專利名稱：紅樹植物木欖金屬硫蛋白基因及其編碼的序列的制作方法
紅樹植物木欖金屬硫蛋白基因及其編碼的序列所屬領域本發明涉及基因工程領域，利用分子生物學基因技術分離一種新的植物金屬硫蛋白基因 及其所編碼多肽，以及該基因的應用方法。技術背景1957年Margoshe和vaJle首次在馬腎中發現并分離出金屬硫蛋白(metallothiondn MT) (Margoshes, M.， Vallee, B丄.,1957. A cadmium protein from equine kidney cortex. J. Am. Chem. Soc. 79,4813-4814)以來，科學家們相繼在植物(Purdue University, West Lafayette, IN 47907. Regulation and function of metallothionein genes in plants)、微生物以及海洋生物中發現和證明 了具有相似結構和生理功能基本一致的金屬硫蛋白(Classification of Metallothionein, P,A.Binz， J.H.R. Kagi, 1999)。到1997年第四屆國際MT會議止，共發現并確定氨基酸序列的MT有170多種(茹炳根.第四屆國際金屬硫蛋白會議簡介.生命科學，1998， 10(3): 157 15)。金屬硫蛋白是一類低分子量、富含半胱氨酸、可吸附金屬的特異蛋白質，(Viarerigo， A, 1989. Heavy metals in marine invertebrates: mechanisms of regulation and toxicity at cellular level. Crit. Rev. Aquat.Sci. 1,295-317)。到目前為此，金屬硫蛋白被認為有以下功能(1)調節細胞 內微量金屬離子的動態平衡；(2)保護有機生物體免受過多重金屬離子的傷害；(3)清除體內 自由基；(4)貯存有機生物所必需金屬離子，以備其它金屬蛋白的利用；(5)保護細胞免受細 胞內過氧化的損傷(Karin, M.， 1985. metallothioneins: proteins in search of function. Cell 41, 9-10; Hamer, D.H.， 1986. Metallothioneins. Ann. Rev. Biochem. 55,913-951 )。金屬硫蛋白研究已涉及 農業、醫藥、生物化學、分子生物學、環境科學、衛生毒理學、食品科學、營養學、保健科 學和方法學等領域。除了可以開發各種治療藥物、保健化妝品等以外，還可以利用轉基因金 屬硫蛋白生物進行重金屬污染環境的修復。植物金屬硫蛋白到目前為止發現存在三種主要類型。用于此設計的為II型(plant metalllothioneintypell),發現于紅樹植物木欖中。根據半胱氨基酸的在金屬硫蛋白分子中的 分布規律，可以將植物金屬硫蛋白序列分成三個區域區域(1)中半胱氨的序列分布為 SCCGGnCGCGsgCKCgnGCgGCKmy;區域(2)序列中沒有發現半胱氨酸的分布；區域(3) 中半胱氨的序列分布為gCKCGsxC[kt]C[dn]PCxC。半胱氨酸的分布規律序列為CC， CXC 和CXXXC，兩個保守序列區域(1)和(3)分布于分子兩端，形成啞鈴狀，富含巰基(-SH)， 與哺乳動物金屬硫蛋白分子中半胱氨基酸重復分布規律一致。植物金屬硫蛋白II型有十四個 半胱氨酸(Cys)，是目前發現在植物蛋白中含有巰基數目最多的類型。紅樹植物木欖是東方紅樹林中的廣普種之一，生活在富含多種重金屬的河口、海灣和海 岸，能吸附大量金屬離子于體內(G. R. Macfarlae, M. D. Burchett, 2001. Photosynthetic pigmentsand peroxidase activity as indicators of heavy metal stress in the grey mangrove, Avicennia marina (Forsk.) Vierh. Marine Pollution Bulletin. 42 (2):233-240),研究它的相關金屬硫蛋白基因，對生 態環境中重金屬污染的凈化具有重要意義。 發明內容本發明通過從紅樹植物木欖分離總RNA，合成第一鏈cDNA，再根據植物type II MT相 對保守的(1)和(3)區域中氨基酸序列設計簡并引物，應用快速末端擴增(RACE)技術 克隆到木欖金屬硫蛋白的cDNA，該基因命名為BMT，其核苷酸序列如SEQIDNO.l所述， 所編碼的蛋白命名為6MT，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所述。將木欖金屬硫蛋白的核苷酸 序列及其編碼的氨基酸序列，在GenBank數據庫中進行BLAST同源檢索和比較，發現 是一種新的植物type II金屬硫蛋白。將木欖金屬硫蛋白的cDNA插入到pET100-TOPO表達 載體上，將重組子轉化到大腸桿菌BL21，發現該轉化子對重金屬Z^+和Cc^+具有抗性。因此，本發明的第一目的是提供從紅樹植物木欖中克隆到的金屬硫蛋白基因BMA以及 由此推斷的氨基酸序列，這個基因可以轉入高等植物中，培育轉基因金屬硫蛋白生物，對重 金屬污染的環境進行修復。本發明的第二目的是提供利用載體表達所述金屬硫蛋白基因BMA的方法。本發明將在下述方面產生有益效果將紅樹植物木欖金屬硫蛋白基因轉入生長速度快、 生物量大、適應性強的生物中，培育轉基因金屬硫蛋白生物，對重金屬污染的環境進行修復。


圖l是木欖金屬硫蛋白(II)的氨基酸序列與其它植物typeIIMT的同源比較。 (Comparison of amino acid sequence of ZjMT from 5r吸i/j'ara g,/ arr/w'za with other plant MT type II protein)
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于本發明，但本發明不限于 下述實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照分子克隆實驗指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,2001 )中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條 件。實施例1:木欖BMT的cDNA序列的克隆和測序 1. BMT的局部cDNA的擴增及測序 分離木欖總RNA稱0.2克木欖(嫩芽)于研缽中加入液氮，磨成粉末，并立即轉入無RNase的2 ml離心 管中，加入lml植物RNA提取液，充分混勻，水平放置離心管；混合液乳化5min后，在室溫中，13000rpm離心4min。將上清液轉入另一無RNase的2ml離心管中；加入0.2 ml 5 MNaCl于管中混勻，再加入0.6 ml的三氯甲烷，充分混勻后，在4 。C下，13000 rpm離心 10min;將上清液再轉入無RNase的2 ml離心管中，加等體積的異丙醇。混勻后，放置-20 °C 15min后，在4 。C下；小心地廢棄上浮液，其沉淀物用1 ml無RNase的75%的乙醇漂洗， 13000 rpm離心1 min;倒掉上浮液，用40 pl無RNase DEPC水充分溶解RNA，并進一步純 化，放入-70 。C備用。 合成第一鏈cDNA:根據試劑盒的要求和上述RNA的質量，其第一鏈cDNA合成體系與反應參數如下總RNA (5嗎) 5 pl10mMdNTPmix 1^101igo(dT)12-l8(0.5嗎) 1 pl2 nM GSP 1 JillDEPC-treated water 2 pl將上述溶液混合后，65。C反應5min，立即放入冰中5 min后加入10 XRT Buffer 2^125 mM MgCl2 4 ^0.1MDTT 2^1RNaseOUT RNase Inhibitor (40U/nl) 1混合后，在離心機上輕離，其后將管在45 。C下反應2 min，再加入1^1的反轉錄酶 (Superscript IIRT 200 U/pl),在45 'C下反應60 min，其后在70 'C下反應15 min。將 管放入冰上，再加入lpl的RNase H (40U/^)，在37 。C下20min。放入-20 。C下保存備用。 以第一鏈cDNA為模板，用一對簡并引物——A: 5'- ATGWSITGYGGIGGIAAYTG-3' 為正向引物，B: 5'-RCAIKTRCAIGGRTYRCAIKTRCA-3'為反向引物(其中W=A/T; S=G/C; Y=C/T; R=A/G; K=G/T)，進行PCR擴增。PCR條件為94 。C預變性4 min; 94 °C 變性40s; 58 °C退火40s; 71 。C延伸1.5 min;循環40次；最后72 。C延伸10 min。將目 的片段與pUCm-T載體(TaKaRa)連接，轉化大腸桿菌DH5ot，送上海生物技術服務有限公 司測序。 2. RACE反應根據試劑盒RACE (Invitrogen)的要求，以上述的核苷酸序列為對象設計3'-RACE特 異引物(5'陽CAG TTG CTT CCG CAC TTG-3')禾卩5'-RACE的特異引物 (5'-CTTCCGCACTTGCAGCCTCCGTTC T-3')，分別進行RACE反應，其PCR擴增程 序，3'-RACE為94 。C預變性2min; 94 。C變性30s; 55 。C退火30s; 72 。C延伸1.5min;5循環35次；最后72 。C延伸7min。 5、RACE為94 。C預變性2min; 94 T變性30s; 72 。C， 1.5 min，循環5次；94 。C變性30s, 70 。C， 1.5 min，循環8次；94 。C變性30s， 68退 火30s; 71 'C延伸1.5min;循環30次；最后72 'C延伸7min。分別將目的片段與pUCm-T 載體(TaKaRa)連接，轉化大腸桿菌DH5a，送上海生物技術服務有限公司測序。結合3'-和5'-RACE的結果分析獲得全長cDNA序列，共682 bp，其中開放閱讀框位于 89-328位核苷酸，這一閱讀框編碼79個氨基酸殘基。實施例2:同源比較用本發明的木欖BMT的全長cDNA序列及其編碼的蛋白，在GenBank+EMBL數據庫中， 用BLAST程序進行核苷酸和蛋白同源檢索。結果發現，在核苷酸水平上與蓖麻i /c/m^ cowwwm's (L02306)，軟木橡樹jgweraw w6er (AJ277599)，山毛櫸Fag^ sj;/ra"ca (AY574281)， 豇豆Wg朋a"gw/an':y (AB176561)，模式植物擬南芥爿ra&Wop^y (AY077669)的同源性大于60%。在氨基酸水平上6MT蛋白與上述植物金屬硫蛋白的同源性分別為82%， 81%， 81%， 79%， 70% (同源比較見圖l)。其蛋白序列中N-和C-端分別包含8和6個半胱氨基酸 殘基，并以Cys-Cys，Cys-X-Cys和Cys-X-X-Cys形式分布，因此，6MT是一種新的植物type II金屬硫蛋白。實施例3:木欖6MT在大腸桿菌中的表達1. 重組DNA工程菌的構建實例在該實施例中，以實施例l中全長cDNA為標準，設計正向引物5'-CACCAT GTCTTGCTGTGGTGGAAAC -3 '和反向引物5'- TCATTTACAAGTG AGGG GTC -3 '進 行RT-P CR反應，擴增BMT的開放閱讀框序列。根據試劑盒(Champion. pET Directional TOPO Expression Kits,購自Invitrogen)的要求，將擴增的片段插入至lJpET100-TOPO表達 載體上，該質粒載體編碼抗生素性(Amp", —個IPTG-可調啟動子/操縱子(P/0)、 一個核糖 體結合位點(RBS)、 一個6x組氨酸標記物。質粒用熱激法轉入100 14感受態大腸桿菌(BL21)中并在具有Amp的LB固體培養基中37 'C培養過夜。為了確定木欖BMT的存在，挑選白斑菌 落制備質粒，并用上述引物進行PCR，瓊脂糖電泳分析，木欖6MT基因分子大小為240bp。2. 菌種培養及重金屬抗性實例從培養皿菌落中選擇具有6MT基因的菌種培養于含有Amp (100 Pg/ml)的100 ml LB 培養液，在溫度為37 。C的搖床中(200 rpm)培養至OD6。。達到0.5-0.8，加入IPTG誘導物 (終濃度為1.0mM)，涂布在分別含有不同濃度的Zn2、 Cu2+、 Pb2+、 Hg2，P Cc^+的LB固體 培養基上，在溫度為25 'C的培養箱中培養2天(設對照組即不含6MT基因的菌種)。根據培養皿中菌落生長狀況可以得出，對照菌種在Zr^+濃度為1000 pM的培養基中已不 能生長，而具有6MT的菌種能正常生長，甚至Zr^濃度高至1500nM;對照菌種在CcP濃度為1000 nM時已不能生長，而具有6MT的菌種在濃度為2000pM培養基中仍能正常生長; 無論是對照菌種還是具有6MT的菌種對重金屬Cu2+、 Pb2+、 Hg^的表達無差異。<110>中國科學院南海海洋研究所<120>紅樹植物木欖金屬硫蛋白基因及其編碼的序列<160〉2<210>1<211>682〈212〉DNA〈213>木欖(i5r收〃j'ar3 g，/7orr力iza)〈220><221>CDS〈222〉 (89)…(328) 〈400>1g已aaactagttcaBtaCgCCattattatctatcatcggattatctgag^aaaataaccc 60ctcga33^c犯3gC33tCtcctg犯ggatgtcttgctgtggtgg3咖tgcggctgcgg 120agcaagctgcaagtgcggcaacggctgtgg鄉gtgcaagatgtacccagacatgggctt 180cgccg卿agaccactaccgagactctggttctcggcgtggggcctg卿gggcccactt 240tg鄉gagccg卿tgggcgtgccggccgagaacggaggctgcaagtgcggaagcaactg 300cacctgcgacccctgcacttgta犯tgagggg犯agtgac郷,ggtccgatctatta 360ttagtctatatgtgtgtgttgggagtcttgcttacaataaaccagtcatgccttgcgttt 420cctccatgctcagatcttaggttttaagttatctctctggtttctccaagctatggattt 480tcagtgtctagttttcctgtattacaaggaccgtatatgcatggtcggaa 540tccttccaaccatttcgtttgtctaaatatatatatctgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttt 600gatggga犯gtgagcttctatatgttttatgactaatgc3aactcgcttcttctaagtta 660tgcttgca犯as682〈210>2<211>79<212〉PRT〈213〉木欖(^r〃卵iera g拜/ orr/w'za) <400>2Met Ser Cys Cys Gly Gly Asn Cys Gly Cys Gly Ser Gly Cys Ser15 10 15Cys Gly Ser Gly Cys Gly Gly Cys Lys Met Tyr Pro Asp Met Ser20 25 30Leu Ala Glu Lys Thr Thr Thr Glu Thr Leu Val Leu Gly Val Ala35 40 45Pro Glu Arg Gly His Leu Glu Gly Ala Glu Met Gly Val Pro Ala50 55 60Glu Asn Gly Gly Cys Lys Cys Gly Ser Asn Cys Thr Cys Asp Pro65 70 75Cys Thr Cys Lys 79
權利要求
1.一種從紅樹植物木欖中分離的金屬硫蛋白基因，所述基因具有SEQ ID NO.1的第89位到328位堿基對。
2. 根據權利要求l所述的基因編碼的金屬硫蛋白，它具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列。
3. —種在大腸桿菌中表達木欖金屬硫蛋白基因的方法，其包含將權利要求l的金屬硫 蛋白基因DNA分子與表達載體連接，轉化到宿主體中，培養轉化體，誘導表達。
4. 根據權利要求3所述的方法，其中所述的表達載體是pET100-TOPO。
5. 根據權利要求3所述的方法，其中所述的宿主體是大腸桿菌。
全文摘要
本發明提供一種紅樹植物木欖金屬硫蛋白及其編碼的序列，該cDNA序列編碼蛋白含有SEQ ID NO.1的第89位到328位堿基對，屬于一種新的植物type II金屬硫蛋白。本發明還涉及該核苷酸的分離方法和bMT蛋白在大腸桿菌中的表達。將編碼bMT的DNA序列重組到質粒載體pET-100 TOPO并轉化到大腸桿菌BL21中，在分別含有不同濃度重金屬的LB培養基中進行抗性研究。具有bMT的菌種能抵抗一定濃度的Zn²⁺和Cd²⁺。金屬硫蛋白研究成果涉及農業、醫藥、生物化學、分子生物學、環境科學、衛生毒理學、食品科學、營養學、保健科學和方法學等領域；可以開發各種治療藥物、保健化妝品等外，還可以利用轉基因金屬硫蛋白生物進行重金屬污染環境的修復。
文檔編號C12N15/29GK101260402SQ200810027229
公開日2008年9月10日 申請日期2008年4月3日 優先權日2008年4月3日
發明者孫翠慈, 張鳳琴, 王友紹 申請人:中國科學院南海海洋研究所