏34度以上表現出溫度感受性。
21.權利要求17所述的酵母，其中編碼野生型丙酮酸脫羧酶5的基因的堿基序列是包含序列編號51所示的堿基序列的基因。
22.權利要求17所述的酵母，其中編碼突變型丙酮酸脫羧酶5的基因是包含序列編號52或53中任一序列所示的堿基序列的基因。
23.權利要求1～3中任一項所述的酵母，其中酵母屬于酵母屬(GenusSaccharomyces)。
(Saccharomyces cerevesiae)。
25.L-乳酸的制造方法，其包括培養權利要求1～24中任一項所述的酵母。
26.L-乳酸的制造方法，其包括在25～37℃對權利要求1～24中任一項所述的酵母進行培養。
27.L-乳酸的制造方法，其包括在30～34℃對權利要求1～24中任一項所述的酵母進行培養。
全文摘要
本發明的酵母是導入了編碼來自人或蛙的L-乳酸脫氫酶的基因的酵母。如果使用本發明的酵母以及用使用該酵母制造乳酸的制造法來制造乳酸，由于可以有效地制造有廣泛用途的乳酸，所以可以提供價格更便宜的乳酸。
文檔編號C12N1/21GK101287833SQ20068003831
公開日2008年10月15日 申請日期2006年9月4日 優先權日2005年10月14日
發明者澤井秀樹, 澤井健司, 園木和典, 畠平智子 申請人:東麗株式會社