一種含有CpG序列的PRRSVORF5基因核酸疫苗的制備方法

文檔序號：927781閱讀：616來源：國知局

專利名稱：一種含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及基因疫苗使用的佐劑和其制備方法，具體是一種含有CpG序列的 PRRSV 0RF5基因核酸疫苗。
2背景技術：
自從上世紀20年代以來，許多物質被嘗試作為免疫佐劑，但只有鋁膠佐劑獲得人類疫苗的許可，并大量用于豬疫苗。它作為抗原的儲存庫和載體，緩慢釋放抗原從而延長誘導機體的體液免疫反應，但缺點是僅誘導Th2體液免疫反應，抗體以IgGl型為主，無TCL反應。油佐劑和弗氏完全佐劑雖能明顯提高免疫應答能力，但在實際應用中常出現不良反應，如注射部位腫脹、疼痛、發燒，或發生過敏等，僅限用于實驗室動物試驗。206佐劑是目前商品化的高效動物疫苗油佐劑，已廣泛使用于動物疫苗中，實踐證實是可靠的、有效的和安全的，但需要進口，價格較高。
基因疫苗(gene vaccine)是近年來隨著基因治療而發展起來的第三代疫苗。它是將編碼某一特定保護性抗原蛋白的外源基因與真核表達載體進行重組后，直接導入動物體內，利用免疫原基因在宿主體內表達出抗原蛋白質引起機體的免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。與常規疫苗相比，基因疫苗具有如下優點免疫效果好；不散毒，無污染；保護性免疫持續時間長；方法簡便、價格低廉；核酸疫苗具有相同的理化性質，為聯合免疫提供了可能；便于貯藏和運輸；不受個體已有的免疫反應(如母源抗體)的影響。
PRRSV基因組中0RF2 7編碼病毒的結構蛋白，其中用于基因免疫方面研究較多的是0RF5、 0RF3以及0RF4。據報道，0RF5有6個抗原決定簇，其中一個是血清型特異性線性中和決定簇，能在體外中和病毒的感染性，這說明0RF5可以誘導產生中和抗體。最近，Patrick等^又證明病毒的中和作用與抗GP5滴度呈顯著相關性，另外，Pirzadeh等報道說，用含編碼0RF5的質粒進行DNA免疫，可使接種豬產生抗0RF5的特異性中和抗體，接種豬免于強毒攻擊造成的全身性病毒血癥和肺部病變，并使間質性肺炎和支氣.管肺泡炎明顯減輕。 Meulenberg等在LV株0RF4編碼的蛋白GP4中鑒定了一個中和區，表明該蛋白誘導的抗體具有中和作用。美國學者Molitor等又通過實驗證明可以用含0RF5、0RF3的基因構建基因免疫質粒，進行基因免疫。由于目前用來防制PRRS的滅活疫苗和弱毒疫苗均存在著不同程度的缺陷，因此利用生物技術手段開發新型疫苗以取代現用的常規疫苗己經是勢在必行。新型疫苗是以基因工程疫苗為核心，主要包括核酸疫苗、亞單位疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、合成肽疫苗以及抗獨特型抗體疫苗等。雖然PRRS病毒的基因序列己經全部測定，但其致病機理以及病毒結構蛋白的功能仍不十分清楚，所以這無疑為本病新型疫苗的研制帶來了重重困難，盡管如此，現在國外已有許多學者致力于這方面的研究，與此同時，國內學者也正對其處于積極探索之中。如何進一步提高傳統疫苗的免疫效果是今后努力的方向。高效免疫增強劑的應用，能全面提高機體的整體免疫水平，增強抗病防御和免疫應答能力，提高疫苗保護率。其中，CpG-ODN(CpG寡聚脫氧核苷酸)的研究是其中的焦點。CpG序列已被證實能作為疫苗的高效免疫增強劑，使用得當能夠大幅度提高疫苗的免疫保護率和機體的免疫水平。近來大量免疫學研究證實含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果(l)誘導B細胞增殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗誘生的細胞凋亡；(3)誘導單核細胞分泌IL-12及其他細胞因子；(4)活化自然殺傷(NK)細胞的裂解活性和干擾素 (IFN-y)分泌。
當前養豬業重大疫病發生和流行愈加復雜的形勢——舊病未除，新病又起，疫情不斷，這就要求我們必須運用新的科學理論和生產技術來發展豬用安全、高效疫苗預防和控制各種疫病的發生和流行，而佐劑研制是疫苗研究的主要組成部分。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的供豬免疫疫苗使用的基因佐劑的制備方法，即一種含有CpG序列的PRRSV 0RF5基因核酸疫苗的制備方法。
本發明的基因佐劑的優越性有1)在宿主體內表達所需要的DNA分子，在構象上接近天然分子結構，活性不受影響；2) —次少量給予即可長時間低量表達，無需多次給藥；3)制備簡單，質量易于控制，易規模化生產，成本低廉，易于保存和運輸；4)安全性好。細胞因子是機體內本身存在的免疫調節分子，對人體無毒副作用，同時也受機體免疫調節網絡的控制；5)易于構建和改造。利用分子生物學技術在基因水平的操作，實現人們所期望的免疫應答強度和類型。
經相關的實驗表明，本發明的基因佐劑具有可使低應答或無應答以及應答不全的疫苗產生有效的免疫反應的作用。
本發明的含有CpG序列的PRRSV 0RF5基因核酸疫苗的制備方法包括如下步
驟
(1) 選用CpG-ODN序列引物
A: 5， "CTCAT，TCCTA巡ATCCTA，TOCTA，TOCTA巡ATCCTA巡ATGGGCC-3， B: 5， -CATCGATAGGATCGATAGGATcgATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC-3，
(注1、兩端含有Apa I限制性內切酶位點，供克隆連接使用；劃線部分需硫代修飾；2、 A和B以引物形式合成，合成PAGE 2.00D以上)
(2) 采用基因工程重組技術，選擇合適的含酶切位點，將目的基因和CpG-ODN 序列克隆入真核細胞表達載體pVAXl;
(3) 用步驟(2)所得的重組質粒載體轉化原核宿主菌，挑選陽性克隆，測序鑒定后，再進行擴增培養；
(4) 大量提取和純化目的基因的重組質粒DNA。
(5) 免疫原性的檢測
(6) 動物試驗具體步驟如下
1) PCR擴增0RF5基因
設計擴增0RF5基因的引物為
P5s: 5， -AATCTAGCTAGCCGCCACCATGTTGGA-3 ，， P5r: 5， -GCGCgg076CTCACTGGCGTGTAG-3 ，。
為便于克隆，在上游引物和下游引物中分別添加了 Nhe I酶切位點和Not I 酶切位點。
以質粒pIRES—0RF50RF6為擴增模板，擴增0RF5基因，反應體系如下 10XPCR buffer 5W; dNTP Mixture 4Ml; P5s 2W; P5r; 模板2W; Ex Taq E 0. 5W;用ddH20補至50W。擴增條件預變性95°C 5min; 變性 94°C lmin退火50°C lmin延伸72°C lmin共30 Cycles最終延伸72°C lOmin。
2 ) pVAXl—0RF5載體的構建
用限制性內切酶Notl/Nhe I消化PCR純化產物和pVAXl，分別獲得0RF5基因片段和線性載體pVAXl，將產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳，按照上海生工膠回收試劑盒說明書進行。連接、轉化、挑菌、提質粒、用限制性內切酶Notl/NheI鑒定。
3) CpG-pVAXl- 0RF5重組質粒的構建
將合成的兩條CpG序列引物A、 B按l:l比例混合于95"C加熱5min，后置于室溫冷卻，退火2h，獲得CpG-ODN短序列。用限制性內切酶ApaI消化質粒pVAXl-0RF5，將pVAX1- 0RF5和CpG-0DN按1: 3比例進行連接、轉化、挑菌、質粒小提、用限制性內切酶Notl/Nhe I鑒定。將含有CpG-pVAX1-0RF5重組質粒的菌樣送往聯合基因有限公司生物公司，用Thermol Cyling全自動測序儀進行序列測定。
4) 重組質粒的純化和轉染細胞
質粒的大量制備及純化，按常規方法進行，溶于TE (pH 8.0)中，測定質粒DNA純度，貯存于-2(TC。質粒DNA的定量以TE(pH8. O)為空白對照，用TZK-800Z 紫外分光光度計測定波長260nm和280nm的核酸溶液光密度(0D)值。用含10%小牛血清的MEM培養基，在37。C， 5%C02的條件下培養C0S-7細胞，待細胞長至對數生長期質粒轉染細胞。采用脂質體法按說明書進行，設立空載體對照組。
5) RT-PCR檢測ORF5基因的轉錄情況收集篩選后穩定表達的細胞，按常規方法提取細胞總R N A ，經反轉錄后用引物P 5 s禾n P 5 r擴增。
6) 間接免疫熒光實驗(IFA)
將質粒轉染到長有70%C0S-7細胞單層的玻片上，5%C02、 37i:培養三天后，取出玻片，用PBS液沖洗三次，100。/。冷丙酮固定15 30min，再用PBS液洗滌三次；用含有5%BSA封閉2h，沖洗三次，每次5min;加入一抗(豬抗PRRSV血清)， 37。C作用2h后，沖洗3次；加入二抗(異硫氰熒光素標記的山羊抗豬IgG)，室溫避光作用lh，沖洗3次；吸干，滴加50%甘油水溶液，倒置于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。
7) 免疫動物
6周齡雌性SPF昆明小鼠，體重18 26 g ,購于青島藥檢所實驗動物中心。免疫6周齡雌性SPF昆明小鼠，取脾淋巴細胞檢測T淋巴細胞亞群的數量和淋巴細胞轉化實驗。采用間接ELISA方法分別測定了小鼠血清中抗PRRSV抗體水平的變化。將全部血清均做l: 40倍稀釋，最后測OD值。
4周齡長白仔豬，經ELISA檢測其PRRS抗體陰性。隨機分為5組，每組5 只，按如下五組免疫(A)正常對照組(注射生理鹽水)；(B)空載體PVAX1 組；(C) PVAX1-E組；(D) CpG-pVAXl-E組；(E)滅活疫苗組；B、 C、 D實驗組劑量均為800ug/只，用前混合均勻，肌肉注射，免疫三次，間隔21天；正常對照組注射lml生理鹽水，滅活疫苗組(E組)按說明書接種。于每次免疫后 IO天和攻毒后四周采血，分離血清，-20'C保存備用。 8)動物試驗
分別進行淋巴細胞轉化試驗(MTT法)，用IDEXX試劑盒檢測豬外周血抗體水平，用IL-2的定量檢測試劑盒檢測IL-2的含量，豬體內PRRSV的RT-PCR檢測，攻毒后4周將豬宰殺，取肺臟、肝臟、脾臟、扁桃體、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、肩前淋巴結、心臟、腎臟、腦組織、十二指腸等組織器官觀察病理變化。
9)試驗結果
1) 通過巧妙的設計構建成CpG-pVAXl-0RF5重組質粒，經測序正確。為了檢測重組質粒的免疫原性，將重組質粒轉染C0S-7細胞。將處理好的細胞玻片置于熒光顯微鏡下觀察，發現轉有重組質粒質粒pVAXl-0RF5、 CpG-pVAXl-0RF5 的細胞玻片上有明顯的黃綠色熒光，位置在細胞漿內，而質粒pVAXl和空白細胞對照則無特異性熒光出現。通過提取轉染質粒的細胞和對照細胞總RNA進行 RT-PCR 0RF5目的基因的特異性擴增。結果表明，轉有質粒pVAXl-0RF5和 CpG-pVAXl-0RF5細胞中擴增到約700bp的0RF5片段，而轉有pVAXl的細胞中和正常細胞未出現擴增條帶，證明目的基因在真核細胞中進行了轉錄。
2) 免疫6周齡雌性SPF昆明小鼠，取脾淋巴細胞檢測T淋巴細胞亞群的數量和淋巴細胞轉化實驗。采用間接ELISA方法分別測定了小鼠血清中抗PRRSV 抗體水平的變化。將全部血清均做l: 40倍稀釋，最后測0D值。其結果表明重組核酸疫苗能誘導機體產生特異性抗抗體，且抗體水平明顯高于PBS組和 pVAXl組，差異顯著，且pVAXl-0RF5組和CpG-pVAXl- E實驗組所得到的0D值較高，某些值可達O. l以上，同時還發現實驗免疫組CpG-pVAX1-0RF5組小鼠三免后采血清能獲得最高的0D值可達0. 121。
用流式細胞儀檢測10000個細胞，將所得數據進行統計學分析(數據的描述采用x士SD，組間比較采用非配對t檢驗)。結果表明與PBS對照組及空質粒pVAXl對照組比較，用所構建的重組表達質粒pVAXl-0RF5、 CpG-pVAXl-0RF5 免疫的各試驗組小鼠的T淋巴細胞亞類CD4+和CD8+的數量顯著提高(p<0. 05)，對照組CD4+最髙為23. 42，而實驗組CD4+最低則達到37. 05，而對照組CD8+最高為11. 98，實驗組CD8+最低達到15. 09。且實驗組中以CpG-pVAXl-0RF5免疫組的脾T淋巴細胞亞類數量較多，CD4+為40.8， CD8+為20.18。
8淋巴細胞轉化實驗說明pVAXl-0RF5組和CpG-pVAXl- E均能不同程度的刺激淋巴細胞的增殖，但兩組間差異不顯著。二免后10d pVAXl-0RF5組和 CpG-pVAXl- E組的淋巴細胞增值能力與對照組差異顯著；CpG-pVAX1- E組的OD 值較pVAXl-0RF5組的OD值有所增高，但差異不顯著。三免后10d CpG-pVAXl- E 組的淋巴細胞增值能力與對照組及pVAXl-0RF5差異顯著，證明CpG-ODN作為佐劑均能有效的刺激淋巴細胞增殖。
通過以上小鼠免疫實驗結果表明，所構建的CpG-pVAXl-0RF5實驗組核酸表達質粒接種小鼠后，均能不同程度的誘導機體產生體液免疫和細胞免疫。
3)為了檢驗插入的CpG-ODN對豬的免疫增強作用，我們選擇了4周齡長白仔豬25只，經ELISA檢測其PRRS抗體陰性。隨機分為5組，每組5只，按如
下五組免疫(A)正常對照組(注射生理鹽水)；(B)空載體PVAX1組；(C)
PVAX1-E組；(D) CpG-pVAXl-0RF5組；(E)滅活疫苗組；B、 C、 D實驗組劑量均為800ug/只，用前混合均勻，肌肉注射，免疫三次，間隔21d;正常對照組注射lmL生理鹽水，滅活疫苗組(E組)按說明書接種。于每次免疫后10d和攻毒后四周采血，分離血清，-20。C保存備用。于三免后2周對豬鼻內接種PRRSV SD1細胞毒TCID5。= 10—55，劑量為每頭豬2 mL。攻毒后觀察豬的臨床表現。
分別進行淋巴細胞轉化試驗(MTT法)，用IDEXX試劑盒檢測豬外周血抗體水平，用IL-2的定量檢測試劑盒檢測IL-2的含量，豬體內PRRSV的RT-PCR檢測，攻毒后4周將豬宰殺，取肺臟、肝臟、脾臟、扁桃體、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、肩前淋巴結、心臟、腎臟、腦組織、十二指腸等組織器官觀察病理變化。
豬淋巴細胞轉化試驗結果表明
免疫前各組淋巴細胞增值能力差異不顯著(P〉0.05下同)；一免疫后10dC 組、D組、E組0D值均升高，明顯高于對照組的OD值，并且差異顯著(P<0.05 下同)，說明CpG-pVAXl-0RF5組、滅活疫苗組均能不同程度的刺激淋巴細胞的增值，但疫苗組及CpG-pVAXl-0RF5組間差異不顯著。CpG-pVAXl-0RF5組及疫苗組的淋巴細胞增值能力與對照組差異顯著；二、三免后CpG-pVAXl-0RF5組及疫苗組的淋巴細胞增值能力差異不顯著，但與對照組及pVAXl-0RF5差異顯著，從而證明CpG-pVAXl-0RF5作為佐劑均能有效的刺激淋巴細胞增值。攻毒后10d 各組0D值均有不同程度的下降，CpG-pVAXl-0RF5組及疫苗組的淋巴細胞增值能力差異不顯著，但與對照組及pVAXl-0RF5差異顯著，表明CpG-ODN能延長疫苗
9的保護期；CpG-pVAXl-0RF5組的CpG-ODN對淋巴細胞增值能力的影響較為顯著。免疫前后按常規方法靜脈采血，分離血清，血清的抗體效水平的檢測結果表明
免前各組抗體水平均為陰性，差異不顯著(P〉0.05下同)，符合試驗要求。一免、二免后10dPVAXl-E組、CpG-pVAXl-0RF5組、滅活疫苗組的抗體水平明顯高于正常對照組(注射生理鹽水)、空載體PVAX1組；CpG-pVAXl-0RF5組、滅活疫苗組與空載體pVAXl對照組、生理鹽水正常對照組抗體水平差異顯著 (P〈0.05下同)；CpG-pVAXl-0RF5組、滅活疫苗組間的抗體水平差異不顯著。三免后10d各組抗體水平均有一定程度的降低，但疫苗組的抗體水平比 CpG-pVAXl-0RF5組下降速度快，與對照組差異顯著；CpG-pVAXl-0RF5組與空載體PVAX1組抗體水平差異顯著，而與滅活疫苗組疫苗+CpGl組差異不顯著。攻毒后10d ， PVAX1-0RF5組、CpG-pVAXl-0RF5組、滅活疫苗組的抗體水平下降，滅活疫苗組的下降趨勢快于CpG-pVAXl-0RF5，證明CpG-pVAXl-0RF5中的CpG能延緩抗體水平的降低。
對IL-2濃度的檢測結果表明一免、二免后10d PVAX1-E組、 CpG-pVAXl-0RF5組、滅活疫苗組的IL-2水平明顯高于正常對照組(注射生理鹽水)、宇載體PVAX1組；CpG-pVAXl-0RF5組、滅活疫苗組與空載體pVAXl對照組、生理鹽水正常對照組IL-2水平差異顯著(P<0. 05下同)；CpG-pVAXl-0RF5 組、滅活疫苗組間的IL-2水平差異不顯著。
取攻毒前、攻毒后2周及攻毒后4周的血清，用針對PRRSV SD1株0RF5 的引物對進行RT-PCR，檢測血清中的病毒血癥。檢測結果表明攻毒前所有豬血清的RT-PCR反應均為陰性。攻毒后正常對照組(注射生理鹽水)、空載體PVAX1 組均為陽性，且反應較強；CpG-pVAXl-0RF5組在攻毒后4周有l頭豬RT-PCR結果為陰性，病毒血癥的累計陽性率為20%，比pPVAXl-0RF5重組質粒組減少了 20Q%;疫苗組在攻毒后4周所有豬表現RT-PCR反應陽性，病毒血癥的累計陽性率為40%，但反應較弱。其余豬在攻毒后2周及攻毒后4周進行的檢測均為陽性。檢測結果表明，CpG-pVAXl-0RF5可部分抑制病毒血癥的出現。免疫豬攻毒后4周的病理變化經3次免疫后攻毒，并于攻毒后4周將豬宰殺。剖檢發現，攻毒后，免疫豬攻肺臟出現輕微出血(1/5)、腸系膜淋巴結出血并極度腫大(1/5)、腹股溝淋巴結出血(3/5)以及腎臟出血(1/5);生理鹽水組的肩前淋巴結出血(3/5)及十二指腸山血(2/5); PVAX1 -E組組肩前淋巴結出血(1/5) ; CpG-pVAXl-0RF5組的組織未見異常。結果表明，真核表達質粒 CpG-pVAXl-0RF5組的DNA重組質粒免疫后，可使豬的病理變化減輕。研究結果還表明接種PRRSV SD1 CpG-pVAXl-0RF5組能夠有效地抵抗經鼻攻毒，可以保護豬輕微病毒血癥，也不表現臨床癥狀，對肺的損害能提供部分保護。CpG的加入可使免疫豬的病變減輕或消失。
CpG-pVAXl-0RF5重組質粒中的插入片段測序結果如下:
GACCGCGGGCCGTTGCTCGCGATTGCTTTCTTTGTGGTGTATCGTGCCGTTCTGTTTTGCTGTGCT
TGAATGGCACAGATTGGCTGGCTAACAAATTTGATTGGGCAGTGGAGAGTTTTGTCATCTTTCCCG
TCCM TCGA TCC77\ 7"CGA 7"CC77\ rCG/\ rGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCC
TCCCACTGTCCTT
標注劃線字母是0RF5基因的上下游引物，引物之間是0RF5基因序列；斜體劃線字母部分
抗體效價的檢測結果如下
組別免前—免后10天二免后10天三免后10天攻毒后10天
生理鹽水組0. 168±0. 12a0. 169±0. 42a0. 19±0. 35a0. 19±0. 22a0. 23±0. 19a
PVAX1組0. 165±0. 15a0. 194±0, 26b0.21±0. 30b0. 22±0. 45b0. 31±0. 16b
PVAX1—E組0. 170±0. 25a0. 56±0. 25c0. 67±0, 58c0. 63 ±0. 48°0. 59±0. 14c
CpG-pVAX1-E0. 171 ±0. 23a0. 62 ±0. 34be0, 78 ±0. 35bc0. 82 ±0. llcd0. 67±0. 31"組.
滅活疫苗組0, 169±0. 37a0. 63 ±0. 54bc0. 82±0. 32b0. 74±0.46cd0, 64±0. 26d
注帶有相同字母的表示差異不顯著P〉0. 05;帶有不同字母的表示差異顯著 P〈0. 05SEQUENCE LISTING 〈110>山東省農業科學院畜牧獸醫研究所
〈120〉一種含有CpG序列的PRRSV 0RF5基因核酸疫苗的制備方法 <160> 5
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1 <211> 59 〈212>麗〈213〉人工序列〈220〉 <223>引物〈400> 1
ctcatcgatc ctatcgatcc tatcgatcct atcgatccta tcgatcctat cgatgggcc 59
〈210〉 2 〈211〉 59 <212> DNA 〈213〉人工序列 <220> 〈223>引物〈400> 2
catcgatagg 3tcgatagga tcgataggat cgataggatc gataggatcg atgagggcc 59
〈210〉 3 〈211〉 27 〈212〉 DNA <213〉人工序列 <220> 〈223>引物〈400〉 3
aatctagcta gccgccacca tgttgga 27
〈210〉 4 〈211> 24 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> 〈223>引物〈400> 4
gcgcggccgc tcactggcgt gtag 24<210> 5 〈211〉 997 〈212> DNA <213〉人工序列 <220>
<223>重組質粒 <400> 5
tttaacttaagcttggtaccgagctcggatccactagtccagtgtggtggaattctgcag60
atatccagcacagtggcggccgcgccacaacccgggatccgctagccgccaccatgttgg120
agaaatgcttgaccgcgggccgttgctcgcgattgetttetttgtggtgtatcgtgccgt180
tctgttttgctgtgctcgccaacgccagcactcccatctacagctgattt240
ac肌cttgacgctatgtgagctgaatggcacagattggctggctaacaaatttgattggg300
cagtggagagttttgtcatctttcccgttttgactcacattgtctcctatggtgccctca360
ctaccagccatttccttgacacagtcgctttagtcactgtgtctaccgccgggtttgttc420
tgtcctaagtagcatctacgcggtctgtgccctggctgcgttgacttget480
tcgtcattaggtttgcaaagaattgcatgtcctggcgctacgcgtgtaccagatatacca540
actttcttctggacactaagggcggactctatcgttggcggtcgcctgtcatcatagaga600
agttgaggtcgaaggtcatctgatcgacctc犯肌gagttgtgcttgatg660
gttccgtggcaacccctataaccagagtttcageggaacaatggggtcgtccttegatga720
cttctgtcatg咖gracggetc cacaaaaggtgcttttggcgttttctattacctacac780
gccagtgagcggccggttccCttt兆tg3gtcgagtctagagggccctcatcgatcctat840
cgatcctatcgatcctatcgatcctatcgatcctatcgatgggcccgttta犯cccgctg900
atcagcctcgactgtgccttetagttgecagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcc960
ttccttgaccctggaaggtgCC￡lCtCCC3Ctgtcctt99權利要求
1、一種含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制備方法，其特征在于制備步驟如下1)選用CpG-ODN序列引物A5’-CTCATCGATCCTATCGATCCATCGATCCTATCGATCCTATCGATCCTATCGATGGGCC-3’B5’-CATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC-3’2)PCR擴增ORF5基因設計擴增ORF5基因的引物為P5s5’-AATCTAGCTAGCCGCCACCATGTTGGA-3’，P5r5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’；為便于克隆，在上游引物和下游引物中分別添加了NheI酶切位點和NotI酶切位點；以質粒pIRES—ORF5ORF6為擴增模板，擴增ORF5基因，反應體系如下10×PCR buffer 5μl；dNTP Mixture4μl；P5s 2μl；P5r 2μl；模板2μl；Ex Taq E 0.5μl；用ddH2O補至50μl；擴增條件預變性95℃ 5min；變性94℃ 1min退火50℃ 1min延伸72℃ 1min共30 Cycles最終延伸72℃10min；3)pVAX1—ORF5載體的構建用限制性內切酶NotI/Nhe I消化PCR純化產物和pVAX1，分別獲得ORF5基因片段和線性載體pVAX1，將產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳，按照上海生工膠回收試劑盒說明書進行；連接、轉化、挑菌、提質粒、用限制性內切酶NotI/NheI鑒定；4)CpG-pVAX1-ORF5重組質粒的構建將合成的兩條CpG序列引物A、B按1∶1比例混合于95℃加熱5min，后置于室溫冷卻，退火2h，獲得CpG-ODN短序列；用限制性內切酶ApaI消化質粒pVAX1-ORF5，將pVAX1-ORF5和CpG-ODN按1∶3比例進行連接、轉化、挑菌、質粒小提、用限制性內切酶NotI/Nhe I鑒定；將含有CpG-pVAX1-ORF5重組質粒的菌樣送往聯合基因有限公司生物公司，用Thermol Cyling全自動測序儀進行序列測定；5)重組質粒的純化和轉染細胞質粒的大量制備及純化，按常規方法進行，溶于TE(pH8.0)中，測定質粒DNA純度，貯存于-20℃；質粒DNA的定量以TE(pH8.0)為空白對照，用TZK-800Z紫外分光光度計測定波長260nm和280nm的核酸溶液光密度(OD)值，用含10％小牛血清的MEM培養基，在37℃，5％CO2的條件下培養COS-7細胞，待細胞長至對數生長期質粒轉染細胞；采用脂質體法按說明書進行，設立空載體對照組；6)RT-PCR檢測ORF5基因的轉錄情況收集篩選后穩定表達的細胞，按常規方法提取細胞總R N A，經反轉錄后用引物P5s和P5r擴增；7)間接免疫熒光實驗(IFA)將質粒轉染到長有70％COS-7細胞單層的玻片上，5％CO2、37℃培養三天后，取出玻片，用PBS液沖洗三次，100％冷丙酮固定15～30min，再用PBS液洗滌三次；用含有5％BSA封閉2h，沖洗三次，每次5min；加入一抗(豬抗PRRSV血清)，37℃作用2h后，沖洗3次；加入二抗(異硫氰熒光素標記的山羊抗豬IgG)，室溫避光作用1h，沖洗3次；吸干，滴加50％甘油水溶液，倒置于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察；8)動物免疫6周齡雌性SPF昆明小鼠，體重18～26g，購于青島藥檢所實驗動物中心；免疫6周齡雌性SPF昆明小鼠，取脾淋巴細胞檢測T淋巴細胞亞群的數量和淋巴細胞轉化實驗；采用間接ELISA方法分別測定小鼠血清中抗PRRSV抗體水平的變化；將全部血清均做1∶40倍稀釋，最后測OD值；4周齡長白仔豬，經ELISA檢測其PRRS抗體陰性；隨機分為5組，每組5只，按如下五組免疫(A)正常對照組(注射生理鹽水)；(B)空載體PVAX1組；(C)PVAX1-E組；(D)CpG-pVAX1-E組；(E)滅活疫苗組；B、C、D實驗組劑量均為800ug/只，用前混合均勻，肌肉注射，免疫三次，間隔21天；正常對照組注射1ml生理鹽水，滅活疫苗組(E組)按說明書接種；于每次免疫后10天和攻毒后四周采血，分離血清，-20℃保存備用；9)動物試驗分別進行淋巴細胞轉化試驗(MTT法)，用IDEXX試劑盒檢測豬外周血抗體水平，用IL-2的定量檢測試劑盒檢測IL-2的含量，豬體內PRRSV的RT-PCR檢測，攻毒后4周將豬宰殺，取肺臟、肝臟、脾臟、扁桃體、腹股溝淋巴結、腸系膜淋巴結、肩前淋巴結、心臟、腎臟、腦組織、十二指腸等組織器官觀察病理變化。
全文摘要
本發明為一種含有CpG-ODN和表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)ORF5基因的核酸疫苗的制備方法。該方法是通過構建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重組表達質粒CpG-pVAX1-ORF5，經酶切鑒定和序列測定，將重組質粒轉染COS-7細胞，經間接免疫熒光試驗證實CpG-pVAX1-ORF5可表達PRRSV GP5蛋白。免疫SPF小鼠和豬，檢測鼠和豬的特異性抗體滴度、脾T淋巴細胞亞群數量(CD4+和CD8+)以及淋巴細胞增殖反應(MTT法)水平。試驗結果表明本試驗構建的含CpG基序真核重組表達質粒CpG-pVAX1-ORF5能誘導小鼠和豬產生針對PRRSV的體液免疫與細胞免疫。有效地提高豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果。
文檔編號A61K39/12GK101422608SQ20081001406
公開日2009年5月6日申請日期2008年1月23日優先權日2008年1月23日
發明者任慧英, 吳家強, 順周, 宋春陽, 張秀美, 俊李, 溫建新, 王金寶申請人:山東省農業科學院畜牧獸醫研究所

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