專利名稱：人巨細胞病毒UL122基因的siRNA序列及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術，涉及分子生物學和基因工程技術領域，具體涉及針 對人巨細胞病毒(HCMV) UL122基因的siRNA序列的設計、篩選及其在體 內外抑制HCMV的應用。
技術背景1. HCMV的治療現狀HCMV屬卩皰疹病毒亞科，在人群中感染廣泛，但大多為無癥狀的亞臨床 感染。HCMV感染在免疫功能低下的人群(如AIDS、器官移植患者等)中則 可引起多系統的嚴重疾病，且可能與多種惡性腫瘤的發生有關。同時，HCMV 也是導致先天畸形和新生兒出生缺陷的最主要的感染性因素。因此，防治 HCMV感染一直是國內外醫學關注的熱點之一。目前，HCMV的治療藥物主 要包括更昔洛韋(ganciclovir, GCV)、膦甲酸鈉(fascamet， FOS)和西多福韋 (cidofovir，CDV)，但是由于藥物毒副作用和HCMV耐藥株的出現，急需探索 新的治療途徑控制HCMV感染。2. UL122基因及其表達蛋白的研究現狀HCMV的基因組表達具有一定時序性，可分為即刻早期(IE)、早期(E) 和晚期(L)三種時相蛋白。主要IE基因UL122經過選擇性剪接產生長度分 別為2.25kb (外顯子1, 2, 3， 5)和1.70kb (外顯子1， 2, 3， 5，)的mRNA，分別 編碼正286 (86kDa, 580個aa)和IE255 (55kDa, 425個aa)兩種核磷蛋白。研 究表明，UL122基因是HCMV的增殖必需基因，缺失UL122的HCMV突變 株不能產生增殖性感染。UL122基因編碼的正286蛋白在病毒復制和調節宿主 細胞周期等方面發揮關鍵作用。IE286不僅能夠反式激活多種病毒和細胞的啟 動子，而且也能作為抑制子下調主要IE蛋白的表達。另外，正286通過多種途 徑抑制被感染宿主細胞的凋亡，包括與凋亡誘導因子p53結合使其失活；通 過干擾p53的修飾抑制其激活；阻止不依賴p53的凋亡通路如TNF調節的死 亡受體信號途徑；誘導NF《B轉錄，在適當條件下NF-kB通過誘導cIAPs阻 止細胞凋亡。3. RNA干擾的研究現狀RNA干擾(RNA interference, RNAi)是序列特異的雙鏈RNA (dsRNA) 使細胞內同源mRNA降解，從而產生特異性基因表達沉默的過程。它是機體 的一種小分子RNA介導的序列特異性免疫保護機制，可以對抗侵入性遺傳因 子的作用。自1998年首次被報道以來，RNAi技術以其特有的優越性而被迅速 應用于抗病毒及其相關方面的研究中，目前已在fflV、 HBV、 HCV、流感病毒 等的抗病毒研究中取得重要進展。RNAi的作用主要由長約21 23nt的dsRNA介導，其中一類稱為小干擾 RNA (small interfering RNA,siRNA)，它和目的mRNA序列具有嚴格的配對， 能引起相應mRNA降解。由于RNAi是siRNA耙向作用mRNA引起的特異性 降解，因此要產生有效RNAi的關鍵是選擇合適的siRNA作用靶點。目前RNAi 靶點的選擇原則可以概括為以下幾點①選擇GC含量在50%左右的mRNA 區域；②避免選擇啟動子起始部位下游50 100nt以內或終止子上游50 100nt 內的區域；③避免超過三個G或三個C的重疊，因為多聚G或多聚C能形成 類聚物而干擾RNAi的沉默機制；④選擇以兩個AA開始的序列，這將使合成 siRNA更加容易；⑤保證靶序列與其他基因沒有同源性。目前，制備siRNA 的方法主要包括化學合成法、體外轉錄法、長片段dsRNA經RNaseIII降解法、 siRNA表達載體轉錄法及PCR制備的siRNA表達框法等5種。 發明內容本發明的目的是提供一種HCMVUL122基因的siRNA的cDNA序列，其 核苷酸序列是5'-GCATGTTCCGCAACACCAATC-3'。本發明的另一個目的是提供該cDNA序列在制備治療人巨細胞病毒感染 的藥物中的應用。本發明根據siRNA設計原則，選擇的siRNA其cDNA序列的GC含量為 52.4%,對應UL122mRNA中1103-1123核苷酸位點；構建針對HCMV UL122 基因的siRNA真核表達載體，轉化大腸桿菌后提取質粒，轉染AD293細胞， 可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表達水平，因此可應用于HCMV治療藥 物的制備。本發明的有益之處是提供的siRNA序列針對HCMV的增殖必需基因 UL122,目前國內外尚無以此基因作為RNAi靶點的報道。以此序列為基礎的 真核表達載體在細胞中能有效抑制UL122基因mRNA水平和蛋白表達水平， 因此可作為HCMV治療藥物開發的一個新耙點。
具體實施方式
本發明結合實施例作進一步說明。實施例一 siRNA真核表達載體體外抑制UL122-EGFP融合蛋白的表達1. siRNA的設計根據siRNA設計原則，從UL122 mRNA起始密碼子AUG 下游100nt處搜索AA序列，其3'端相鄰21nt序列作為候選耙點，從中選擇 GC含量在40~55%的siRNA序列，并通過GenBank數據庫的Blast功能與人 類基因組序列進行比對，確保無同源性。最終選擇的siRNA其cDNA序列為 5，-GCATGTTCCGCAACACCAATC-3，， GC含量為52.4%，對應UL122mRNA 中1103-1123核苷酸位點。2. 表達siRNA所需shDNA的合成與制備表達siRNA所需shDNA的正 義 鏈 序 列 為TGCTTTTTA-3， ， 反義鏈序列 為GAACATGCG國3,，委托生物公司合成后，將正、反義鏈退火形成雙鏈。3. siRNA真核表達載體的構建具有U6啟動子的真核表達質粒pSilencer 2.0-U6 (美國Ambion公司)用BamHI和Hind III雙酶切，與退火后的shDNA 雙鏈連接，轉化大腸桿菌感受態細胞DH5a， 37'C培養過夜，挑取克隆抽提質 粒送上海英駿公司進行DNA測序鑒定，選取測序結果正確的質粒擴增、保存。4. siRNA表達質粒體外抑制UL122-EGFP融合蛋白表達的實驗(1) 報告質粒pUL122-EGFP:為表達綠色熒光蛋白(EGFP)和UL122融 合蛋白的質粒，由UL122基因cDNA插入pEGFP-Nl (美國Clontech公司)的 Hind III和EcoRI位點構建而成，由于EGFP位于UL122的下游，且共用一個 啟動子，故EGFP的表達情況可間接反映UL122的表達。(2) siRNA表達質粒與報告質粒共轉染AD293細胞人胚腎細胞AD293接 種12孔細胞培養板后，待細胞達到80% 90%融合率，用Invitrogen公司 Lipofectamine 2000試劑將siRNA表達質粒與報告質粒pUL122-EGFP共轉染細 胞，操作方法參照試劑說明書，同時設轉染空質粒pSilencer 2.0-U6的陰性對 照組和不轉染質粒的空白對照組，5小時后換培養液(含10°/。新生牛血清的 DMEM)繼續培養。(3) 熒光定量RT-PCR檢測AD293細胞中UL122 mRNA的表達質粒轉染 后48h，收集AD293細胞，Trizol法抽提細胞總RNA，采用TAKARA公司的SYBR PrimeScript RT-RCP Kit檢測病毒UL122的mRNA，實驗方法參照試劑 盒說明書。UL122 基因 PCR 引物序列為上游 5'誦CGGCTGTATCGTGATCTCTG國3， ， 下 游5'-CAGGAGGAGGAAGACGAAGA-3'。內參照采用GAPDH， PCR引物序列 為 上 游 5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，， 下 游 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，。結果顯示，與陰性對照組相比，siRNA 表達質粒對UL122 mRNA表達的抑制率為49.3%。(4)流式細胞儀檢測AD293細胞中UL122蛋白表達情況質粒轉染后72h， 收集每孔內細胞，用PBS緩沖液洗滌2次后重懸于PBS中。用流式細胞儀在 488nm激發波長下檢測每孔細胞平均熒光強度(mean fluorescence intensity, MFI)及熒光陽性細胞比率a，計算每孔細胞的總熒光強度(total fluorescence intensity, TFI) = MFI x a 。結果顯示，與陰性對照組相比，siRNA表達質粒對 UL122蛋白表達的抑制率為79.5%。本發明系結合最佳實施例進行描述，在閱讀了本發明的上述內容后，本領 域技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價形式同樣落于本發明所附權利 要求書所限定的范圍內。本發明涉及的序列<210> 1 <211>21 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>根據HCMVUL122基因設計的siRNA的cDNA序列 <400> 1GCATGTTCCG CAACACCAAT C 21<210>2 <211>57 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>制備UL122基因siRNA所需shDNA正義鏈的序列 <400> 2<210> 3 <211>57 <212>DNA <213>人工序列 <220><223>制備UL122基因siRNA所需shDNA反義鏈的序列 <400> 3<210>4 <211>20 <212> DNA <213>人工序列 <220><223> UL122基因PCR上游引物序列 <400> 4CGGCTGTATC GTGATCTCTG 20<210> 5<211>20<212> DNA<213>人工序列<220><223>UL122基因PCR下游引物序列 <400> 5CAGGAGGAGG AAGACGAAGA 20 <210> 6<211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220><223> GAPDH基因PCR上游引物序列 <400> 6GAAGGTGAAG GTCGGAGTC 19<210>7 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220><223> GAPDH基因PCR下游引物序列 <400> 7GAAGATGGTGATGGGATTTC 20
權利要求
1.一種人巨細胞病毒UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5’-GCATGTTCCGCAACACCAATC-3’。
2. 權利要求1所述的cDNA序列在制備治療人巨細胞病毒感染的藥物中 的應用。
全文摘要
本發明提供一種人巨細胞病毒UL122基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5’-GCATGTTCCGCAACACCAATC-3’。本發明根據siRNA設計原則，選擇的siRNA其cDNA序列的GC含量為52.4％，對應UL122mRNA中1103-1123核苷酸位點；構建針對HCMV UL122基因的siRNA真核表達載體，轉化大腸桿菌后提取質粒，轉染AD293細胞，可有效抑制UL122基因mRNA和蛋白表達水平，可在制備治療人巨細胞病毒感染的藥物中的應用。
文檔編號A61K31/713GK101333527SQ200810063310
公開日2008年12月31日 申請日期2008年8月1日 優先權日2008年8月1日
發明者尚世強, 段群軍, 胡妙鳳, 趙正言, 然 陶 申請人:浙江大學