專利名稱：：Ppard主效基因的鑒別、分子育種方法的建立及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及動物遺傳育種領域，具體是涉及鑒別一個影響豬耳性狀、脂肪沉積、體長和頭重的主效基因、分子育種方法的建立及該基因在種豬遺傳改良中的應用。
背景技術：
：中國是養豬大國，也是豬種資源最豐富的國家，很早就開始將野豬馴化為家豬。經過長期選擇，形成了許多各具特色的地方品種，僅《中國豬品種志》(張仲葛主編，上海科技出版社，1986)記載的就有48個。與國外的商品豬相比，中國地方品種在長期的選育歷史中形成了差異顯著的體形外貌和種質特性。以耳性狀和體長為例，耳大下垂的豬種有二花臉、梅山、八眉、河套大耳豬等，耳小豎立的豬種有藏豬、滇南小耳豬等；體型大的豬種有二花臉、梅山、河套大耳豬、萊蕪豬等，體型小的豬種有藏豬、滇南小耳豬、五指山豬等。豐富的種質資源不僅為豬的遺傳改良提供了寶貴的育種素材，同時也為人類醫學研究提供了理想的動物模型(Andersson&Georges.NatRevGenet.2004，5:220_212)。本發明專利所述的豬重要經濟性狀分別涉及(1)耳性狀，包括耳面積、耳重和耳型；(2)脂肪沉積性狀，如屠宰體重時的平均背膘厚；(3)頭重；(4)胴體長，包括胴體直長和胴體斜長。這些性狀都屬于數量性狀，由多基因控制，其中存在主基因(majorgene)效應。采用常規育種方法對數量性狀的選育需進行準確的表型測定，花費較多，選擇周期較長。分子生物學技術的發展，使人們可以在DNA水平尋找控制豬數量性狀的主基因或與其緊密連鎖的分子標記，在育種過程中用于基因輔助選擇(geneassistedselection)或標記輔助選擇(markerassistedselection)，可獲得更高的選擇精度、更快的選擇進展和更大的經濟效益。國內外研究人員采用基因組掃描法，在豬7號染色體上(SSC7)定位了極顯著影響豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的數量性狀基因座(QTL)。Wei等以梅山X大白三代家系為材料，利用152個標記將影響耳面積和耳型的基因座定位在SSC758cM鄰近區域內，置信區間小于20cM(Weietal.AnimalGenetic2007,38:222-226)。多個研究小組利用以梅山為母本的多個資源家系將影響脂肪沉積性狀的主效QTL也定位于SSC758cM鄰近區域(Sanchezetal.JAnimSci.2006,84526-537；Bidaneletal.GenetSelEvol.2001,33289-309；Rattinketal.MammGenome.2000，11:656_661)。Edwards等(JAnimSci.86254-266)利用124個微衛星標記對杜洛克X皮特蘭豬F2資源群體進行基因組掃描，發現7號染色體上存在影響體長的主效QTL。Yue等(ScienceinChina.2003,4610-17)以野豬、梅山豬和皮特蘭構成的三個F2群體為研究對象，在SSC7發現了數個影響體長、頭重、13-14肋骨間的背膘厚、肩部膘厚等性狀的QTL。申請人:從2001年到2006年，利用6年的時間構建了一個大規模的4代白色杜洛克X二花臉資源群體，在該群體中測定了7大類(表觀、生產、胴體、肉質、繁殖、健康相關和行為性狀)422項的表型指標，其中有耳性狀、胴體長、頭重和脂肪沉積表型記錄的F2個體超過1000頭，F3個體560頭。由于始祖白色杜洛克是廣泛應用于商業生產的瘦肉型父本品系，而二花臉豬是以產仔數多和易于脂肪沉積而聞名于世的中國地方豬種，因此在F2和F3群體中上述測定性狀存在明顯的表型分離現象。申請人利用194個微衛星標記對白色杜洛克X二花臉資源家系進行了全基因組掃描和QTL定位分析，在SSC758cM處發現了一個極顯著影響耳性狀、脂肪沉積、胴體長和頭重的QTL，其中影響耳面積的QTL是在該資源群體所檢測到的1，264個QTL中最顯著的一個，置信區間僅為2cM，可解釋超過40%的表型變異(Maetal.AnimGenet.2009，40:463_467)。引人注目的是二花臉的QTL基因型具有增加耳重、耳面積、體長、頭重和減少脂肪沉積的作用。申請人在此工作基礎上，深入開展了該QTL的遺傳解析研究，最終鑒別到了影響該QTL的主效基因(QTG)和因果突變位點(QTN)，由此不僅揭示了這些表型性狀的分子遺傳機理，還建立相應的用于種豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長選育改良的新型分子育種技術
發明內容本發明的第一個目的是提供一個影響豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的主效基因。本發明的第二個目的是提供一種針對豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀的分子育種方法。本發明的第三個目的是影響豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀的主效基因在種豬遺傳改良中的應用。本發明的第一個目的是這樣實現的一個影響豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的主效基因，特征是該基因的cDNA序列具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQIDNo2的多核苷酸，它由2717個堿基組成，該cDNA序列的編碼序列為自5’端第102位至1427位堿基，其序列如下所示gttgacaggaactgccctgtagaggtccatctgcactcagacccagatgatgccagagct60atgaccgggcctgcaggcgtggcgccgaggggaagtcagccatggagcagccgccggagg120aagcccctgaggtccgggaagaggagaagaaaaaggaagtggcagaggccgaaggaggcc180cagagctcaatgggggaccagagcactcgcttccctccagcagctgtacagatctctccc240agagctgctctccacccgcgctgctggaccagctgcagatgggctgcgacggggcctcgt300gcggtggcctcagcatggagtgccgggtgtgcggggacaaggcatcaggcttccactacg360gagtccacgcttgcgaggggtgcaagggcttcttccgccggacaatccgcatgaagctgg420agtacgagaagtgtgagcggatctgcaagatccagaagaagaaccgcaacaagtgccagt480actgccgcttccagaaatgcctggcgctgggcatgtctcacaacgccattcgctttggcc540ggatgcccgaggcagagaaaaggaagctggtggctgggctgacggcaaacgaggggagtc600agcacaacccgcaggtggctgacctgaaggccttctccaagcacctctacagcgcctacc660tgaaaaacttcaacatgaccaaaaagaaggcccgcgccatcctcaccggcaaggccagcc720acacagcgccctttgtgatccacgacatcgagacgttgtggcaggccgagaagggcctgg780tgtggaagcagctggtgaatggcctgccgccctacaaggagatcagcgtgcacgtcttct840accgctgccagtgcaccacggtggagacggtgcgcgagctgaccgagttcgccaagagca900tccccagcttcgaccacctcttcctcaacgaccaggtgacccttctcaagtacggcgtgc960acgaggccatcttcgccatgctggcctccatcgtcaataaggatgggctgctggtggcca1020acggcactggttttgtcacccgcgagttcctgcgcagcatccgaaagcccttcagtgaca1080tcattgagcccaagtttgagttcgctgtcaagttcaatgccctggaactcgatgatagtg1140acctggctctcttcatcgcagccatcattctgtgtggagaccggccaggcctcatgaacg1200tgtcacaggtggaggccatccaggacaccatcctgcgtgccctcgagttccacctgcagg1260ccaaccaccccgacgcccagtacctcttccccaagctgctgcagaagatggcagacctgc1320ggcagctggtcaccgagcacgcccagatgatgcagcggatcaagaagaccgagaccgaga1380cctcgctgcaccccctgctccaggagatctacaaggacatgtactgaggggtgcgccttg1440ggcctcccaacaggcctcccggagcaggtggacggcgcggggacagacactgcctgcggg1500acgtttccgttgaccagcccgagccctcagccgagcagcaggtcacaggctcagccagac1560gcacggcctcccactccttatagccctgcctcctctccctcctcagctcccctctctctc1620atctctttgctctttcttttccttcctctctcagcctcgctttctctctccccatcctgt1680ctgtccatctttctcttcctgtgagacagtttgtgttatttcaccagcaccaaaacaaga1740ccgctgctttgtcccctgctccccggccccggagcaggagggggcagggcctgccctctg1800caccaaccatcgccttctccagtcttcaaaggacacgcaggccatccaaagaaacactaa1860gctctccgggcctggcttactggggaagccacgcagggcctgggctgagtgccgagcagc1920cctagccacagggtccctgggggaggccgcccacccgaggctgaggctggcaccccatgg1980ctgagcggaccccgctcctgcagcatgcctcagccccacagacgcccacccctcttttgt2040ttttctttgcaccagtcttccaggccagtgccactgtgctggctgctggcggatgccccc2100agcctggatggaggtgggattccctccaggtgggggcgcccacacccccattgaagagga2160gcatgcctcaagggagcagttggtagggaaggcagtgggcagcagacttgattctgaccc2220caggccttgggtgggtcctccctcagcaccccactctctccagcctctgcagcagccact2280gagccctgcccacgctgtgtcagcatcgcacctcccacctccgcagcaccccggcttggc2340ctcagccacgcccttctttctccagccgggcgacactggctccagcccagctgaagcgca2400cactccctggagcgcctccagcacacgcagcacgagcactgaaatcactttacctgcagg2460ttccacaacctcggcctccctcctgaggcaggtggaccacagagctgtgcccctgactcc2520ccgggcgggcggggagccctgctgccccagcccagcactgctcgcaggggaggtacccag2580gatgaactgatcccgctcacttgtgacacccatttgttccagcagctctgctgccctccc2640ctttccttgtgattggcccagccaggcacctggagctctccctgcaccgcttctggtgac2700cagggaccctgccaggc2717(2)編碼序列表中SEQIDNo1的氨基酸，它由441個氨基酸殘基組成，其序列如下所示MEQPPEEAPEVREEEKKKEVAEAEGGPELNGEPEHSLPSSSCTDLSQSCSPPALLDQLQM60GCDGASCGGLSMECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRMKLEYEKCERICKIQKK120NRNKCQYCRFQKCLALGMSHNAIRFGRMPEAEKRKLVAGLTANEGSQHNPQVADLKAFSK180HLYSAYLKNFNMTKKKARAILTGKASHTAPFVIHDIETLffQAEKGLVWKQLVNGLPPYKE240ISVHVFYRCQCTTVETVRELTEFAKSIPSFDHFFLNDQVTLLKYGVHEAIFAMLASIVNK300DGLLVANGTGFVTREFLRSIRKPFSDIIEPKFEFAVKFNALELDDSDLALFIMIILCGD360RPGLMNVSQVEAIQDTILRALEFHLQANHPDAQYLFPKLLQKMADLRQLVTEHAQMMQRI420KKTETETSLHPLLQEIYKDMY441(3)與序列表中SEQIDNo2限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；(4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNo2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴謹條件為雜交后用含0.IXSSPE(或0.1XSSC),0.1%SDS的溶液在65°C下洗膜。上述影響豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的主效基因所編碼的蛋白質的名禾爾力_#±曾M^M舌g#D(PeroxisomeProliferator-ActivatedReceptorDelta，PPARD)，來源于豬，具有序列表中SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列，經過1_10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀相關的由SEQIDNo:1衍生的蛋白質。本發明的第二個目的是這樣實現的建立針對種豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀的分子育種方法(1)使用序列表中SEQIDNo3和SEQIDNo4的核苷酸序列，對待測的豬基因組DNA進行PCR擴增，染色對PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，確定自序列表中SEQIDNo:3的5，端第565位堿基或SEQIDNo:4的5，端第121位堿基為G還是A；(2)如果PCR擴增產物的單核苷酸多態結果是自序列表中SEQIDNo:4的5’端第121位堿基(即自序列表中SEQIDNo3的5’端第565位堿基)為G，其純合體的基因型為GG；自序列表中SEQIDNo4的5’端第121位堿基(即自序列表中SEQIDNo3的5’端第565位堿基)為A，其純合體的基因型為AA;它們的雜合體基因型為GA;AA基因型個體耳面積、耳重、胴體長和頭重極顯著地高于GA基因型和GG基因型個體，在脂肪沉積性狀(平均背膘厚)方面顯著低于GA基因型和GG基因型個體。下面通過實驗對本發明的第一個目的和第二個目的進行驗證1.利用白色杜洛克X二花臉F2資源家系精細定位目的基因申請人:在前期已報道的SSC7QTL區間內增加了8個基因的17個SNP和11個微衛星標記，檢測了白色杜洛克X二花臉資源家系Ftl，F1和F2代全部個體在這些標記位點的基因型。根據Nezer等(Genetics.2003，165，277-285)的標記輔助分離法，利用QTL區間內所有32個標記的信息，推斷出F1和F2公豬的QTL基因型，結果顯示9頭F1公豬都是Qq基因型(附圖1)。所有9條增加耳面積和耳重的Q染色體共享一段1.4Mb染色體區域(SW0671SRPKI)，而在q染色體中未發現共享單倍型(附圖2)。上述結果充分表明目的基因(QTG)位于所確定的1.4Mb染色體區域內。鑒于二花臉和白色杜洛克品種間所表現出的極顯著耳性狀表型差異，申請人推定二花臉和白色杜洛克分別固定了Q和q等位基因，并且所有祖代二花臉母豬都攜帶Q染色體。為了驗證該假設，申請人構建了19頭祖代個體(2頭公豬和17頭母豬)的單倍型，發現所有二花臉始祖的34條染色體在SW0671SRPKI1.4Mb區域內共享一段1.OMb的單倍型，該單倍型具有極顯著增加耳面積和耳重的效應(附圖3)。基于該結果，我們將目的基因位點精細定位到HMGAl到NC3652之間1.OMb的染色體區域。2.利用遠緣群體的選擇效應進一步精細定位目的基因耳大下垂是二花臉豬的品種特征之一。在長期的選育歷史中，大耳型的二花臉得以優先選留。農謗云“耳大者如佛、耳小者如賊”(張仲葛主編，中國豬品種志，上海科技出版社，1986)。申請人推測在此影響耳性狀的QTG區域，二花臉豬由于受選擇效應的影響會產生遺傳變異顯著減少的現象(selectionswe印)。為了驗證這一假設，申請人收集了代表所有二花臉遺傳背景的3個核心群的211個樣品、6個中國地方豬的216個樣品和3個西方商業品種的119個無相關個體樣品。利用HMGA1-NC3652這1.OMb區域內7個微衛星和31個SNP標記對上述樣品進行了檢測，發現二花臉豬在PACSIN-FANCE的680kb區域內22個相鄰標記的遺傳變異度極顯著下降，幾乎所有標記的高頻等位基因頻率都超過了0.90。尤其值得一提的是，這22個標記在72頭錫山二花臉豬中均無多態。相比之下，這些標記在其他中國地方豬種、西方商業豬種和野豬中都有較高的多態性(附圖4)。這表明二花臉豬在此680kb區域內經歷過強烈的正向選擇，有明顯的選擇效應，由此可以推定目的基因位于該680kb的染色體區域內。3.目的基因(QTG)的鑒別上述680kb區間對應于人的同源區包括13個已注釋的功能基因。申請人通過半定量反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測了這13個基因在耳組織中的表達情況，發現PPARD,FANCE,TAFII,ZNF76和SNRPC等5個基因在耳組織中高度表達，其他基因的表達量非常低或不表達。在5個高豐度表達的基因中，FANCE，TAFll，ZNF76和SNRPC是看家基因，他們是目的基因的可能性不大。PPARD是配體調控的轉錄因子，屬于核受體超家族，在生物多個重要過程中起關鍵作用(Barishetal.JClinInvest.2006，116:590_597)。例如，PPARD是促成CPLA2α活化β-catenin進而調控Wnt/β-catenin通路的關鍵分子(Hanetal.JCellBiochem.2008，105，534-545)，該通路在軟骨細胞增殖和分化等多種細胞行為中發揮關鍵作用(Macsaietal.JCellPhysiol.2007，215:578_587)。此外，PPARD還是脂肪代謝中的關鍵調控因子，它促進脂肪細胞和肌細胞的脂肪燃燒、增加能量消耗，這使得該基因成為肥胖及相關疾病治療中的研究熱點(Wangetal.Cell.2003，113，159—170；Evansetal.NatMed.2004，10，355-361)。鑒于PPARD的已知生物學功能及其在軟骨發育和脂肪代謝過程中的作用，PPARD是該QTL區域內最有可能的目的基因。申請人隨后通過實時反轉錄PCR檢測了PPARD基因在0，45，90，300日齡的二花臉和杜洛克豬耳組織中的表達情況，發現這兩個品種間的PPARD基因表達量沒有顯著差異(附圖5)，由此推論很可能是PPARD的結構突變而不是調節突變導致了該QTL的遺傳效應。4.關鍵因果突變位點(QTN)的鑒別申請人:自ENSEMBLE網站(http://www.ensembl.org/index.html)上搜尋到含豬PPARD基因的CH242-397F5BAC克隆(位置為35255108-35468260)。自NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載到1826bp的豬PPARD基因的cDNA編碼序列和部分3，，5，-UTR序列(序列接收號NM_214152)。通過Powerblast軟件比對確定了PPARD的內含子，外顯子和編碼區。利用上述來自ENSEMBLE網站(http://www.ensembl.org/index.html)的囊括了豬PPARD基因的一段72kb的DNA序列，使用在線Primer3.0軟件(http//frodo.wi.mit.edu/primer3/)設計多對引物擴增2頭白色杜洛克祖代和17頭二花臉祖代個體的基因組DNA(脫氧核糖核酸)。擴增片段采用QIAquickPCR產物純化試劑盒(QIAGEN，德國)純化。通過比較測序分析發現在引物1(F5'-TCCTGCCTGTCTTCTCGTGTC-3，；R5'-CCGGCTCTTCCTGAGGTCTGT-3，)擴增的1066個核苷酸組成序列(SEQIDNo3)的第565個核苷酸處存在一個鳥苷酸/腺苷酸替換的單核苷酸多態位點(SNPs)、即SNPG565A。該突變造成所編碼的PPARD蛋白第32個氨基酸由Gly突變成Glu(G32E)。此突變位點發生在哺乳動物高度保守及具有重要生物學功能的Intrinsciallydisorderdomain(功能域)，在人、鼠、牛、羊等哺乳動物中該位點均為Gly。申請人:進一步檢測了白色杜洛克X二花臉家系所有1000余個體的PPARDG32E基因型，通過標準關聯、標記輔助相關分析和F-下降檢驗(Zhao等，2003)分析了PPARDG32E對于耳性狀、脂肪沉積、胴體長和頭重的影響效應。標準關聯分析表明PPARDG32E與耳重(P=5.57XKr183)、耳面積(P=1.04XIO-164)、平均背膘厚(P=3.69XIO"158)、頭重(P=6.68X10—134)和胴體長(P=3.46X10—134)等性狀均呈極顯著相關。標記輔助關聯分析也顯示PPARDG32E對于上述性狀影響顯著(P<0.001)。此外，在QTL模型中把PPARDG32E作為固定效應后，QTL效應基本消失。這些結果確證了PPARDG32E不僅是SSC7上影響耳性狀的關鍵因果突變位點(QTN)，還對脂肪沉積、頭重和胴體長等性狀具有極顯著的“一因多效”影響效應。為了確定PPARDG32E的突變起源及在不同豬種中的群體遺傳學規律，申請人對來自10個中國地方豬種、11個歐洲豬種、3個西方商業品種及中、歐野豬的753個個體進行了PPARDG32E基因型判定。在中國地方豬種中，增加耳面積和耳重的A等位基因高頻(>0.80)存在于耳大下垂的品種中，以中等頻率存在于中型耳的品種中。相反，減小耳面積和耳重的G等位基因在所有野豬、歐洲地方豬、西方商業豬種和小型耳的中國地方豬種中固定(表1)。有2頭歐洲大黑豬為GA雜合子。該品種耳大且垂，文獻記錄表明在19世I己M其月i亥[π禾中帛入了巾ISJftAIt白勺m(http//www.ansi.okstate.edu/breeds/swine/largeblack/index.htm)。這些結果進一步表明PPARDG32E是影響耳性狀的主效基因。表1PPARDG32E在中外豬種中的等位基因頻率分布<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發明通過檢測PPARDG32E的單核苷酸多態性，即可確定耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的有利等位基因型，選擇有利的基因型個體留種，可以顯著提高種豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀的選育改良效率并且性狀遺傳穩定。圖1為通過標記輔助分離分析確定的白色杜洛克X二花臉家系9頭F1公豬的QTL基因型；縱坐標表示右耳面積，橫坐標表示F1公豬家系。橫坐標上、下方分別標明公豬耳號和相應的Z值。每頭公豬后代數列于標準誤上方。根據Nezer等方法計算Z值，即logH1/Htl，其中H1假設公豬QTL基因型是Qqjtl假設公豬QTL基因型是QQ或qq。增加耳面積的Q等位基因型用菱形表示，q等位基因型用圓圈表示。圖2為9頭Fl公豬Q染色體在QTL區間共享的1.4Mb單倍型(見紅色方框)；單倍型通過SimWalk2軟件構建。微衛星標記用黑斜體表示，等位基因型片段從短到長用數字連續編號，SNP的基因型用1(高頻)或2(低頻)表示。QTL置信區間側翼微衛星標記(S1856和S0666)用紅色標注。F1公豬耳號列于坐標軸左側，每條染色體QTL基因型列于右側。Q染色體共享的約1.4Mb單倍型用紅色框標示。圖3為二花臉始祖個體34條染色體在QTL區間共享的1.OMb單倍型(見紅色方框)；圖4中外豬種在QTL區間內38個標記位點的遺傳變異度；13個中外豬種的樣品數量和38個標記的雜合度如圖所示，微衛星標記用黑斜體表示。結果顯示二花臉豬在PACSIN和FANCE間680-kb區域內幾乎所有的標記位點趨于固定，表明在該區間二花臉豬發生了極強的選擇漂變(selectionsweep)。圖5為通過實時定量反轉錄PCR分析獲得的PPARD基因在二花臉和杜洛克耳組織中的表達情況；分別采集了0，45士3，90士3和300士3共4個日齡的二花臉和杜洛克豬耳組織樣品用于RNA的提取，其中每個日齡6個樣品。實時定量反轉錄PCR做三次重復反應，取平均值作為終值。結果顯示二花臉和杜洛克豬之間在這4個日齡段的PPARD表達水平無顯者差升。圖6為本發明鑒別的豬PPARDG32E點突變位點的序列峰圖；圖7為PPARDG32E的SNAPshot判型圖，其中a為GG型；b為AA型；c為AG型。具體實施例方式實施例1:PPARDG32E在白色杜洛克X二花臉資源群體中對耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的影響效應。(I)PPARDG32E的基因型判定設計引物對F2和R2(F2:5，-CGGCTGTTTTACAGGAAGGA-3，；R2:5，-CTGCACTCAGACCCAGATGA-3，)擴增包含PPARDG32E的DNA片段，設計合成另一條用于SNAPshot反應的延伸引物(5，-TTTTTTTTTTGCTGGAGGGAAGCGAGTGCTCTGGT-3，)。利用引物對F2和R2擴增豬基因組DNA的15μ1的PCR反應體系中，包括40ng豬基因組DNA，35mMMgCl2,20mMdNTP，正反向引物各2pmol，2單位Taq酶及1XPCRbuffer(上海生物工程公司，中國)。擴增條件為94°C3min；94°C30s,67°C30s,72°C40s，共30個循環；最后在72°C延伸lOmin。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。取2.5μ1PCR產物，加入0.5μ1ExoSAP-IT酶(上海國藥集團公司，中國)37°C孵育45min，然后80°C處理15min滅活酶。SNAPshot反應體系為SNAPshot反應混合物(MultiplexReadyReactionMix)2μ1；SNAPshot延伸引物0.2μ1(引物終濃度為0.4ymol/L)；上述純化PCR產物2.Oμ1；去離子水0.7μ1。SNAPshot循環參數為96°C10s，50°C5s，60°C30s，共30循環。取5μ1SNAPshot反應產物加入0.57μ1IOXbufffer和0.1μ1CIP(SNAPshot反應產物純化酶)在37°C下孵育lh，然后75°C處理15min滅活酶達到產物純化效果，_20°C保存備用。取1.75μ1上述經純化后的SNAPshot反應產物、8.Oμ1甲酰胺變性劑(Hi-Diformamide)和0.25μ1GeneScan120LIZsizestandard(電泳分子內標)。體系混合后于95°C變性5min，然后立即置于冰上處理2min，離心上樣于ABI3130XL遺傳分析儀進行毛細管電泳分離和基因型判定。具體判型方法如附圖2所示。2.PPARDG32E對耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的影響效應以白色杜洛克X二花臉資源家系1000余頭F2代個體為實驗對象進行PPARDG32E與豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀的關聯性分析，具體方法如下按照上述步驟1的方法，分別以1000多頭F2代豬的豬耳組織基因組的總DNA為模板，在引物對F2和R2的引導下進行PCR擴增，利用ABI公司SNAPshot技術檢測5’_TTTTTTTTTTGCTGGAGGGAAGCGAGTGCTCTGGT-3，延伸后3，端的堿基。如檢測結果表明自序列表中SEQIDNo4的5，端第121位堿基，即序列表中SEQIDNo3的5，端565位堿基為G時，其純合體的基因型為GG；自序列表中SEQIDNO4的5’端第121位堿基，即序列表中序列3的5’端第565位堿基為A時，其純合體的基因型為AA；它們的雜合體基因型為GA。用標準關聯、標記輔助相關分析和F-下降檢驗分析PPARDG32E與耳性狀(耳面積和耳重)，脂肪沉積性狀(平均背膘厚)、胴體長和頭重性狀的相關性。標準關聯分析表明PPARDG32E與耳重(P=5.57X1(Γ183)、耳面積(P=1.04Χ1(Γ164)、平均背膘厚(P=3.69Χ10_158)、頭重(P=6.68Χ10_134)和胴體長(P=3.46Χ10_134)極顯著相關。標記輔助關聯分析也顯示PPARDG32E對于上述性狀影響顯著(P<0.001)。此外，在QTL模型中把該SNP作為固定效應后，QTL效應基本消失，該SNP位點可以解釋大于97%的QTL效應(表2)。這些結果都證實了PPARDG32E是豬7號染色體上影響耳性狀、頭重、體長和脂肪沉積的主效突變位點。AA基因型個體的耳面積、耳重、胴體長和頭重極顯著地高于GA和GG基因型個體，而在脂肪沉積性狀(平均背膘厚)方面極顯著地低于GA和GG基因型個體。通過群體繼代選育不同基因型的個體，可以對種豬的耳面積、耳重、胴體長、頭重和脂肪沉積性狀獲得高效的選育改良效果。表2PPARDG32E對白色杜洛克X二花臉資源家系F2群體目的性狀的影響效應<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>a相關計算根據Zhao等報道(2003)。我們用4個模型進行相關性檢測y=μ+SNP+固定效應+協變量+y=μ+SNP+固定效應+協變量+e(模型1，SNP模型)；y=μ+固定效應+協變量+e(模型2，簡約模型)；y=μ+QTL+SNP+固定效應+協變量+e(模型3，QTL+SNP模型)；y=μ+QTL+固定效應+協變量+e(模型4，QTL模型)；y是性狀值，μ是平均值，e表示殘差。模型中固定效應為性別和批次，協變量為胴體重。標準相關通過模型1和模型2殘差平方和的F比率計算；標記輔助相關通過模型3和模型4殘差平方和的F比率計算；F下降檢驗通過模型1和模型3殘差平方和的F比率計算。實施例2=PPARDG32E在6個遠緣群體中對耳面積的影響效應。申請人:采集了二花臉豬、杭豬、玉山黑豬、蘇鐘豬、蘇姜豬和蘇太豬等6個遠緣群體中經產2胎以上的574頭成年母豬的耳組織樣品，提取基因組DNA。對受試個體采用如下方法進行耳面積的測量將一把標準直尺與豬耳平行放置，通過垂直對焦拍攝高分辨率的豬耳照片，以標準直尺為參照，利用LaicaQwin面積測量軟件計算出每個個體的豬耳面積。按照實施例1中步驟1的方法，以上述遠緣群體個體的基因組DNA為模板，在引物對F2和R2的引導下進行PCR擴增，利用ABI公司SNAPshot技術檢測5，-TTTTTTTTTTGCTGGAGGGAAGCGAGTGCTCTGGT-3，延伸后3，端的堿基(即擴增產物121bp處堿基)。如檢測結果表明自序列表中SEQIDNo4的5’端第121位堿基，即序列表中SEQIDNo3的5，端565位堿基為G時，其純合體的基因型為GG；自序列表中SEQIDNO4的5，端第121位堿基，即序列表中序列3的5’端第565位堿基為A時，其純合體的基因型為AA；它們的雜合體基因型為GA。利用SAS9.0軟件的GLM程序進行PPARDG32E與耳面積的標準關聯分析。結果表明PPARDG32E與各個群體的耳面積性狀均顯著相關(P<0.05)，AA基因型個體的耳面積顯著地高于GA和GG基因型個體(表3)。這些結果再次證實了PPARDG32E是影響豬耳面積的關鍵因果突變位點(QTN)。表3PPARDG32E在6個遠緣群體中對耳面積的影響效應<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>權利要求一個影響豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的主效基因，其特征在于cDNA序列具有下述核苷酸序列之一(1)序列表中SEQIDNo2的多核苷酸，它由2717個堿基組成，其序列如下所示gttgacaggaactgccctgtagaggtccatctgcactcagacccagatgatgccagagct60atgaccgggcctgcaggcgtggcgccgaggggaagtcagccatggagcagccgccggagg120aagcccctgaggtccgggaagaggagaagaaaaaggaagtggcagaggccgaaggaggcc180cagagctcaatgggggaccagagcactcgcttccctccagcagctgtacagatctctccc240agagctgctctccacccgcgctgctggaccagctgcagatgggctgcgacggggcctcgt300gcggtggcctcagcatggagtgccgggtgtgcggggacaaggcatcaggcttccactacg360gagtccacgcttgcgaggggtgcaagggcttcttccgccggacaatccgcatgaagctgg420agtacgagaagtgtgagcggatctgcaagatccagaagaagaaccgcaacaagtgccagt480actgccgcttccagaaatgcctggcgctgggcatgtctcacaacgccattcgctttggcc540ggatgcccgaggcagagaaaaggaagctggtggctgggctgacggcaaacgaggggagtc600agcacaacccgcaggtggctgacctgaaggccttctccaagcacctctacagcgcctacc660tgaaaaacttcaacatgaccaaaaagaaggcccgcgccatcctcaccggcaaggccagcc720acacagcgccctttgtgatccacgacatcgagacgttgtggcaggccgagaagggcctgg780tgtggaagcagctggtgaatggcctgccgccctacaaggagatcagcgtgcacgtcttct840accgctgccagtgcaccacggtggagacggtgcgcgagctgaccgagttcgccaagagca900tccccagcttcgaccacctcttcctcaacgaccaggtgacccttctcaagtacggcgtgc960acgaggccatcttcgccatgctggcctccatcgtcaataaggatgggctgctggtggcca1020acggcactggttttgtcacccgcgagttcctgcgcagcatccgaaagcccttcagtgaca1080tcattgagcccaagtttgagttcgctgtcaagttcaatgccctggaactcgatgatagtg1140acctggctctcttcatcgcagccatcattctgtgtggagaccggccaggcctcatgaacg1200tgtcacaggtggaggccatccaggacaccatcctgcgtgccctcgagttccacctgcagg1260ccaaccaccccgacgcccagtacctcttccccaagctgctgcagaagatggcagacctgc1320ggcagctggtcaccgagcacgcccagatgatgcagcggatcaagaagaccgagaccgaga1380cctcgctgcaccccctgctccaggagatctacaaggacatgtactgaggggtgcgccttg1440ggcctcccaacaggcctcccggagcaggtggacggcgcggggacagacactgcctgcggg1500acgtttccgttgaccagcccgagccctcagccgagcagcaggtcacaggctcagccagac1560gcacggcctcccactccttatagccctgcctcctctccctcctcagctcccctctctctc1620atctctttgctctttcttttccttcctctctcagcctcgctttctctctccccatcctgt1680ctgtccatctttctcttcctgtgagacagtttgtgttatttcaccagcaccaaaacaaga1740ccgctgctttgtcccctgctccccggccccggagcaggagggggcagggcctgccctctg1800caccaaccatcgccttctccagtcttcaaaggacacgcaggccatccaaagaaacactaa1860gctctccgggcctggcttactggggaagccacgcagggcctgggctgagtgccgagcagc1920cctagccacagggtccctgggggaggccgcccacccgaggctgaggctggcaccccatgg1980ctgagcggaccccgctcctgcagcatgcctcagccccacagacgcccacccctcttttgt2040ttttctttgcaccagtcttccaggccagtgccactgtgctggctgctggcggatgccccc2100agcctggatggaggtgggattccctccaggtgggggcgcccacacccccattgaagagga2160gcatgcctcaagggagcagttggtagggaaggcagtgggcagcagacttgattctgaccc2220caggccttgggtgggtcctccctcagcaccccactctctccagcctctgcagcagccact2280gagccctgcccacgctgtgtcagcatcgcacctcccacctccgcagcaccccggcttggc2340ctcagccacgcccttctttctccagccgggcgacactggctccagcccagctgaagcgca2400cactccctggagcgcctccagcacacgcagcacgagcactgaaatcactttacctgcagg2460ttccacaacctcggcctccctcctgaggcaggtggaccacagagctgtgcccctgactcc2520ccgggcgggcggggagccctgctgccccagcccagcactgctcgcaggggaggtacccag2580gatgaactgatcccgctcacttgtgacacccatttgttccagcagctctgctgccctccc2640ctttccttgtgattggcccagccaggcacctggagctctccctgcaccgcttctggtgac2700cagggaccctgccaggc2717；(2)編碼序列表中SEQIDNo1的氨基酸，它由441個氨基酸殘基組成，其序列如下所示MEQPPEEAPEVREEEKKKEVAEAEGGPELNGEPEHSLPSSSCTDLSQSCSPPALLDQLQM60GCDGASCGGLSMECRVCGDKASGFHYGVHACEGCKGFFRRTIRMKLEYEKCERICKIQKK120NRNKCQYCRFQKCLALGMSHNAIRFGRMPEAEKRKLVAGLTANEGSQHNPQVADLKAFSK180HLYSAYLKNFNMTKKKARAILTGKASHTAPFVIHDIETLWQAEKGLVWKQLVNGLPPYKE240ISVHVFYRCQCTTVETVRELTEFAKSIPSFDHFFLNDQVTLLKYGVHEAIFAMLASIVNK300DGLLVANGTGFVTREFLRSIRKPFSDIIEPKFEFAVKFNALELDDSDLALFIAAIILCGD360RPGLMNVSQVEAIQDTILRALEFHLQANHPDAQYLFPKLLQKMADLRQLVTEHAQMMQRI420KKTETETSLHPLLQEIYKDMY441；(3)與序列表中SEQIDNo2限定的核苷酸序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；(4)在高嚴謹條件下可與序列表中的SEQIDNo2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。2.如權利要求1所述的主效基因，其特征在于所述cDNA序列的編碼序列為序列表中SEQIDNo:2的自5，端第102位至1427位的堿基。3.如權利要求1所述的主效基因，其特征在于主效基因所翻譯的蛋白質的名稱為過氧化物酶體增殖物激活受體D，來源于豬，具有序列表中SEQIDNo:1的氨基酸殘基序列，經過1-10個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且與豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀相關的由SEQIDNo1衍生的蛋白質。4.一種針對種豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀的分子育種方法，其特征在于(1)、使用序列表中SEQIDNo:3和SEQIDNo:4的核苷酸序列，對待測的豬基因組DNA進行PCR擴增，染色對PCR擴增產物進行單核苷酸多態性檢測，確定自序列表中SEQIDNo3的5’端第565位堿基或SEQIDNo:4的5’端第121位堿基為G還是A；(2)、如果PCR擴增產物的單核苷酸多態結果是自序列表中SEQIDNo:4的5’端第121位堿基(即自序列表中SEQIDNo:3的5’端第565位堿基)為G，其純合體的基因型為GG;自序列表中SEQIDNo4的5，端第121位堿基(即自序列表中SEQIDNo3的5，端第565位堿基)為A，其純合體的基因型為AA；它們的雜合體基因型為GA；AA基因型個體耳面積、耳重、胴體長和頭重極顯著地高于GA基因型和GG基因型個體，在脂肪沉積性狀(平均背膘厚)方面顯著低于GA基因型和GG基因型個體。5.豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀的主效基因在種豬遺傳改良中的應用。全文摘要本發明涉及PPARD主效基因的鑒別、分子育種方法的建立及在種豬遺傳改良中的應用。本發明通過利用白色杜洛克×二花臉資源群體和中外豬種遠緣群體，通過全基因組掃描連鎖定位、目的區域基于高密度SNP標記的IBD精細定位和遠緣群體的選擇效應分析、最后鑒別了豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長的主效基因-PPARD和關鍵因果突變位點-G32E。通過現代分子生物學技術檢測該位點，利用基因輔助選擇的方法，選擇有利的基因型個體留種，可以顯著提高種豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長性狀的選育改良效率。本發明還公開了上述基因及其因果突變位點的鑒別過程以及利用本發明的基因標記進行豬耳性狀、脂肪沉積、頭重和胴體長選育的方法。文檔編號C12Q1/68GK101805739SQ20091018671公開日2010年8月18日申請日期2009年12月15日優先權日2009年12月15日發明者喬瑞敏,任軍,姚飛,段艷宇,黃路生申請人:江西農業大學