大分子活性膠原蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大分子活性膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟：魚皮的預(yù)處理；活性膠原蛋白的提取；活性膠原蛋白溶液的純化。本發(fā)明通過超聲波、乙酸和復(fù)合酶的協(xié)同作用提取膠原蛋白，并綜合運(yùn)用鹽析、透析和超濾技術(shù)制得大分子活性膠原蛋白溶液，并能穩(wěn)定存在。
【專利說明】大分子活性膠原蛋白的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料的制備領(lǐng)域，具體涉及一種大分子活性膠原蛋白的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]膠原蛋白是具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)的一族蛋白質(zhì)，廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織中，約占總蛋白質(zhì)的30%以上。膠原蛋白為骨、皮膚、肌腱和韌帶提供生物力學(xué)性能、控制發(fā)育中的細(xì)胞基因表型。膠原蛋白的結(jié)構(gòu)呈三股螺旋結(jié)構(gòu)，由三條多肽鏈組成，每一條膠原鏈都是左手螺旋構(gòu)型，三條左手螺旋α-鏈又互相纏成右手螺旋結(jié)構(gòu)一即超螺旋結(jié)構(gòu)。單個(gè)α-鏈含有至少一個(gè)Gly-X-Y序列。每三個(gè)氨基酸就有一個(gè)甘氨酸殘基。膠原蛋白的特有結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成使其具有許多獨(dú)特性質(zhì)和功能。這些性質(zhì)和功能使其在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，如生物醫(yī)學(xué)材料、藥物輸送載體、組織工程、化妝品和食品等領(lǐng)域。
[0003]目前，國(guó)內(nèi)活性膠原蛋白雖有科研單位進(jìn)行了研究和開發(fā)，并有一些活性膠原蛋白提取工藝方面的專利與報(bào)道，但目前離產(chǎn)業(yè)化水平仍有一定差距，只限于少數(shù)幾家公司能夠進(jìn)行中試或小規(guī)模試生產(chǎn)。由于活性膠原蛋白產(chǎn)業(yè)化水平較低，限制了它的下游產(chǎn)品開發(fā)與應(yīng)用。目前，活性膠原蛋白在保健食品、化妝品領(lǐng)域中的應(yīng)用有大量報(bào)道和銷售，但對(duì)于醫(yī)用級(jí)大分子量活性膠原蛋白的提取技術(shù)僅處于小規(guī)模水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種大分子活性膠原蛋白的制備方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種大分子活性膠原蛋白的制備方法，包括以下步驟:
一、魚皮的預(yù)處理
選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20-30% NaCI (0.05Μ Tris-HCI,ρΗ7.5)溶液中(1:20-40，w/v)均質(zhì)5-lOmin，用轉(zhuǎn)速為10000-15000rpm高速冷凍離心機(jī)離心10-25min，取沉淀，重復(fù)上述操作，直到?jīng)]有浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗；
二、活性膠原蛋白的提取
將預(yù)處理后的魚皮加入預(yù)冷的去離子水中(1:5 O -10 O，w/ V )，冰浴，加入乙酸至0.5-1.0M超聲10-25min,超聲波功率300-600W,加入0.1-0.5重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或數(shù)種，酶解5-8h，離心，取上清，所得沉淀加去離子水(1:50-100)，調(diào)pH值至中性，加入0.1-0.5重量份中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或兩種，酶解3-6h，離心，取上清，合并兩份上清，得膠原蛋白溶液；
三、活性膠原蛋白溶液的純化
選孔徑為10-50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5-1.3M，鹽析過夜，然后離心10-30min，取沉淀，沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，離心l_2h，取上清，對(duì)0.1-0.2M乙酸透析脫鹽，用100-200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為20-50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0006]有益效果:本發(fā)明通過超聲波、乙酸和復(fù)合酶的協(xié)同作用提取膠原蛋白，并綜合運(yùn)用鹽析、透析和超濾技術(shù)制得大分子活性膠原蛋白溶液，并能穩(wěn)定存在。
【具體實(shí)施方式】
[0007]下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)的說明。
[0008]實(shí)施例1:選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:20, w/v)均質(zhì)5min,用轉(zhuǎn)速為1000Orpm高速冷凍離心機(jī)離心lOmin，取沉淀，重復(fù)上述操作，直到?jīng)]有浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗。將預(yù)處理后的魚皮加入預(yù)冷的去離子水中(1:50, w/v),冰浴,加入乙酸至0.5M超聲IOmin,超聲波功率300W。加入0.1重量份胃蛋白酶，酶解5h，離心，取上清。所得沉淀加去離子水(1:50)，調(diào)pH值至中性，加入0.1重量份中性蛋白酶，酶解3h，離心，取上清。合并兩份上清，得膠原蛋白溶液。選孔徑為IOnm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5M,鹽析過 夜,然后離心IOmin,取沉淀。沉淀再次用0.5M乙酸溶解后，離心Ih,取上清，對(duì)0.1M乙酸透析脫鹽，用IOOnm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為20%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0009]實(shí)施例2:選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入30% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:40, w/v)均質(zhì)IOmin,用轉(zhuǎn)速為15000rpm高速冷凍離心機(jī)離心25min，取沉淀，重復(fù)上述操作，直到?jīng)]有浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗。將預(yù)處理后的魚皮加入預(yù)冷的去離子水中(1: 100, w/v),冰浴,加入乙酸至1.0|/[超聲251]1；[11,超聲波功率600W。加入0.5重量份胃木瓜蛋白酶，酶解8h，離心，取上清。所得沉淀加去離子水(1:100)，調(diào)pH值至中性，加入0.5重量份菠蘿蛋白酶，酶解6h，離心，取上清。合并兩份上清，得膠原蛋白溶液。選孔徑為50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為1.3M，鹽析過夜，然后離心30min，取沉淀。沉淀再次用IM乙酸溶解后，離心2h，取上清，對(duì)0.2M乙酸透析脫鹽，用200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為50%的大分子活性膠原蛋白溶液。
[0010]實(shí)施例3:選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入25% NaCI (0.05MTris-HCI, pH7.5)溶液中(1:30, w/v)均質(zhì)8min,用轉(zhuǎn)速為12000rpm高速冷凍離心機(jī)離心20min,取沉淀，重復(fù)上述操作，直到?jīng)]有浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗；將預(yù)處理后的魚皮加入預(yù)冷的去離子水中(1:70, w/v),冰浴,加入乙酸至0.8M超聲20min,超聲波功率400W，加入0.3重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或數(shù)種，酶解6h，離心，取上清，所得沉淀加去離子水(1:80)，調(diào)pH值至中性，加入0.3重量份中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或兩種，酶解5h，離心，取上清，合并兩份上清，得膠原蛋白溶液；選孔徑為30nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.9M，鹽析過夜，然后離心20min，取沉淀，沉淀再次用0.8M乙酸溶解后，離心1.5h，取上清，對(duì)0.15M乙酸透析脫鹽，用150nm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為30%的大分子活性膠原蛋白溶液。[0011]應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。本實(shí)施例中未明確的各組成部分均可用現(xiàn)有技·術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。
【權(quán)利要求】
1.一種大分子活性膠原蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 一、魚皮的預(yù)處理
選取新鮮魚皮，100重量份，水洗去肉后，加入20-30% NaCI (0.05M Tris-HCI,pH7.5)溶液中(1:20-40，w/v)均質(zhì)5-lOmin，用轉(zhuǎn)速為10000-15000rpm高速冷凍離心機(jī)離心10-25min，取沉淀，重復(fù)上述操作，直到?jīng)]有浮游脂肪和氣泡產(chǎn)生，然后用去離子水清洗； 二、活性膠原蛋白的提取
將預(yù)處理后的魚皮加入預(yù)冷的去離子水中(I: 50-100, w/v),冰浴，加入乙酸至0.5-1.0M超聲10-25min,超聲波功率300-600W,加入0.1-0.5重量份胃蛋白酶、酸性酶3350和木瓜蛋白酶中的一種或數(shù)種，酶解5-8h，離心，取上清，所得沉淀加去離子水(1:50-100)，調(diào)pH值至中性，加入0.1-0.5重量份中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶中的一種或兩種，酶解3-6h，離心，取上清，合并兩份上清，得膠原蛋白溶液； 三、活性膠原蛋白溶液的純化 選孔徑為10-50nm的超濾膜濃縮上述膠原蛋白溶液，加入NaCl至終濃度為0.5-1.3M，鹽析過夜，然后離心10-30min，取沉淀，沉淀再次用0.5-1M乙酸溶解后，離心l_2h，取上清，對(duì)0.1-0.2M乙酸透析脫鹽，用100-200nm孔徑的超濾膜去除小分子物質(zhì)和多肽，得到濃度為20-50%的大分子活性膠原·蛋白溶液。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK103571901SQ201210276450
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月6日
【發(fā)明者】郁帥陸, 黃榮醒, 林琳 申請(qǐng)人:江蘇奧普萊醫(yī)療用品有限公司