專利名稱：一種高活力葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子酶學與生物技術，具體涉及一種高活力葡萄糖氧化酶的編碼基因，同時涉及該突變株編碼基因的制備方法。該突變基因編碼的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白，可以廣泛應用于食品、醫藥及生物等領域。

背景技術：
葡萄糖氧化酶是生物領域中最主要的工具酶之一。目前應用中使用的葡萄糖氧化酶的生產一般都采用黑曲霉和青霉屬菌株作生產菌，進行深層通風培養的方法制取。我國和美國常以點青霉和黃色青霉為生產菌種，日本則篩選出尼崎青霉作為常用菌種。
自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面，將其應用于血糖測定以來，GOD被廣泛應用于食品、飼料、醫藥等許多相關領域。
在食品工業中，由于氧的存在，引起許多不利于產品質量的化學反應，并為許多微生物生長創造了條件。目前，許多國家已將GOD作為工人的安全抗氧劑而廣泛應用于各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四個方面。利用其專一氧化酶的原理，制成葡萄糖氧化酶分析儀，能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量，指導生產[12]。
在醫藥工業中，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口腔疾病和牙病的發生[36]。此外，由于可以催化生成H2O2，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。
GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境，調節飼糧消化，促進動物生長。含葡萄糖氧化酶、乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑，可用于預防牲畜胃腸道感染、腹瀉，并有促進動物生長作用。
由于GOD具有廣泛的實用價值，隨著GOD在酵母中外源表達的成功，也有人利用定向進化的手段改造GOD，使酶活提高至原來的1.5倍，在熱穩定性、pH穩定性方面，也得到了性質改善的突變株。


發明內容
本發明的目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的編碼基因GOD-D401N/A574V，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列以及所述的序列編碼的突變酶，該突變酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。在黑曲霉GOD結構基因中通過over-lap PCR引入突變，連接于表達載體，生產高酶活GOD突變酶，該突變酶的酶活是野生型的3倍，同時也具有良好的熱穩定性和儲存穩定性。
本發明的另一個目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的制備方法，該方法是構建酵母表達載體，利用陰離子交換層析方法純化高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白，該方法簡便，成本低廉。
本發明的再一個目的在于提供一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白及其在食品和醫藥上的應用，即一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在酒中和茶葉保鮮中的應用。。
為了實現上述任務，本發明采用以下技術措施 本發明的一個目的是提供一種核苷酸序列，該序列編碼一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其特征在于與野生型相比GOD結構基因上具有1752位的G突變為A和2272位的C突變為T的點突變。由以下步驟制備 1.突變酶GOD-D401N/A574V突變點的引入 (1)設計兩對誘變引物，采用PCR定點突變法在GOD基因上把野生型GOD基因上1752位的G突變為A和2272位的C突變為T； (2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶SnaBI及NotI進行酶切，與經過相同酶切的質粒pPIC9k片段連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 2.鑒定重組質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V用酶切、PCR方法對重組質粒進行鑒定，并測序檢驗，由此得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 本發明命名所得編碼高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的編碼基因GOD-D401N/A574V具有如下特征 1.本發明所用的GOD野生型基因來自黑曲霉，長度為2303bp，其中結構基因長度為1752bp。
2.具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，與野生型相比在此結構基因上具有兩處點突變，即為1752位的G突變為A和2272位的C突變為T。
本發明的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白可用如下方法生產。該方法包括以下具體的操作按照常規實驗條件，如《分子克隆實驗手冊》(第三版)J.薩姆布魯克等編著，2003，北京科學出版社中所述的條件進行。
1.突變酶GOD-D401N/A574V突變點的引入 (1)設計兩對誘變引物，采用PCR定點突變法在GOD基因上把野生型GOD基因上G突變為A和2272位的C突變為T； (2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶SnaBI及NotI進行酶切，與經過相同酶切的質粒pPIC9k片段連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 2.鑒定重組質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V用酶切、PCR方法對重組質粒進行鑒定，并測序檢驗，由此得到具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列； 3.培養大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V，提取重組質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V； 4.限制性內切酶BglII酶切，膠回收純化大片段，即得到酵母轉化所需含突變基因的線性DNA； 5.電轉化法轉化畢赤酵母菌株GS115，得到突變酶GOD-D401N/A574V的生產菌株； 6.將步驟5中所得菌株轉入500mL MD培養基中培養至OD600＝1.2-1.5；離心收集酵母細胞，并將細胞用20mL MM培養基洗一次；將細胞分別轉入250mL MM培養基中誘導蛋白生成，每天向培養物中補加1％甲醇，培養4-5天；離心收取上清液； 7.將近500mL含有目標蛋白的培養物上清液超濾濃縮至20-30mL，濃縮液在0.02mol/L、pH6.27的磷酸二氫鈉緩沖液中透析除鹽24小時。蛋白質的純化采用Q SepharoseTM Fast Flow陰離子交換層析柱分離、純化，由此得到具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白； 8.以新鮮的Sigma公司商品GOD作標準曲線。用pH5.6、0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液配制2mg/mL葡萄糖、0.1mg/mL的ABTS和100U/mL辣根過氧化物酶溶液。在九十六孔板中分別加入100μL葡萄糖溶液、100μL的ABTS和辣根過氧化物酶溶液40μL，加入1μl培養液或酶液，測定OD414。
按照以上方法可以檢驗本發明要求保護的突變酶的活性。純度檢測可以用SDS-PAGE方法檢測。
注以上提到的酵母培養基配方如下 MD(L-1)酵母基本氮源培養基(YNB)1.7g，硫酸銨5g，葡萄糖20g，生物素400μg； MM(L-1)YNB 1.7g，硫酸銨5g，甲醇12mL，生物素400μg，酪蛋白水解物10g，pH5.6。
本發明獲得高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在食品、醫藥及生物等相關領域有著廣泛的應用。
1.在pH7.0的條件下，取上述所得葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶以及ABTS混合與磷酸緩沖液中，分別加入葡萄糖標準液或酒類樣品與之反應，根據標準曲線可得酒類中葡萄糖含量。本發明所保護的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的優勢在于其酶活是野生型的3倍以上，可以有效減少酶制劑的使用量。
2.葡萄糖氧化酶在茶葉保鮮中的應用將葡萄糖氧化酶與其底物葡萄糖混合在一起，包裝于不透水但透氣的薄膜袋中，密封后置于裝有茶葉的密閉容器內，當密閉容器內的氧氣透過薄膜進入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用下，與葡萄糖發生反應，從而去除密閉容器內的氧，防止茶葉被氧化而導致品質劣變。
葡萄糖氧化酶是一種廣泛應用的工具酶，在食品工業中主要用于除氧、去葡萄糖；在醫藥行業中主要用于血糖、尿糖的測定；在生物領域中，還可以制成相應的生物傳感器和酶電極，用于檢測葡萄糖濃度。
所述畢赤酵母表達載體pPIC9k和畢赤酵母菌株GS115均購自invitrogen公司。所述大腸桿菌DH5α購自TaKaRa公司。可以根據所用的表達載體選擇匹配的宿主細胞。所述重組質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V為本發明構建。所述大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V是具有質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的大腸桿菌菌株，保藏編號CCTCC NO M207085，保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2007年6月19日，分類命名大腸桿菌DH5α/GOD-D401N/A574V。所述編碼基因GOD-D401N/A574V是具有SEQUENCE NO.1的核苷酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因。所述蛋白GOD-D401N/A574V是具有SEQUENCE NO.2的氨基酸序列的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白。
本發明的優點和效果 本發明中提供的GOD突變株的核苷酸序列和蛋白質序列是一種GOD高酶活突變株的基因和蛋白質序列，未見報道。本株GOD突變株酶活是野生型酶活的2倍以上，同時也具有良好的熱穩定性和儲存穩定性，符合實際應用的要求。而葡萄糖氧化酶在食品、醫藥及生物等領域有著廣泛的應用，是生物傳感器領域最主要的工具酶，因此，獲得高酶活的GOD，具有很高的實用價值，特別是在生物傳感器的分析器件中，要在微小的面積上固定具有足夠催化活性的酶，酶活的高低顯得尤為重要。



圖1重組質粒的構建示意圖示意圖 (1)用PCR方法擴增出GOD基因； (2)設計兩對誘變引物，采用PCR定點突變法在GOD基因上把野生型GOD分子401位的Asp突變為Asn，574位的Ala突變為Val； (3)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶SnaBI及NotI進行酶切，與經過相同酶切的質粒pPIC9k片段連接后，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V； 圖2重組表達質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的PCR鑒定(b)和酶切鑒定(a)結果(1％瓊脂糖凝膠電泳)。
如圖2(b)所示，以上下游引物擴增出的條帶大小約為1800bp，與GOD結構基因大小一致。
大腸桿菌-酵母穿梭質粒pPIC9k大小約9.3kb，含有兩個Bgl II酶切位點。而GOD基因內部則無Bgl II酶切位點。將質粒pPIC9k-GOD用Bgl II酶切，電泳結果如圖2(a)中所示，Bgl II酶切pPIC9k-GOD得到2.4kb和8.7kb兩個片段，與推測值一致。以上結果證明高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因GOD-D401N/A574V已克隆到酵母表達載體pPIC9k。
圖3純化后的畢赤酵母菌株pPIC9kGOD-D401N/A574V誘導表達產生高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白(10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測)。
葡萄糖氧化酶單體分子量約為80kDa，與結果相符。
圖4與野生型的熱穩定性比較 在40℃中水浴保存50分鐘內，野生型和GOD-D401N/A574V酶活都沒有明顯損失，60分鐘時野生型酶活略有下降，而GOD-D401N/A574V的酶活沒有明顯下降。在50℃中1小時后，突變株GOD-D401N/A574V酶活降至原來的78％左右，而野生型酶活則降至原來的72％，兩者相近。60℃下10分鐘后，野生型和GOD-D401N/A574V酶活均大幅下降，一小時后，野生型降至原來的30％，GOD-D401N/A574V降至原有的20％左右。高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V具有良好的熱穩定性，能夠滿足實際應用的需要。
圖5與野生型的儲存穩定性比較 在4℃下，野生型和GOD-D401N/A574V具有較好的儲存穩定性，保存一個月后仍保留80％以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天時野生型有60％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍有80％活力剩余。在室溫(20-25℃)下長時間儲存時，野生型和GOD-D401N/A574V的酶活都呈現逐步下降趨勢。在保存的前25天，GOD-D401N/A574V酶活的下降略高于野生型酶。但在儲存后期，野生型酶活的下降更加明顯。在室溫下儲存一個月后，野生型和GOD-D401N/A574V都可保留65％以上的剩余活力，40天后，野生型僅40％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍然有60％活力剩余。
高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V與野生型相比具有良好的儲存穩定性，能夠滿足實際應用的需要。

具體實施例方式 下面結合實施例對本發明作進一步的詳細描述。實施例中的實驗方法，按常規條件進行，參考如薩姆布魯克等，分子克隆實驗指南(第二版，1992年，科學出版社)中所述實驗方法。
實施例1.高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白的獲得 圖1顯示了重組突變葡萄糖氧化酶基因的構建原理和過程。天然的成熟的葡萄糖氧化酶為同源二聚體，每個單體含583個氨基酸，基因長為1752bp左右。
1.突變酶GOD-D401N/A574V編碼基因中突變點的引入 (1)設計兩對誘變引物，采用PCR定點突變法在GOD基因上把野生型GOD基因上1752位的G突變為A和2272位的C突變為T； 設計葡萄糖氧化酶定點突變所需引物序列 上游引物5’-CCACTACGTAAGCAATGGCATTGAAG-3’ 下游引物5’-TATGCGGCCGCTCACTGCAT-3’ 定點突變引物 401s5′-AGAACTACCGCAACTGGATT-3′ 401a5′-CAATCCAGTTGCGGTAGTTC-3′ 574s5′TTTCGGATGTTATCTTGG 3′ 574a5′CCAAGATAACATCCGAAAT 3′ 先用上游引物與引物574a以連接有野生型葡萄糖氧化酶基因的pPIC9kGOD為模板，擴增出574的長片段，PCR循環條件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，30個循環；72℃7min。PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
用通用引物3’AOX1與574s以野生型葡萄糖氧化酶基因為模板，擴增出574的短片段，PCR循環條件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃20sec，30個循環；72℃5min。PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
然后將回收的兩種PCR產物混合，加入上、下游引物進行第二次PCR，PCR反應條件為94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，5個循環；94℃1min，54℃1min，72℃2min，30個循環；72℃7min。PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點A574V的葡萄糖氧化酶基因片段。
再用上游引物與引物574a以含有突變位點A574V的葡萄糖氧化酶基因片段為模板，擴增出401的長片段，PCR循環條件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min45sec，30個循環；72℃7min。PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
用下游引物與401s以含有突變位點A574V的葡萄糖氧化酶基因片段為模板，擴增出401的短片段，PCR循環條件94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃20sec，30個循環；72℃5min。PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。
然后將回收的兩種PCR產物混合，加入上、下游引物進行第二次PCR，PCR反應條件為94℃5min；94℃1min，60℃1min，72℃2min，5個循環；94℃1min，54℃1min，72℃2min，30個循環；72℃7min。PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收。得到含有突變位點D401N/A574V的葡萄糖氧化酶基因片段。
(2)上述PCR產物經膠回收純化后，用限制性內切酶SnaBI及NotI進行分步酶切，酶切產物用PCR產物回收試劑盒回收后，用T4連接酶與經過相同酶切的質粒pPIC9k片段連接，16℃連接過夜后連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，用氨芐青霉素(Amp)-LB平板篩選得到陽性菌落，經過鑒定(見下一步驟)，命名為大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V。
2.質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的鑒定 用質粒抽提試劑盒從陽性菌落DH5α/GOD-D401N/A574V培養物中提取質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V，用限制性內切酶BglII進行酶切，1％瓊脂糖凝膠電泳檢查，結果產生2.4Kb和8.7Kb兩條帶(如圖2a)，與預期大小相符。進一步用PCR進行鑒定，以重組質粒為模板，用上、下游引物進行PCR，可以得到大小為1.8kb的擴增帶(如圖2b)，與預期大小相符。
質粒上GOD-D401N/A574V基因的測序由英俊(invitrogen)生物技術有限公司進行。測序引物是利用pPIC9k質粒上的通用引物5’AOX1和3’AOX1，測序結果表明獲得的GOD-D401N/A574V基因序列與預期設計完全一致，由此得到SEQUENCE NO.1所示的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因GOD-D401N/A574V，GOD-D401N/A574V基因全長1752nt(包括終止密碼TGA)，編碼583個氨基酸的蛋白。將產生的質粒命名為pPIC9kGOD-D401N/A574V。
3.重組質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V的提取 將DH5α/GOD-D401N/A574V接種到LB培養基，37℃過夜培養，用質粒抽提試劑盒提取質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V。
4.限制性內切酶BglII酶切，膠回收純化大片段，即得到酵母轉化所需含突變基因的線性DNA。
5.電轉化法轉化畢赤酵母菌株GS115，經篩選和鑒定獲得畢赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V。
(1)GS115感受態細胞的制備 將GS115接于50mL液體YPD培養基中30℃培養過夜，再以2∶100的比例接種于500mlYPD中30℃培養至OD600＝1.2-1.5，4℃1500g離心收集細胞；用500mL冰冷的無菌水重懸細胞，4℃1500g離心收集細胞；再用250mL冰冷的無菌水重懸細胞，4℃1500g離心收集細胞；接著用40ml冰冷的1mol/L山梨醇重懸細胞，4℃1500g離心收集細胞；重懸細胞于1mL1mol/L山梨醇。
(2)重組質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V轉化GS115 100μL原生質體與5-10μg線性化質粒DNA(BglII切)混合，轉入冰冷的電轉杯，放置5分鐘；電擊細胞與DNA的混合物(1.5kv，4.2-4.9ms)；加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，繼續放置30min；再加入0.5mLSOS(0.3×YPD，1mol/L山梨醇)，30℃放置2小時，偶爾搖動志菌體不易沉淀；用1mol/L山梨醇稀釋菌體后涂布于固體MD培養基。30℃培養4-6天后挑取陽性菌落。經過實施例3鑒定，將能產生GOD-D401N/A574V蛋白的菌株命名為GS115/GOD-D401N/A574V。
6.畢赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V經甲醇誘導產生GOD-D401N/A574V蛋白 從上述MD平板中挑取GS115/GOD-D401N/A574V單菌落于20mL MD培養基中培養過夜；將培養物轉入500mL MD培養基中培養至OD600＝1.2-1.5；離心收集酵母細胞，并將細胞用20mL MM培養基洗一次；將細胞轉入250mL MM培養基中誘導蛋白生成，每天向培養物中補加1％甲醇，培養4-5天；離心收取上清液。
7.高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V純化 將近500mL含有目標蛋白的培養物上清液超濾濃縮至20-30mL，濃縮液在0.02mol/L、pH6.27的磷酸二氫鈉緩沖液中透析除鹽24小時，以保證陰離子交換柱的吸附性質。
蛋白質的純化采用Q SepharoseTM Fast Flow陰離子交換層析柱，柱子用20mM磷酸二氫鈉(pH6.3)平衡，上樣后，用20mM磷酸二氫鈉，0-0.2MNaCl(pH6.3)梯度洗脫，用核酸蛋白質檢測儀(波長280nm)監視收集，葡萄糖氧化酶最先直接從柱中流出(帶黃色)。由此得到分離純化的如SEQUENCENO.2所示的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V。
實施例2畢赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V表達的GOD-D401N/A574V蛋白的活性檢測以及其他酶學性質檢測 以新鮮的Sigma公司商品GOD作標準曲線。用pH5.6、0.1mol/L磷酸二氫鈉緩沖液配制2mg/mL葡萄糖、0.1mg/mL的ABTS和100U/mL辣根過氧化物酶溶液。在九十六孔板中分別加入100μL葡萄糖溶液、100μL的ABTS和辣根過氧化物酶溶液40μL，加入1μL培養液或酶液，反應3-5分鐘后測定OD414。
用Bio-Rad公司生產的蛋白質濃度測定試劑盒測定，以BSA作標準曲線。
計算酶比活
由上表可知，高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V酶活力是野生型的3倍，在酶活方面，有大幅提高。
熱穩定性分析 催化活性提高的突變體有時會伴隨熱穩定性的降低，將野生型和突變株酶液分別置于40℃、50℃、60℃下，每隔十分鐘取樣在室溫下測定剩余酶活，評價了酶的熱穩定性。結果見圖四。在40℃中水浴保存50分鐘內，野生型和GOD-D401N/A574V酶活都沒有明顯損失，60分鐘時野生型酶活略有下降，而GOD-D401N/A574V的酶活沒有明顯下降。在50℃中1小時后，突變株GOD-D401N/A574V酶活降至原來的78％左右，而野生型酶活則降至原來的72％，兩者相近。60℃下10分鐘后，野生型和GOD-D401N/A574V酶活均大幅下降，一小時后，野生型降至原來的30％，GOD-D401N/A574V降至原有的20％左右。高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V具有良好的熱穩定性，能夠滿足實際應用的需要。
儲存穩定性分析 將酶液保存在4℃和室溫(20-25℃)下，定期(每隔3-4天)取樣測定酶活，評價了酶的儲存穩定性。結果見圖五。
在4℃下，野生型和GOD-D401N/A574V具有較好的儲存穩定性，保存一個月后仍保留80％以上的催化活性，但30天后野生型活力下降速度加快，到40天時野生型有60％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍有80％活力剩余。在室溫(20-25℃)下長時間儲存時，野生型和GOD-D401N/A574V的酶活都呈現逐步下降趨勢。在保存的前25天，GOD-D401N/A574V酶活的下降略高于野生型酶。但在儲存后期，野生型酶活的下降更加明顯。在室溫下儲存一個月后，野生型和GOD-D401N/A574V都可保留65％以上的剩余活力，40天后，野生型僅40％活力剩余，而GOD-D401N/A574V仍然有60％活力剩余。
高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白GOD-D401N/A574V與野生型相比具有良好的儲存穩定性，能夠滿足實際應用的需要。
GOD-D401N/A574V在酶活提高的同時，仍然具有良好的熱穩定性和儲存穩定性，能夠滿足實際應用的要求。
實施例3葡萄糖氧化酶在酶法測定酒中葡萄糖含量中的應用 在pH7.0的條件下，取上述所得葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶以及ABTS混合與磷酸鈉緩沖液(0.1mol/L)中，其中葡萄糖氧化酶終濃度為10U/mL，辣根過氧化物酶終濃度為10U/mL，ABTS終濃度為0.1mg/mL。
取上述混合液3mL，分別加入葡萄糖標準液或酒類樣品0.5mL與之37℃水浴反應10min，測定其在414nm處的吸收。根據標準曲線可得酒類(白酒、紅酒、啤酒)中葡萄糖含量。本發明在含葡萄糖150mg/L以內，吸光度與樣品葡萄糖含量具有良好的正相關性。故測定范圍在0-150mg/L。
實施例4葡萄糖氧化酶在茶葉保鮮中的應用 將葡萄糖氧化酶與其底物葡萄糖以摩爾比1∶100000的比例混合在一起，包裝于不透水但透氣的薄膜袋中，密封后置于裝有茶葉的密閉容器內，加入量為每升6-8g混合物，當密閉容器內的氧氣透過薄膜進入袋中，在葡萄糖氧化酶的作用下，與葡萄糖發生反應，從而去除密閉容器內的氧，防止茶葉被氧化而導致品質劣變，茶葉的保質期延長至18-24個月。。
葡萄糖氧化酶是一種廣泛應用的工具酶，在食品工業中主要用于除氧、去葡萄糖；在醫藥行業中主要用于血糖、尿糖的測定；在生物領域中，還可以制成相應的生物傳感器和酶電極，用于檢測葡萄糖濃度。
SEQUENCE LISTING
<110>中國科學院武漢病毒研究所
<120>一種高活力葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應用
<130>一種高活力葡萄糖氧化酶的編碼基因及制備方法和應用
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<212>DNA
<213>Aspergillus niger
<400>1
gaattcggta ttctcggcat ggccaaagtc ggtatccctt ggcgccacga tgatttgcgt 60
ccaggattcg tatagttcct cgtccacgag ctgcctaccg tcagcgtgag gcagtgagct 120
aatatggggc caataagcca ctacgaggat gacatggcct ctacagaacg agagacgcag 180
aggatcagga cgccaatcct gcgctccacc tgtctaagga ttcgcttttg gactatccag 240
ggattatggc ttcggattat tgtattcggg ataccgacgg ctgagcacac ggaggatgag 300
gttcagctca cggcccctat cagtatgcat tatgaggatg gcttcttgga aagcagagga 360
attggattat cgaacaagtt ggttctggac cattgactcg agcgtataag taacctcgtt 420
cggtcctcct gtcaccttct gatcagcaac cagcctttcc tctctcattc cctcatctgc 480
ccatcatgca gactctcctt gtgagctcgc ttgtggtctc cctcgctgcg gccctgccac 540
actacatcag gagcaatggc attgaagcca gcctcctgac tgatcccaag gatgtctccg 600
gccgcacggt cgactacatc atcgctggtg gaggtctgac tggactcacc accgctgctc 660
gtctgacgga gaaccccaac atcagtgtgc tcgtcatcga aagtggctcc tacgagtcgg 720
acagaggtcc tatcattgag gacctgaacg cctacggcga catctttggc agcagtgtag 780
accacgccta cgagaccgtg gagctcgcta ccaacaatca aaccgcgctg atccgctccg 840
gaaatggtct cggtggctct actctagtga atggtggcac ctggactcgc ccccacaagg 900
cacaggttga ctcttgggag actgtctttg gaaatgaggg ctggaactgg gacaatgtgg 960
ccgcctactc cctccaggct gagcgtgctc gcgcaccaaa tgccaaacag atcgctgctg 1020
gccactactt caacgcatcc tgccatggtg ttaatggtac tgtccatgcc ggaccccgcg1080
acaccggcga tgactattct cccatcgtca aggctctcat gagcgctgtc gaagaccggg1140
gcgttcccac caagaaagac ttcggatgcg gtgaccccca tggtgtgtcc atgttcccca1200
acaccttgca cgaagaccaa gtgcgctccg atgccgctcg cgaatggcta cttcccaact1260
accaacgtcc caacctgcaa gtcctgaccg gacagtatgt tggtaaggtg ctccttagcc1320
agaacggcac cacccctcgt gccgttggcg tggaattcgg cacccacaag ggcaacaccc1380
acaacgttta cgctaagcac gaggtcctcc tggccgcggg ctccgctgtc tctcccacaa1440
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gcatcacctc tgctggtgca ggacagggac aggccgcttg gttcgccacc ttcaacgaga1620
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ccggtgccat gcagacctac ttcgctgggg agactatccc cggtgataac ctcgcgtatg2040
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aagattatgc ttccatgcag tga2303
<210>2
<211>583
<212>PRT
<213>Aspergillus niger
<400>2
Ser Asn Gly Ile Glu Ala Ser Leu Leu Thr Asp Pro Lys Asp Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Thr Val Asp Tyr Ile Ile Ala Gly Gly Gly Leu Thr Gly Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Ala Arg Leu Thr Glu Asn Pro Asn Ile Ser Val Leu Val
35 40 45
Ile Glu Ser Gly Ser Tyr Glu Ser Asp Arg Gly Pro Ile Ile Glu Asp
50 55 60
Leu Asn Ala Tyr Gly Asp Ile Phe Gly Ser Ser Val Asp His Ala Tyr
65 70 75 80
Glu Thr Val Glu Leu Ala Thr Asn Asn Gln Thr Ala Leu Ile Arg Ser
85 90 95
Gly Asn Gly Leu Gly Gly Ser Thr Leu Val Asn Gly Gly Thr Trp Thr
100105 110
Arg Pro His Lys Ala Gln Val Asp Ser Trp Glu Thr Val Phe Gly Asn
115 120 125
Glu Gly Trp Asn Trp Asp Asn Val Ala Ala Tyr Ser Leu Gln Ala Glu
130135 140
Arg Ala Arg Ala Pro Asn Ala Lys Gln Ile Ala Ala Gly His Tyr Phe
145 150 155 160
Asn Ala Ser Cys His Gly Val Asn Gly Thr Val His Ala Gly Pro Arg
165 170175
Asp Thr Gly Asp Asp Tyr Ser Pro Ile Val Lys Ala Leu Met Ser Ala
180 185190
Val Glu Asp Arg Gly Val Pro Thr Lys Lys Asp Phe Gly Cys Gly Asp
195 200205
Pro His Gly Val Ser Met Phe Pro Asn Thr Leu His Glu Asp Gln Val
210 215 220
Arg Ser Asp Ala Ala Arg Glu Trp Leu Leu Pro Asn Tyr Gln Arg Pro
225 230 235 240
Asn Leu Gln Val Leu Thr Gly Gln Tyr Val Gly Lys Val Leu Leu Ser
245 250 255
Gln Asn Gly Thr Thr Pro Arg Ala Val Gly Val Glu Phe Gly Thr His
260 265 270
Lys Gly Asn Thr His Asn Val Tyr Ala Lys His Glu Val Leu Leu Ala
275 280 285
Ala Gly Ser Ala Val Ser Pro Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Gly Ile Gly
290 295 300
Met Lys Ser Ile Leu Glu Pro Leu Gly Ile Asp Thr Val Val Asp Leu
305 310 315 320
Pro Val Gly Leu Asn Leu Gln Asp Gln Thr Thr Ala Thr Val Arg Ser
325330 335
Arg Ile Thr Ser Ala Gly Ala Gly Gln Gly Gln Ala Ala Trp Phe Ala
340345 350
Thr Phe Asn Glu Thr Phe Gly Asp Tyr Ser Glu Lys Ala His Glu Leu
355360 365
Leu Asn Thr Lys Leu Glu Gln Trp Ala Glu Glu Ala Val Ala Arg Gly
370375 380
Gly Phe His Asn Thr Thr Ala Leu Leu Ile Gln Tyr Glu Asn Tyr Arg
385390 395 400
Asn Trp Ile Val Asn His Asn Val Ala Tyr Ser Glu Leu Phe Leu Asp
405 410 415
Thr Ala Gly Val Ala Ser Phe Asp Val Trp Asp Leu Leu Pro Phe Thr
420 425430
Arg Gly Tyr Val His Ile Leu Asp Lys Asp Pro Tyr Leu His His Phe
435 440 445
Ala Tyr Asp Pro Gln Tyr Phe Leu Asn Glu Leu Asp Leu Leu Gly Gln
450455 460
Ala Ala Ala Thr Gln Leu Ala Arg Asn Ile Ser Asn Ser Gly Ala Met
465 470 475 480
Gln Thr Tyr Phe Ala Gly Glu Thr Ile Pro Gly Asp Asn Leu Ala Tyr
485 490 495
Asp Ala Asp Leu Ser Ala Trp Thr Glu Tyr Ile Pro Tyr His Phe Arg
500 505 510
Pro Asn Tyr His Gly Val Gly Thr Cys Ser Met Met Pro Lys Glu Met
515 520525
Gly Gly Val Val Asp Asn Ala Ala Arg Val Tyr Gly Val Gln Gly Leu
530 535 540
Arg Val Ile Asp Gly Ser Ile Pro Pro Thr Gln Met Ser Ser His Val
545 550 555 560
Met Thr Val Phe Tyr Ala Met Ala Leu Lys Ile Ser Asp Val Ile Leu
565 570575
Glu Asp Tyr Ala Ser Met Gln
580
權利要求
1.一種分離的高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白編碼基因，其序列為SEQ IDNO.1所示的核苷酸序列。
2.一種分離的蛋白質，其序列為SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.一種大腸桿菌，其特征在于大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α/GOD-D401N/A574V，CCTCC NO.M207085。
4.一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在酒中的應用。
5.一種高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在茶葉保鮮中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種高活力葡萄糖氧化酶突變體編碼基因及制備方法和應用。這種高活力葡萄糖氧化酶突變體的編碼基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，其編碼的蛋白具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，其步驟是首先設計兩對誘變引物；第二是獲得大腸桿菌菌株DH5α/GOD-D401N/A574V；第三是鑒定重組質粒pPIC9kGOD-D401N/A574V；第四是培養大腸桿菌菌株DH5α/GOD--D401N/A574V；第五是得到含突變基因的線性DNA；第六是獲得畢赤酵母菌株GS115/GOD-D401N/A574V；第七是誘導純化獲得目的蛋白。本發明方法易行，成本低廉，高酶活葡萄糖氧化酶突變株蛋白在食品糖類檢測和保鮮中的應用，具有很高的實用價值。
文檔編號C12N15/53GK101348794SQ20071005278
公開日2009年1月21日 申請日期2007年7月19日 優先權日2007年7月19日
發明者周亞鳳, 張先恩, 丹 劉, 郭永超, 張治平 申請人:中國科學院武漢病毒研究所