專利名稱：人巨細(xì)胞病毒UL54基因的siRNA序列及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)，涉及分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及針 對(duì)人巨細(xì)胞病毒(HCMV) UL54基因的siRNA序列的設(shè)計(jì)、篩選及其在體內(nèi) 外抑制人巨細(xì)胞病毒的應(yīng)用。
技術(shù)背景人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)感染在人群中極為普遍， 成年人血清抗體陽(yáng)性率可達(dá)80%以上。HCMV在初次感染后可長(zhǎng)期潛伏在體 內(nèi)，甚至終身帶毒，在免疫功能不成熟或缺陷的人群(如AIDS、器官移植患 者等)中，潛伏的HCMV可被激活而引起嚴(yán)重疾病。同時(shí)，HCMV也是人類 先天性感染最常見(jiàn)的病原之一，可造成流產(chǎn)、死胎、先天畸形、聽(tīng)力障礙、發(fā) 育遲緩等后果。目前，治療HCMV感染的藥物主要包括更昔洛韋(ganciclovir, GCV)、膦甲酸鈉(fascamet，F(xiàn)OS)和西多福韋(cidofovir， CDV)， 3種藥物均 通過(guò)抑制HCMV的增殖必需基因——UL54(DNA多聚酶)從而抑制病毒DNA 合成。但是，隨著藥物毒副作用和HCMV耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，傳統(tǒng)的HCMV 治療方法正面臨重大挑戰(zhàn)。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由內(nèi)源或外源雙鏈RNA引起的同 源mRNA特異性降解的現(xiàn)象，是細(xì)胞內(nèi)防御病毒感染、修復(fù)遺傳損傷的一種 重要保護(hù)機(jī)制，被稱為RNA基礎(chǔ)上的細(xì)胞"免疫"系統(tǒng)。由于RNAi具有高效、 穩(wěn)定、毒性低、特異性高等特點(diǎn)，自報(bào)道以來(lái)已被迅速應(yīng)用于抗病毒研究中， 在抑制病毒復(fù)制、表達(dá)等方面展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的雙鏈RNA在RNAi過(guò)程中起著關(guān) 鍵作用，被稱為小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA) 。 siRNA通過(guò)識(shí) 別特定的mRNA靶序列起作用，這些靶序列可能存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，或者 掩藏在RNA序列高度折疊的區(qū)域內(nèi)，甚至與蛋白質(zhì)形成緊密的復(fù)合物，從而 干擾siRNA的識(shí)別。因此，針對(duì)某一特定基因，不同靶點(diǎn)的抑制效果差別很大， 合理設(shè)計(jì)siRNA并篩選出理想耙點(diǎn)是有效發(fā)揮RNAi機(jī)制的重要條件。目前，制備siRNA的方法主要包括化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法、長(zhǎng)片段dsRNA 經(jīng)RNase III降解法、siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄法及PCR制備的siRNA表達(dá)框法等5種。其中，siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)錄法是將轉(zhuǎn)錄siRNA的特定DNA序列定向克 隆入含有U6或Hl啟動(dòng)子的表達(dá)載體中，載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄可持久、 穩(wěn)定地表達(dá)siRNA。與其他制備siRNA的方法相比，載體法制備siRNA具備 可在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因表達(dá)、可大量擴(kuò)增便于長(zhǎng)期研究、相對(duì)經(jīng)濟(jì)實(shí)用等 優(yōu)點(diǎn)，克服了其他方法費(fèi)用高、易降解、體內(nèi)表達(dá)短暫等缺點(diǎn)。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種人巨細(xì)胞病毒(HCMV) UL54基因的siRNA的 cDNA序列，其核苷酸序列是5'-CTCGATGAAGTCAAGAAGT-3'。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供該cDNA序列在制備治療人巨細(xì)胞病毒感染 藥物重的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，構(gòu)建針對(duì)HCMV UL54 (DNA多聚酶)基 因的siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞 和MRC-5細(xì)胞，最終篩選到1個(gè)能有效抑制UL54基因表達(dá)的siRNA序列， 可用于治療HCMV感染藥物的制備。本發(fā)明提供的siRNA序列針對(duì)HCMV的增殖必需基因UL54，目前國(guó)內(nèi) 外尚無(wú)用siRNA表達(dá)載體法篩選HCMV UL54基因有效siRNA序列的報(bào)道。 以此序列為基礎(chǔ)的真核表達(dá)載體具有在細(xì)胞中持續(xù)、有效抑制UL54基因 mRNA和蛋白表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)，故可作為HCMV治療藥物開(kāi)發(fā)的一個(gè)新靶點(diǎn)。


圖1是siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞48h后熒光顯 微鏡觀察結(jié)果。圖2是Western blot檢測(cè)MRC-5細(xì)胞中siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)UL54蛋白表達(dá) 的抑制。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例一 siRNA真核表達(dá)載體體外抑制UL54-EGFP融合蛋白的表達(dá) 1. siRNA的設(shè)計(jì)根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，從UL54 mRNA起始密碼子AUG 的下游100nt處搜索AA序列，其3'端相鄰19nt序列作為候選靶點(diǎn)，從中選擇 GC含量在40~55%的siRNA序列，并通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的Blast功能與人 類基因組序列進(jìn)行比對(duì)，確保無(wú)同源性。最終選擇的siRNA其cDNA序列為 5，-CTCGATGAAGTCAAGAAGT-3，， GC含量為42.1%，對(duì)應(yīng)UL54 mRNA中 3058-3076核苷酸位點(diǎn)。2. 表達(dá)siRNA所需shDNA的合成與制備表達(dá)siRNA所需shDNA的正義鏈序列為5，-CCGGTCTCGATGAAGTCAAGAAGTCTCGAGACTTCTTGACTTCAT CGAGTTTTTG-3，，反義鏈序列為5，-AATTCAAAAACTCGATGAAGTCAAGAAGTCTCGAGACTTCTTGA CTTCATCGAGA畫(huà)3，，委托生物公司合成后，將正、反義鏈分別退火形成雙鏈。3. siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pGCL-GFP (上海吉?jiǎng)P基因 化學(xué)技術(shù)有限公司提供)用Age I和EcoR II雙酶切，與退火后的shDNA雙鏈 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5oc， 37"C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取克隆抽提質(zhì)粒進(jìn) 行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證。PCR鑒定所需引物序列為.-上游5 ，-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3 ，；下游5'-GTAATACGGTTATCCACGCG畫(huà)3'。未連接入shDNA片段的空載體克隆片段大小為300bp，連接入shDNA片 段的陽(yáng)性克隆PCR擴(kuò)增片段大小為358bp。4. siRNA表達(dá)質(zhì)粒體外抑制UL54-EGFP融合蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)(1) 報(bào)告質(zhì)粒pUL54-EGFP:為表達(dá)綠色熒光蛋白(EGFP)和UL54融合 蛋白的質(zhì)粒，由UL54基因cDNA插入pEGFP-Nl(美國(guó)Clontech公司)的Hind III和EcoRI位點(diǎn)構(gòu)建而成，由于EGFP位于UL54的下游，且共用一個(gè)啟動(dòng)子， 故EGFP的表達(dá)情況可間接反映UL54的表達(dá)。(2) siRNA表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞人胚腎細(xì)胞AD293接 種12孔板后，待細(xì)胞達(dá)到80%~卯％融合率，用Invitrogen公司Lipofectamine 2000試劑將siRNA表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告質(zhì)粒pUL54-EGFP共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作方法 參照試劑說(shuō)明書(shū)，同時(shí)設(shè)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pGCL-GFP的陰性對(duì)照組和不轉(zhuǎn)染的空白 對(duì)照組，5小時(shí)后換培養(yǎng)液(含10。/。新生牛血清的DMEM)繼續(xù)培養(yǎng)。(3) 熒光顯微鏡觀察EGFP的表達(dá)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在倒置熒光顯微鏡下 觀察EGFP在AD293細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組相比，siRNA 表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組中熒光細(xì)胞數(shù)量顯著減少。結(jié)果參見(jiàn)圖l，其中圖A是陰性對(duì) 照(pUL54-EGFP+pGCL-GFP)，圖B是pUL54-EGFP+siRNA表達(dá)質(zhì)粒。實(shí)施例二 siRNA表達(dá)質(zhì)粒在MRC-5細(xì)胞中抑制HCMV UL54表達(dá)的實(shí)驗(yàn)1. siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MRC-5細(xì)胞將人胚肺成纖維細(xì)胞MRC-5接種 12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后用Invitrogen公司Lipofectamine 2000試劑將 siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，操作方法參照試劑說(shuō)明書(shū)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn) 染空質(zhì)粒pGCL-GFP)和空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒)。2. HCMV標(biāo)準(zhǔn)株AD169感染MRC-5細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24h，用HCMV 標(biāo)準(zhǔn)株AD169感染MRC-5細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立不感染病毒的對(duì)照組。3. 熒光定量RT-PCR檢測(cè)MRC-5細(xì)胞中UL54 mRNA的表達(dá)病毒感染 后48h，收集MRC-5細(xì)胞，Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，采用TAKARA公司的 SYBR PrimeScript RT-RCP Kit檢測(cè)病毒UL54的mRNA，實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒 的說(shuō)明書(shū)。內(nèi)參照為3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。PCR所用引物序列為上游引物序列為 5 ，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ，， 下游弓I物序列為 5 '-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 ，。 熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒的 MRC-5細(xì)胞中UL54 mRNA水平明顯下降，抑制率達(dá)到50%以上。4. Western blot檢測(cè)MRC-5細(xì)胞中UL54蛋白的表達(dá)病毒感染后72h， 收集MRC-5細(xì)胞，抽提細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)UL54蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染siRNA表達(dá)質(zhì)粒的MRC-5細(xì)胞中UL54 蛋白表達(dá)明顯受抑制，結(jié)果參見(jiàn)圖2，圖中a: UL54蛋白，b: GAPDH， 1: 陰性對(duì)照組，2: siRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。本發(fā)明涉及的序列 <210> 1 <211> 19 <212〉 DNA <213>人工序列 <220><223>根據(jù)HCMV UL54基因設(shè)計(jì)的siRNA的cDNA序列 <400> 1CTCGATGAAG TCAAGAAGT 19<210>2 <211>55 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>制備UL54基因siRNA所需shDNA正義鏈的序列 <400> 2CCGGTCTCGA TGAAGTCAAG AAGTCTCGAG ACTTCTTGAC TTCATCGAGT TTTTG 55<210>3 <211>55 <212> DNA <213>人工序列 <220><223>制備UL54基因siRNA所需shDNA反義鏈的序列 <400> 3AATTCAAAAA CTCGATGAAG TCAAGAAGTC TCGAGACTTC TTGACTTCAT CGAGA 55<210>4 <211>24 <212〉 DNA <213>人工序列 <220><223> siRNA表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定上游引物序列 <400> 4CCTATTTCCC ATGATTCCTT CATA 24<210> 5 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <220><223〉 siRNA表達(dá)質(zhì)粒PCR鑒定下游引物序列 <楊> 5GTAATACGGT TATCCACGCG 20<210>6 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220><223〉 GAPDH基因PCR上游引物序列 <400> 6GAAGGTGAAG GTCGGAGTC 19<210>7 <211>20 <212〉 DNA <213>人工序列 <220><223> GAPDH基因PCR下游引物序列 <400> 7GAAGATGGTGATGGGATTTC 20
權(quán)利要求
1.一種人巨細(xì)胞病毒UL54基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5’-CTCGATGAAGTCAAGAAGT-3’。
2. 權(quán)利要求1所述的cDNA序列在制備治療人巨細(xì)胞病毒感染的藥物中 的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種人巨細(xì)胞病毒UL54基因的siRNA的cDNA序列，其核苷酸序列是5’-CTCGATGAAGTCAAGAAGT-3’。本發(fā)明根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，選擇的siRNA其cDNA序列的GC含量為42.1％，對(duì)應(yīng)UL54 mRNA中3058-3076核苷酸位點(diǎn)，構(gòu)建針對(duì)HCMV UL54(DNA多聚酶)基因的siRNA真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后提取質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞，最終篩選到1個(gè)能有效抑制UL54基因表達(dá)的siRNA序列，可在制備治療人巨細(xì)胞病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/713GK101333526SQ200810063309
公開(kāi)日2008年12月31日 申請(qǐng)日期2008年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月1日
發(fā)明者尚世強(qiáng), 段群軍, 胡妙鳳, 趙正言, 然 陶 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)