專利名稱：膠原蛋白活性肽及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于活性肽開發技術領域，具體涉及以來源于水產動物的未變性膠 原蛋白為原料，經過酶解等特殊的生化技術獲得的具有延長動物壽命和抑制褐 脂質形成等特殊生理功效的膠原蛋白活性肽及其制備方法。
背景技術：
活性肽是指能夠調節生物體的代謝或具有某些特殊生理活性的肽類，其生 理作用有免疫調節、激素調節、營養調節、提高免疫力、清除自由基、抗氧化、 延緩衰老、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血、降血壓等。膠原蛋白是廣泛存在 于動物細胞間的一種主要結構蛋白，用途涵蓋食品、美容、外用和植入用生物 醫用材料等，已成為一種重要的活性分子。經水解后的膠原蛋白產物中含有多 種具有各種生理功效的活性肽，在醫療、保健及美容方面具有良好的應用前景。在膠原蛋白肽及其生理功能的研究中，最早引人注目的是降血壓肽，其次為抗氧化肽。1979年Oshima等利用細菌膠原酶水解明膠，并從其水解物中分離 出6種具有能抑制血管緊張素轉化酶(ACE)活性的肽類，首次報道了膠原蛋 白肽的降血壓作用。以后，有關膠原蛋白肽的報道逐漸增多，如Orimura用16 種酶對鯡魚和豬皮的膠原蛋白進行酶解，從水解液中分離出能降血壓和清除自 由基的膠原蛋白肽，Saiga從雞肉膠原蛋白酶解物中發現降血壓和抗氧化的肽類， Kim等從阿拉斯加狹鱈魚皮明膠、Mendis等從皮氏叫姑魚皮明膠水解產物中獲 得了抗氧化肽。近幾年，國內學者對膠原蛋白肽的研究也非常重視，并有多篇 專利相繼公開。其中，CN1233840C涉及一種膠原多肽的制造方法及產品、CN1404748A涉及蛋白肽保健食品及其制備方法、CN1994133A涉及膠原蛋白肽 在食品中的應用方法、CN1552889A涉及制備膠原蛋白和膠原多肽的方法及其用 途，但這些專利均以膠原蛋白為原料，不涉及水產品，也未見膠原蛋白肽的理 化特征以及生物活性的報道；CN101061827A、 CN1582771A、 CN1814781A、 CN100351272C雖然分別涉及從魚皮、魚骨、魚鱗以及海星殼中制備膠原蛋白肽 的生產工藝與方法，但這些專利中沒有詳細報道這些膠原蛋白肽的生物活性； CN101091789A涉及海洋膠原肽在制備免疫調節藥物或食品中的用途，由魚皮經 水解獲得的分子量在200—1000D的小分子肽，可增強小鼠遲發性變態反應能力 和ConA刺激的T淋巴細胞增殖，增加抗體生成細胞數量，并對巨噬細胞碳粒 廓清能力和對雞紅細胞的吞噬能力具有明顯促進作用；CN101061827A涉及魷魚 皮膠原蛋白活性肽的制備方法和應用，其特征在于用熱水提取膠原蛋白，然后 加酶在40 5(TC水解、90 10(TC滅酶、用堿液調pH至中性、酶解液經過濾、超 濾、鈉濾、真空濃縮以及噴霧干燥，所獲得的膠原蛋白肽具有抗氧化、降血壓、 抗動脈粥樣硬化以及美容作用，但未見膠原蛋白肽具有延長動物壽命和抑制動 物體內褐脂質形成的功效報道。發明內容本發明的目的是提供一種膠原蛋白活性肽的制備方法，該制備方法得到的 膠原蛋白活性肽具有延長動物壽命和抑制褐脂質形成等特殊生理功效，可作為 功能因子添加劑，應用于人類的保健食品以及寵物的健康飼料中。為達到上述之目的，本發明的技術措施如下一方面，本發明公開了一種特殊的膠原蛋白活性肽，這種膠原蛋白活性肽系以 來源于水產動物的未變性膠原蛋白為原料，經過酶解等特殊的生化技術而獲得，其主要成分的分子質量范圍為5-13KD，氮溶解指數>98%,具有顯著延長動物壽 命以及抑制體內脂褐質生成等特殊的生理功效。另一方面，上述膠原蛋白活性肽的具體制備方法如下(1) 膠原蛋白的提取其提取方法是，將原料洗凈破碎后，先后用5 — 15倍的凈水和5%的NaCl 溶液處理，分別去除水溶性和鹽溶性雜蛋白，將除去雜蛋白的魚皮用20倍1% 的胃蛋白酶溶液(pH2)處理72h，離心(5000Xg)，取上清夜，加入固體NaCl， 使其濃度達到2.5M，離心(5000Xg)，取沉淀，得到膠原蛋白粗品；(2) 獲得蛋白水解產物 采用不同酶切位點的蛋白酶在中溫條件下對未變性水產膠原蛋白進行可控水解，獲得膠原蛋白水解產物；(3) 獲得膠原蛋白肽 將以上膠原蛋白水解產物進行透析，并經干燥獲得膠原蛋白肽。 上述未變性膠原蛋白指從各種水產動物(如海洋與淡水魚皮、頭足類動物皮、貝類外套膜等)原料中提取獲得的各種膠原蛋白，其提取方法一般是，先 將原料洗凈，采用中性鹽等去除原料中的非膠原雜蛋白類成分，然后采用低溫 酶解的方法將難溶性的膠原蛋白從原料中提取出來，從而獲得未變性的水產膠 原蛋白。得到上述膠原蛋白粗品后，用酸性溶液(如0.5M醋酸)溶解，并采用酸 性溶液(如0.5M醋酸)為透析外液進行透析48—72h，至透析液無Cl—檢出為 止，獲得優選的未變性I型膠原蛋白。上述經透析后的膠原蛋白水解產物在干燥前可經過也可不經過親水性葡聚 糖凝膠(Sephadex-G50)層析迸行純化。所述干燥方法可為真空干燥、噴霧干燥、冷凍干燥等，優選為冷凍干燥； 所述不同酶切位點的蛋白酶均為食用級，可為來自于動物、植物以及微生物的酸性、中性以及堿性蛋白酶，優選為食用級胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。蛋白酶酶解膠原蛋白溫度控制在30-60°C的中溫條件，并使膠原蛋白進行 可控水解，在此條件下膠原蛋白的水解度一般在5-15%范圍內。通過實驗驗證發現，本發明方法制備出的膠原蛋白活性肽具有顯著延長動物 壽命以及抑制動物體內脂褐質生成等功效。另外，該膠原蛋白活性肽還具有在 體外抑制多酚氧化酶的活性。制備得到的膠原蛋白活性肽可以作為功能因子添加劑廣泛應用于保健食品 中。這類保健食品適合于各種年齡層次的人群，尤其適合于中老年人服用，從 而起到延緩衰老與延年益壽的作用；也可做寵物健康飼料添加劑，應用于各類 寵物(如狗、貓、金魚、鴿子、鸚鵡以及其他鳥類等)的健康型詞料中，最好 用于價值昂貴的特種寵物詞料中，延長寵物的壽命。本發明具有如下特點及收益(1) 本發明所采用的原料為來源于水產品下腳料的未變性膠原蛋白，水產 品下腳料包括海洋與淡水魚皮、頭足類動物皮、貝類外套膜等。原料來源廣泛 豐富，有效成分含量高，最終產品有很高的得率；成本低廉，附加值高，具有 廣闊的市場前景。(2) 本發明公開的膠原蛋白活性肽產品具有抑制體外多酚氧化酶活性、顯 著延長動物壽命以及抑制動物體內脂褐質生成功效。(3) 本發明公開的膠原蛋白活性肽制備方法，使用的試劑全部為食用級， 工藝條件溫和(30-60°C條件下酶解)，使產品的食用安全性高，可作為功能因子直接添加于各種保健食品特別是具有延緩衰老與延年益壽作用的老年性保健 食品中，也可做寵物健康飼料添加劑，應用于各類寵物的健康型飼料中，延長 寵物的壽命。(4)本發明方法的操作簡單，設備投資少，適合工業化生產。
具體實施方式
下面通過具體的實例來說明如何制備本產品，值得一提的是，本實例只用 于對本發明做進一步的闡述和說明，不能認為是對本發明保護范圍的限制。 實施例1(1) 將洗凈的魚皮搗碎、先后用5 — 15倍的凈水和5X的NaCl溶液處理，分 別去除水溶性和鹽溶性雜蛋白。(2) 將除去雜蛋白的魚皮用20倍1%的胃蛋白酶溶液(pH2)處理72h，離 心(5000Xg)，取上清夜，加入固體NaCl，使其濃度達到2.5M，離心(5000 Xg)，取沉淀，得膠原蛋白粗品。(3) 將膠原蛋白粗品用0.5M醋酸溶解，并采用0.5M醋酸為透析外液進行 透析48—72h，至透析液無Cr檢出為止，獲得未變性I型膠原蛋白。(4) 將膠原蛋白分散于20倍量的純水中，將pH調至8，加熱至50。C，保溫 40mins，然后按比例加入胰蛋白酶(酶與底物濃度為60U/g)進行酶解20mins或 至水解度達到8%，得膠原蛋白水解液。(5) 將膠原蛋白水解液裝入截留分子量為2kD的透析袋，以蒸餾水為外液 進行透析過夜，再經凍干燥得膠原蛋白活性肽(CH-1)，經葡聚糖凝膠(Sephadex-G50)層析法進行分離純化后，所獲有效組分(CH-l-2)的分子量 為7378D。(6)將干燥后的CH-1添加于營養培養基中飼喂果蠅，能將果蠅的平均壽命 由對照組的52.3天延長至69.7天，延長率達到33.3%，同維生素E的延壽功效(70.6 天)相近；同時將果蠅體內的脂褐質含量由對照組的14.8%降至11.1。％，同維生 素E的效果(10.7%)類似。另外，CH-1還能明顯抑制體外多酚氧化酶的活性， 而且其活性呈劑量依賴關系，當CH-l的濃度為2mg/m時，其活性達到相同劑量 維生素C的33X;但當CH-l的濃度為5mg/ml時，其活性為同量維生素C的90% 。實施例2將按實施例l中(1)、 (2)、 (3)步驟獲得的未變性I型膠原蛋白分散于10倍 量的純水中，將pH調至2，加熱至6(TC，按實施例l中的比例加入胃蛋白酶進行 酶解，酶解時間大約為40mins或至水解度達到15X為止；將膠原蛋白水解液裝 入截留分子量為2kD的透析袋，以蒸餾水為外液進行透析過夜，再經凍干燥得膠 原蛋白活性肽，經葡聚糖凝膠(Sephadex-G50)層析法進行分離純化后，所獲 有效組分的分子量為5021D。實施例3將按實施例l中(1)、 (2)、 (3)步驟獲得的未變性I型膠原蛋白分散于10倍 量的純水中，將pH調至2，按實施例l中的比例加入胃蛋白酶進行酶解，溫度控 制在3(TC，酶解時間大約為40mins或至水解度達到5。^為止；將膠原蛋白水解液 裝入截留分子量為2kD的透析袋，以蒸餾水為外液進行透析過夜，再經凍干燥得 膠原蛋白活性肽，經葡聚糖凝膠(Sephadex-G50)層析法進行分離純化后，所 獲有效組分的分子量為5021D。實施例4將按實施例l中(1)、 (2)、 (3)步驟獲得的未變性I型膠原蛋白分散于IO 倍量的純水中，將pH調至2，按實施例1中的比例加入胃蛋白酶進行酶解，酶 解時間大約為40mins或至水解度達到12%為止；將膠原蛋白水解液裝入截留分 子量為2kD的透析袋，以蒸餾水為外液進行透析過夜，再經凍干燥得膠原蛋白 活性肽(CH-2);經葡聚糖凝膠((Sephadex-G50)層析法進行分離純化后，所 獲有效組分(CH-2-l)的分子量為12057D;將干燥后的CH-2添加于營養培養 基中飼喂果蠅，能將果蠅的平均壽命由對照組的52.3天延長至65.1天，比維生 素E(70.6天)的延壽效果差5.5天；同時將果蠅體內的脂褐質含量由對照組的 14.8%降至11.8%，略低于維生素E (10.7%)的效果。另夕卜，CH-2還能明顯抑 制體外多酚氧化酶的活性，而且其活性呈劑量依賴關系。當CH-2的濃度為 2mg/ml時，其活性達到相同劑量的維生素C的40.4% ，但當其濃度增加至5mg/ml 時，其活性達到相同劑量的維生素C的99.6W。實施例5將按實施例l中(l)、 (2)、 G)步驟獲得的未變性I型膠原蛋白分散于10倍量 的純水中，將pH調至7，按按實施例1中的比例加入木瓜蛋白酶進行酶解，酶 解時間約40mins或至水解度為7%;將膠原蛋白水解液裝入截留分子量為2kD 的透析袋，以蒸餾水為外液進行透析過夜，再經凍干燥得膠原蛋白活性肽 (CH-3);將干燥后的CH-3添加于營養培養基中飼喂果蠅，能將果蠅的平均 壽命由對照組的52.3天延長至67.2天，略低于維生素E (70.6天)的延壽功效； 同時將果蠅體內的脂褐質含量由對照組的14.8%降至11.7%。另外，CH-3還能 明顯抑制體外多酚氧化酶的活性，而且其活性呈劑量依賴關系。當CH-3的濃度為2mg/ml時，其活性達到相同劑量的維生素C的15.4%,但當其濃度增加至 5mg/ml時，其活性達到相同劑量的維生素C的98.6%。
權利要求
1. 一種膠原蛋白活性肽的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟(1)膠原蛋白的提取其提取方法是，將原料洗凈破碎后，先后用5-15倍的凈水和5％的NaCl溶液處理，分別去除水溶性和鹽溶性雜蛋白，將除去雜蛋白的魚皮用20倍1％的胃蛋白酶溶液(pH2)處理72h，離心(5000×g)，取上清夜，加入固體NaCl，使其濃度達到2.5M，離心(5000×g)，取沉淀，得到膠原蛋白粗品；(2)獲得蛋白水解產物采用不同酶切位點的蛋白酶在中溫條件下對未變性水產膠原蛋白進行可控水解，獲得膠原蛋白水解產物；(3)獲得膠原蛋白肽將以上膠原蛋白水解產物進行透析，并經干燥獲得膠原蛋白肽。
2. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的膠原蛋白為未變性 I型膠原蛋白，在得到膠原蛋白粗品后，用0.5M醋酸溶解，并采用0.5M醋酸 為透析外液進行透析48 — 72h，至透析液無C1一檢出為止，獲得未變性I型膠原 蛋白。
3. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的蛋白酶為酸性蛋白酶。
4. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的蛋白酶為堿性蛋白酶。
5. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的蛋白酶為中性蛋白酶。
6. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述的酸性蛋白酶為胃蛋白酶。
7. 如權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述的堿性蛋白酶為胰蛋白酶。
8. 如權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的中性蛋白酶為木瓜 蛋白酶。
9. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的中溫條件為30-60。C
10. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的可控水解為膠原蛋 白水解度在5 — 15%。
11. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的膠原蛋白肽的分子 量為5 —13KD。
12. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的膠原蛋白肽的氮溶 解指數大于98%。
13. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的制備方法制備的膠 原蛋白肽用于延長動物壽命和抑制動物體內脂褐質生成。
14. 如權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的制備方法制備的膠 原蛋白多肽用于人類的功能性食品及寵物飼料中。
全文摘要
本發明通過來源于水產動物的未變性膠原蛋白，尤其是未變性I型膠原蛋白為原料，再經過在中溫條件下酶解，透析，干燥等特殊的生化技術制備方法得到膠原蛋白肽。制得的膠原蛋白肽主要成分的分子質量范圍為5-13KD，氮溶解指數＞98％，具有顯著延長動物壽命以及抑制體內脂褐質生成等特殊的生理功效，可作為功能因子添加劑廣泛應用于保健食品和寵物健康飼料添加劑中。
文檔編號A23L1/305GK101275156SQ20081003721
公開日2008年10月1日 申請日期2008年5月9日 優先權日2008年5月9日
發明者嚴如娟, 劉承初, 彭得翔, 朱振樂, 李家樂, 李應森 申請人:上海水產大學