專利名稱：添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基及制法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及添加二甲基亞砜(DMSO)的藥用植物芽誘導培養基，特別涉及添加二 甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽誘導培養基及其制備方法和用途。
背景技術：
紅景天有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗微波輻射、延緩機體衰老，防止老年疾病等功 效。它又是適應原樣藥物，在軍事醫學、航天醫學、運動醫學和保健醫學等方面也有十分 重要的意義。長鞭紅景天(Rhodiola fastigiata)為景天科(Crassulaceae)紅景天屬 (Rhodiola L.)多年生草本植物，在世界上主要分布于中國、尼泊爾、錫金、不丹及克什米爾 地區，在我國主要分布于西藏、云南和四川。長鞭紅景天是國家第二批確定的二級保護植 物，同時由于對該植物資源的過度開發和對其生長環境的破壞，目前已列入了物種紅色名 錄，處于近危狀態。紅景天生長的海拔高，所處的環境惡劣，生長緩慢，種子萌發率很低。隨著紅景天 的藥物、保健食品、化妝品等的開發熱潮，通過組織培養來進行快速繁殖紅景天是一種有效 的解決資源短缺、實現資源的可持續性發展利用的方法。長鞭紅景天的快繁主要包括芽的 誘導、生根等步驟。長鞭紅景天誘導的芽生根比較容易，因此芽誘導步驟成為長鞭紅景天組 織快繁的關鍵步驟。胡挺松等人在《植物生理學通訊》，2004，40 (3) :335_335的“長鞭紅景天的組織培 養和快速繁殖” 一文中介紹了以幼葉和嫩莖作為外植體，以WPM基本培養基添加激素6-芐 基腺嘌呤(BAP)和吲哚-3-丁酸(IBA)，培養溫度為(25士2) °C，光照時間每天10小時， 實現了長鞭紅景天的芽誘導。晏嬰才等人在《植物生理學通訊》，2005，41(3) :341-341的 “云南野生紅景天的組織培養與快速繁殖” 一文中介紹了以葉柄、莖尖為外植體，以MS基本 培養基添加激素BAP和吲哚-3-乙酸(IAA)，以花芽為外植體，以MS基本培養基添加激素 KT,以幼莖為外植體，以MS基本培養基添加激素激動素(KT)和IAA，變溫(11 22°C )培 養，光照時間每天12小時，實現了長鞭紅景天的叢生芽誘導。HAI-JUN LIU等人(Hai-Jun Liu, Yan Xu, Yu-Jun Liu, Chun-Zhao Liu. Plant regeneration from leaf explants of Rhodiola fastigiata. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant,2006, 42(4) 345-347)的技術方案是以葉片為外植體，以MS基本培養基添加激素BAP和萘乙酸 (NAA)，光照時間每天12小時，實現了長鞭紅景天的芽誘導。目前長鞭紅景天的芽誘導效率還比較低，沒有實現長鞭紅景天的工廠化大規模生產。為了實現長鞭紅景天的工廠化大規模生產，需要改進現有的培養基和培養方法，提高 快繁過程中的芽誘導的效率，減低成本。長鞭紅景天的芽誘導培養基是基本培養基加上細 胞分裂素和生長素。我們在實驗中發現，在芽誘導培養基中添加合適濃度的二甲基亞砜 (DMSO)，按照合適的芽誘導方法，可以大大提高長鞭紅景天芽誘導的效率。DMSO是一種既溶 于水又溶于有機溶劑的非質子極性溶劑。作為一種滲透性保護劑，DMSO在動植物細胞的低 溫保存中廣泛應用。DMSO在誘導動物和人的細胞分化方面也有報道。在植物的快繁中，特別是芽誘導過程中，沒有應用DMSO來促進芽誘導的相關報道。

發明內容
本發明的目的在于解決傳統長鞭紅景天芽誘導中的出芽效率低等問題，提供添加 二甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽誘導培養基。本發明的再一目的是提供一種添加二甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽誘導培養 基的制備方法。本發明的還一目的是提供添加二甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽誘導培養基的 用途，利用本發明提供的添加二甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽誘導培養基進行芽誘導 的生長，在不影響誘導出芽的質量前提下，提高芽誘導的出芽數和出芽率，降低成本，為工 廠化大規模生產打下堅實的基礎。
本發明的添加二甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽導培養誘基是在每升MS基本培 養基中含有細胞分裂素6-芐基腺嘌呤(BAP)的濃度為1 μ Mol化―1 20 μ Mol化―1 (1 μ M 20 μ Μ)，生長素萘乙酸(NAA)的濃度為 0. 1 μ Mol · L-1 5 μ Mol · L-1 (0. 1 μ M 5 μ Μ)，二 甲基亞砜(DMSO)的濃度為0. OOlml · Γ1 20ml · Γ1。所述的長鞭紅景天芽誘導培養基中可進一步添加瓊脂，瓊脂的添加量為每升長鞭 紅景天芽誘導培養基中添加瓊脂4 7克。本發明的添加二甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽誘導培養基的制備方法向配 制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合均勻，用無 機酸或無機堿調節混合液的ρΗ為5. 6 5. 8，高溫濕熱滅菌后加入經過濾除菌的二甲基 亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂素BAP的濃度為1 μ Mol 20 μ Mol (1 μ M 20 μ Μ)，生長素 NAA 的濃度為 0. 1 μ Mol Γ1 5 μ Mol Γ1 (0· 1 μ M 5 μ Μ)，二甲基亞砜的濃度為OOOlml · Γ1 20ml · Γ1。在高溫濕熱滅菌前可進一步添加瓊脂，瓊脂的添加量為每升長鞭紅景天芽誘導培 養基中添加瓊脂4 7克。所述的無機酸為鹽酸、硫酸或硝酸等。所述的無機堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀等。所述的高溫濕熱滅菌為本領域內對培養基滅菌的常規方法，如在121°C下滅菌18 分鐘。本發明的添加二甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽誘導培養基可作為長鞭紅景天 芽誘導生長的培養基使用。在作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用時的操作步驟如下1).將添加二甲基亞砜(DMSO)的長鞭紅景天芽誘導培養基倒入高壓濕熱滅菌的 培養皿或培養瓶中，待用；2).將無菌的或表面經消毒的長鞭紅景天芽誘導外植體切成0. 3 2cm長的小段 或塊接種到步驟1)的芽誘導培養基上；控制培養溫度在24 26°C，前3天進行黑暗培養， 3天后在光照強度為2000 3000LUX的條件下每天進行光照6 16小時，直至得到2cm以 上的芽。所述的高溫濕熱滅菌為本領域內對培養基滅菌的常規方法，如在121°C下滅菌18分鐘。所述的長鞭紅景天芽誘導外植體表面消毒是先用乙醇漂洗，再用質量濃度為 0. 1 % 1. 0%的有效氯消毒液浸泡，每5 20分鐘更換1次消毒液，更換1 3次，浸泡總 時長為10分鐘 40分鐘，然后用無菌水沖洗2 5次。所述的乙醇漂洗是用體積濃度為70%的乙醇漂洗5 30秒。所述的長鞭紅景天芽誘導外植體選自野生的長鞭紅景天的葉片、野生的長鞭紅景 天的嫩莖、移栽的長鞭紅景天的葉片、移栽的長鞭紅景天的嫩莖、長鞭紅景天的實生種子苗 的子葉、長鞭紅景天的實生種子苗的下胚軸中的一種。所述的長鞭紅景天的實生種子苗的子葉是長鞭紅景天的實生無菌種子苗的子葉。所述的長鞭紅景天的實生種子苗的下胚軸是長鞭紅景天的實生無菌種子苗的下 胚軸。所述的MS基本培養基為公知產品，如可參見張志良、瞿偉菁主編的《植物生理學 實驗指導》(第三版)。北京高等教育出版社，2003.附錄326-327。由于在本發明的添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基中加入了低濃度的 二甲基亞砜，所以誘導出的芽形態正常，生長良好，可以正常生根和在大田生長。使用本發 明的添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基，與不加二甲基亞砜的芽誘導培養基進行 長鞭紅景天芽誘導相比，芽誘導率和芽誘導數都有較大的提高，大大降低了生產成本，為大 規模工廠化生產打下了良好的基礎。
具體實施例方式實施例1.向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合 均勻，用鹽酸或氫氧化鉀調節混合液的PH為5. 8，加入瓊脂7克· L—1。采用本領域內對培 養基滅菌的常規高溫濕熱滅菌方法進行高溫濕熱滅菌后加入經過濾除菌的二甲基亞砜，混 合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂素BAP的濃度為1 μ Μ,生長素NAA的濃度 為0. 1 μ Μ，二甲基亞砜的濃度為0. OOlml · L-1及瓊脂7克。在作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用時的操作步驟如下1).將添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基倒入高壓濕熱滅菌的培養皿 中，待用；2)選取移栽的長鞭紅景天的葉片為外植體，先用體積濃度為70%的乙醇漂洗10 秒，再用質量濃度為0. 1 %有效氯消毒液浸泡，每10分鐘更換1次消毒液，更換消毒液2次， 浸泡總時長為30分鐘，然后用無菌水沖洗2次，外植體的消毒結果理想。將經上述表面消 毒的外植體切成Icm長的小塊，接種到上述芽誘導培養基上。控制培養溫度在24 26°C 之間，前3天進行黑暗培養，3天后每天光照時間12h，光照強度為3000LUX。外植體在培養 20天左右開始出芽，在40天左右誘導出大量的芽，所得到的芽形態正常。與不加二甲基亞 砜的芽誘導培養基進行長鞭紅景天芽誘導相比，出芽率提高30%左右，每個出芽的外植體 出芽數提高7個左右。把2cm以上的芽接種到生根培養基中可以正常生根，生根的苗可以 在大田正常生長。實施例2.
向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合均勻，用硝酸或氫氧化鈉調節混合液的PH為5.7。在121°C下滅菌18分鐘后加入經過 濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂素BAP的濃度為 20 μ Μ,生長素NAA的濃度為5 μ Μ，二甲基亞砜的濃度為2ml · Γ1。在作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用時的操作步驟如下1).將添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基倒入經121°C下滅菌18分鐘后 的培養瓶中，待用；2)選取野生的的長鞭紅景天葉片為外植體，先用體積濃度為70%的乙醇漂洗30 秒，再用質量濃度為0. 有效氯消毒液浸泡，每5分鐘更換1次消毒液，更換消毒液3次， 浸泡總時長為20分鐘，然后用無菌水沖洗4次，外植體的消毒結果理想。把經上述表面消 毒的外植體切成0. 3cm長的小塊，接種到上述芽誘導培養基上。控制培養溫度在24 26°C 之間，前3天進行黑暗培養，3天后每天光照時間6h，光照強度為2500LUX。培養瓶上搖床 培養，外植體在培養20天左右開始出芽，在40天左右誘導出大量的芽，所得到的芽形態正 常。與不加二甲基亞砜的芽誘導培養基進行長鞭紅景天芽誘導相比，出芽率提高15%左右， 每個出芽的外植體出芽數提高3個左右。把2cm以上的芽接種到生根培養基中可以正常生 根，生根的苗可以在大田正常生長。實施例3.向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混 合均勻，用鹽酸或碳酸氫鈉調節混合液的PH為5. 6。在121°C下滅菌18分鐘后加入經過 濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂素BAP的濃度為 20 μ Μ,生長素NAA的濃度為2 μ Μ，二甲基亞砜的濃度為20ml · Γ1。在作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用時的操作步驟如下1).將添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基倒入經121°C下滅菌18分鐘后 的培養瓶中，待用；2)選取實生的長鞭紅景天無菌種子苗的下胚軸為外植體，外植體切成0.5cm長的 小段，接種到上述芽誘導培養基上。控制培養溫度在24 26°C之間，前3天進行黑暗培養， 3天后每天光照時間16h，光照強度為2000LUX。培養瓶上搖床培養，外植體在培養20天左 右開始出芽，在40天左右誘導出大量的芽，所得到的芽形態正常。與不加二甲基亞砜的芽 誘導培養基進行長鞭紅景天芽誘導相比，出芽率提高20%左右，每個出芽的外植體出芽數 提高5個左右。把2cm以上的芽接種到生根培養基中可以正常生根，生根的苗可以在大田 正常生長。實施例4.向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合 均勻，用硝酸或氫氧化鈉調節混合液的PH為5. 8，加入瓊脂6克· L—1。在121°C下滅菌18 分鐘后加入經過濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂 素BAP的濃度為10 μ Μ,生長素NAA的濃度為1 μ Μ，二甲基亞砜的濃度為0. 02ml · Γ1及瓊 脂6克。在作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用時的操作步驟如下1).將添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基倒入經121°C下滅菌18分鐘后的培養皿中，待用；2)選取實生的長鞭紅景天種子苗的下胚軸為外植體，先用體積濃度為70%的乙 醇漂洗30秒，再用質量濃度為0. 5%有效氯消毒液浸泡，每10分鐘更換1次消毒液，更換 消毒液2次，浸泡總時長為30分鐘，然后用無菌水沖洗3次。把經上述表面消毒的外植體 切成1. Ocm長的小段，接種到上述芽誘導培養基上。控制培養溫度在24 26°C之間，前3 天進行黑暗培養，3天后每天光照時間12h，光照強度為2500LUX。外植體的消毒結果理想。 外植體在培養20天左右開始出芽，在40天左右誘導出大量的芽，所得到的芽形態正常。與 不加二甲基亞砜的芽誘導培養基進行長鞭紅景天芽誘導相比，出芽率提高15%左右，每個 出芽的外植體出芽數提高3個左右。把2cm以上的芽接種到生根培養基中可以正 常生根， 生根的苗可以在大田正常生長。實施例5.向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合 均勻，用硫酸或氫氧化鈉調節混合液的PH為5. 7，加入瓊脂6克· L—1。在121°C下滅菌18 分鐘后加入經過濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂 素BAP的濃度為10 μ Μ,生長素NAA的濃度為5 μ Μ, 二甲基亞砜的濃度為Iml · L—1及瓊脂6克。在作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用時的操作步驟如下1).將添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基倒入經121°C下滅菌18分鐘后 的培養皿中，待用；2)選取野生的長鞭紅景天的嫩莖為外植體，先用體積濃度為70%的乙醇漂洗30 秒，再用質量濃度為0. 5%有效氯消毒液浸泡，每10分鐘更換1次消毒液，更換消毒液3次， 浸泡總時長為40分鐘，然后用無菌水沖洗3次，外植體的消毒結果理想。把經上述表面消 毒的外植體切成0. 5cm長的小段，接種到上述芽誘導培養基上。控制培養溫度在24 26°C 之間，前3天進行黑暗培養，3天后每天光照時間12h，光照強度為2500LUX。外植體在培養 20天左右開始出芽，在40天左右誘導出大量的芽，所得到的芽形態正常。與不加二甲基亞 砜的芽誘導培養基進行長鞭紅景天芽誘導相比，出芽率提高15%左右，每個出芽的外植體 出芽數提高3個左右。把2cm以上的芽接種到生根培養基中可以正常生根，生根的苗可以 在大田正常生長。實施例6.向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合 均勻，用鹽酸或氫氧化鈉調節混合液的PH為5. 8，加入瓊脂6克· L—1。在121°C下滅菌18 分鐘后加入經過濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂 素BAP的濃度為15 μ Μ,生長素NAA的濃度為1 μ Μ，二甲基亞砜的濃度為0. 2ml化―1及瓊脂 6克。在作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用時的操作步驟如下1).將添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基倒入經121°C下滅菌18分鐘后 的培養皿中，待用；2)選取實生的長鞭紅景天種子苗的子葉為外植體，先用體積濃度為70%的乙醇 漂洗20秒，再用質量濃度為1. 0%有效氯消毒液浸泡，每10分鐘更換1次消毒液，更換消毒液1次，浸泡總時長為20分鐘，然后用無菌水沖洗3次，外植體的消毒結果理想。把經上述表面消毒的外植體切成0. 3cm長的小塊，接種到上述芽誘導培養基上。控制培養溫度在 24 26°C之間，前3天進行黑暗培養，3天后每天光照時間12h，光照強度為2500Lux。外植 體在培養20天左右開始出芽，在40天左右誘導出大量的芽，所得到的芽形態正常。與不加 二甲基亞砜的芽誘導培養基進行長鞭紅景天芽誘導相比，出芽率提高20%左右，每個出芽 的外植體出芽數提高5個左右。把2cm以上的芽接種到生根培養基中可以正常生根，生根 的苗可以在大田正常生長。
權利要求
一種添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基，其特征是在每升MS基本培養基中含有細胞分裂素6-芐基腺嘌呤的濃度為1μMol·L-1～20μMol·L-1，生長素萘乙酸的濃度為0.1μMol·L-1～5μMol·L-1，二甲基亞砜的濃度為0001ml·L-1～20ml·L-1。
2.根據權利要求1所述的添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基，其特征是所 述的長鞭紅景天芽誘導培養基中添加有瓊脂，瓊脂的添加量為每升長鞭紅景天芽誘導培養 基中添加瓊脂4 7克。
3.一種根據權利要求1或2所述的添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基的制備 方法，其特征是向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素6-芐基腺嘌呤溶液和生長 素萘乙酸溶液，混合均勻，用無機酸或無機堿調節混合液的pH為5. 6 58，高溫濕熱滅菌后 加入經過濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂素6-芐 基腺嘌呤的濃度為1 P Mol L—1 20 ii Mol L—1，生長素萘乙酸的濃度為0. 1 u Mol L—1 5uMol 二甲基亞砜的濃度為 0001ml I71 20ml I71。
4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征是在高溫濕熱滅菌前添加瓊脂，瓊脂的添 加量為每升長鞭紅景天芽誘導培養基中添加瓊脂4 7克。
5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征是所述的無機酸為鹽酸、硫酸或硝酸；所述的無機堿為氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀。
6.一種根據權利要求1或2所述的添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基作為長 鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用。
7.根據權利要求6所述的用途，其特征是添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養 基作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用時的操作步驟為1).將添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基倒入高壓濕熱滅菌的培養皿或培養 瓶中，待用；2).將無菌的或表面經消毒的長鞭紅景天芽誘導外植體切成0.3 2cm長的小段或塊 接種到步驟1)的芽誘導培養基上；控制培養溫度在24 26°C，前3天進行黑暗培養，3天 后在光照強度為2000 3000LUX的條件下每天進行光照6 16小時，直至得到2cm以上 的芽。
8.根據權利要求7所述的用途，其特征是所述的長鞭紅景天芽誘導外植體表面消毒 是先用乙醇漂洗，再用質量濃度為0. 1. 0%的有效氯消毒液浸泡，每5 20分鐘更 換1次消毒液，更換1 3次，浸泡總時長為10分鐘 40分鐘，然后用無菌水沖洗。
9.根據權利要求7或8所述的用途，其特征是所述的長鞭紅景天芽誘導外植體選自 野生的長鞭紅景天的葉片、野生的長鞭紅景天的嫩莖、移栽的長鞭紅景天的葉片、移栽的長 鞭紅景天的嫩莖、長鞭紅景天的實生種子苗的子葉、長鞭紅景天的實生種子苗的下胚軸中 的一種。
10.根據權利要求9所述的用途，其特征是所述的長鞭紅景天的實生種子苗的子葉是 長鞭紅景天的實生無菌種子苗的子葉；所述的長鞭紅景天的實生種子苗的下胚軸是長鞭紅景天的實生無菌種子苗的下胚軸。
全文摘要
本發明涉及添加二甲基亞砜的長鞭紅景天芽誘導培養基及其制備方法和用途。向配制MS基本培養基的溶液中加入細胞分裂素BAP溶液和生長素NAA溶液，混合均勻，用無機酸或無機堿調節混合液的pH為5.6～5.8，高溫濕熱滅菌后加入經過濾除菌的二甲基亞砜，混合均勻，得到每升MS基本培養基中含有細胞分裂素BAP的濃度為1μMol·L-1～20μMol·L-1，生長素NAA的濃度為0.1μMol·L-1～5μMol·L-1，二甲基亞砜的濃度為0.001ml·L-1～20ml·L-1。本發明的芽誘導培養基能夠作為長鞭紅景天芽誘導生長的培養基使用，誘導出的芽形態正常，生長良好，可以正常生根和在大田生長。
文檔編號C12N5/04GK101831398SQ20091007948
公開日2010年9月15日 申請日期2009年3月12日 優先權日2009年3月12日
發明者劉春朝, 田春龍 申請人:中國科學院過程工程研究所