專利名稱：一種轉精氨酸酶基因玉米育種方法
技術領域：
本發明屬于農業育種領域，具體是涉及一種轉精氨酸酶基因玉米育種方法。
背景技術：
玉米(Zea maysL.)是世界上重要的糧食、飼料作物，也是現代工業的重要原料。隨著工農業的發展及世界人口的增長，對玉米的需求量逐年攀升。據相關研究推測，到2020年世界玉米需求量將達到7. 53億t，屆時中國玉米需求量為2. 14億t，將使玉米生產面臨巨大挑戰。但傳統的育種方法面臨著推廣品種單一化，育種材料遺傳基礎越來越狹窄，基因庫日益貧乏等問題，加之常規育種周期長，預見性差，很難使作物在產量、質量和抗性方面有大的提聞。近年來，隨著生物技術的迅速發展和不斷完善，采用基因工程手段進行作物遺傳育種和新種質的創造已成為可能，運用轉基因技術提高作物產量的報道屢見不鮮。Dinkins等(2003)利用基因槍技術將15kDaS-玉米醇溶蛋白基因轉入大豆中，對轉基因后代進行氨基酸組分分析，發現甲硫氨酸提高了 12%_20%，半胱氨酸提高了 15%-35%，而其他的氨基酸組分沒有發生明顯的變化。丁明忠等(2000)利用花粉管通道法和減壓滲透法將大豆總DNA導入玉米，篩選到8個高蛋白材料，玉米種子中蛋白質含量比對照提高20%。Zheng等(1995)將菜豆種子蛋白質基因導入水稻中表達，使得轉基因水稻種子總蛋白含量增加4%，賴氨酸含量也有所提高。Regierer等(2002)把修飾過的質體腺苷酸激酶基因導入馬鈴薯中，轉基因馬鈴薯塊莖中腺苷酸水平得到明顯提高，淀粉含量增加了 60%，塊莖產量增加了39%。這些研究成果，為高產育種技術奠定了基礎，也表明了隨著轉基因技術的興起，優質、聞廣的良種選育技術將步入一條快速、薪新的道路。產量是一個較為復雜的農藝性狀，受多種基因與環境的相互作用所控制其中，光合作用，氮素同化，碳源分配 ，植株株型等生理過程是產量形成的基礎。產量性狀一直是作物育種計劃的主要目標性狀，近年來伴隨人口激增，可耕地面積減少，農業環境逐漸惡化，世界糧食安全問題愈加突出，提高作物單位面積糧食產量顯得更為重要。雖然目前對產量性狀分子機制的研究尚處于初步階段(van Camp，2005)，但許多與產量形成密切相關的生理過程，如光合作用、碳源分配、淀粉合成等的分子機制已逐步被揭開。隨著植物基因組測序工程的逐漸完善，控制上述生理過程的許多基因已被成功分離(表I )，并通過基因工程手段對其進行遺傳修飾，最終獲得了產量性狀得以明顯改善的轉基因植物。表I部分產量相關基因及其功能TablelParts of genes related to grain yield and their functions
權利要求
1.一種轉精氨酸酶基因玉米育種方法，其包括如下步驟 (1)以pCAMBIA5300-ub1-Tnos為基礎載體，去除原來載體的HPT基因，換上了來自NK603中35S驅動的CP4EPSPS基因，將精氨酸酶基因ZmArg、異戊烯基轉移酶基因ZmIPT2和細胞壁轉化酶基因ZmMnl插入多克隆位點Sma I之后，構建單子葉植物超量表達載體； (2)單子葉植物超量表達載體經三親雜交法將目的基因轉移至農桿菌，挑取單菌落，進行PCR鑒定得到目標農桿菌； (3)試驗材料的準備自交系玉米種子分別在60-80%酒精浸泡40s-50，O.05-0. 15%升萊消毒8-12min,無菌水沖洗,然后將種子浸泡在無菌水中，置于37°C水浴中4 5h ; (4)農桿菌侵染萌動胚在超凈臺里用解剖刀在玉米萌動胚的生長點處劃開I 3mm的口子，放入制備好的農桿菌工程菌液中浸染芽尖，26-30°C，200-240r/min振蕩20_28h，然后把種子放在MS固體培養基上共培養2-4d ； (5)移栽用清水洗掉菌體，轉入2-6mg/LPPT的選擇培養基中培養7_10天，除去矮化、生長緩慢的植株，選擇正常的移栽到裝有滅菌蛭石的營養缽中； (6)在轉化苗長到3-4葉期時，均勻噴灑合適濃度的草甘膦水溶液行篩選，存活植株長到5-6葉期時移栽到田間收獲目標玉米種。
2.根據權利要求1所述的育種方法，所述的ZmArg基因序列為SEQID NO.1。
3.根據權利要求1所述的育種方法，所述的步驟(I)具體步驟如下 (1)用SacII和Aat II雙酶切載體pCAMBIA5300去除潮霉素基因(HPT)后，將其左邊界(T-border)序列重組連接,連接產物轉化E. coli DH5,挑取單菌落堿裂解法提取質粒,限制性內切酶酶切鑒定； (2)將EPSPS基因與經AatII酶切去除潮霉素基因的載體pCAMBIA5300后重組連接，產物轉化E. coli DH5感受態細胞，挑取單菌落振蕩培養過夜并用堿裂解法提取質粒，限制性內切酶酶切鑒定和質粒PCR檢測； (3)將擴增得到的ZmArg基因和經SmaI酶切后的線性中間載體；pCAMBIA5300_EPSPS重組連接，轉化E. coli DH5感受態細胞，挑取單菌落震蕩培養過夜并用堿裂解法提取質粒; (4)三親雜交法將目的基因轉移至農桿菌，挑取單菌落，進行PCR鑒定得到目標農桿菌。
4.根據權利要求1所述的育種方法，所述的自交系玉米種子選自KF298、KF513或K10。
全文摘要
本發明公開了一種轉精氨酸酶基因玉米育種方法，由玉米中克隆ZmArg基因，采用農桿菌介導法轉化玉米極早熟自交系，創造高產玉米新種質。采用本發明的方法能高效的將外源ZmArg基因已轉入玉米自交系中，并且成功表達，在玉米生長的各個時期的精氨酸酶水平都有所提高，穗粗、粒長、粒寬等產量性狀也有相應的增加。
文檔編號C12N15/82GK103045641SQ201310004209
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月7日 優先權日2013年1月7日
發明者王振華, 邸宏, 曾興, 張 林, 劉顯君, 翁建峰, 張佩 申請人:曾興