稻瘟病抗病基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標記、標記方法、引物與用途
【專利摘要】本發明是一種稻瘟病抗病基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標記，該分子標記的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。本發明還公開了一種PCR擴增稻瘟病抗病基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標記的擴增引物；以及稻瘟病抗性基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標記在Pi-ta抗性位點的基因分型或者Pi-ta基因的輔助選擇育種中的用途，本發明還公開了稻瘟病抗病基因Pi-ta輔助育種的InDel分子標記的功能標記方法。本發明具有操作簡便、節約成本的優點，尤其適合于育種中的大規模Pi-ta抗性基因鑒定及標記輔助選擇育種，適于推廣應用。
【專利說明】稻瘍病抗病基因/V-1a輔助育種的InDeI分子標記、標記方法、引物與用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及稻瘟病抗病基因的功能標記、標記方法、擴增引物與用途，屬于作物分子育種領域。
【背景技術】
[0002]水稻稻痕病由子囊菌Magnaporthe grisea (Hebert)Barr引起，是世界水稻生產中最嚴重的病害之一，每年因稻瘟病導致的損失，約占總產量的10-15% (Zheng etal.，2009)。目前，控制稻瘟病的主要手段是噴灑農藥和應用抗病品種，前者會對環境造成一定的污染，不利于農業的可持續發展；后者雖是安全有效的途徑，但由于稻瘟菌生理小種的易變性，往往會導致單個抗病位點的水稻品種在種植3-5年后將會喪失抗性。實踐證明聚合多個抗病基因可有效持久抵御稻瘟病的侵染，因此，挖掘并合理利用抗病種質資源是解決這一病害的最佳舉措。截至2013年8月，已至少報道了 68個抗稻瘟病位點共83 個主效基因(http://www.ricedata.cn/gene/gene_p1.htm),據此，前人已開發了一批與這些基因緊密連鎖的分子標記或基因序列本身的功能標記(Qu et al.，2006，Liu etal.，2008，Zhang et al.，2013)，它們為水稻抗病基因分型及抗病聚合育種奠定了基礎。
[0003]P1-ta是一個具廣譜抗性的顯性稻瘟病抗性基因，該基因編碼產物能與稻瘟病菌的無毒基因J互作，引起抗病反應(Byran et al.，2000)。因此，挖掘并有效利用該基因將有助于水稻稻瘟病的抗性育種研究。前人利用該基因抗性位點與感病基因有一個堿基的差異，開發出三引物或四引物的SNP標記，但其中或存在檢測過程較為復雜，或對試驗條件要求較高，不利于規?；瘜π?te抗性位點分型及標記輔助育種(Jia etal., 2004, Hayashi et al., 2006, Wang et al., 2007, Zhang et al., 2013)。

【發明內容】

[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種稻瘟病抗性基因P1-1a輔助育種的InDel (insertion-deletion)分子標記,其能用于P1-1a基因的輔助選擇育種，同時有助于抗性位點的快速、系統地分型。
[0005]本發明所要解決的另一個技術問題是提供了前述稻瘟病抗病基因朽-te輔助育種的InDel分子標記的標記方法、擴增引物與用途。
[0006]本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種稻瘟病抗性基因輔助育種的InDel分子標記,該分子標記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0007]本發明的稻瘟病抗性基因朽輔助育種的InDel分子標記，是基于PCR技術，PCR擴增引物為下列引物對，核苷酸序列為5’ 一 3’，
正向引物:GTACATGTTTCATACCC (SEQ ID N0.2),
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA (SEQ ID N0.3)
本發明還提供了稻瘟病抗性基因朽-to輔助育種的InDel分子標記的具體用途:用于對P1-ta抗性位點的基因分型，或用于P1-1a基因的輔助選擇育種。
[0008]發明人在發明過程中，
首先，根據目前含有PHa抗病基因品種的序列，與感病品種“日本晴”序列比對，在朽-te抗病基因的2373位置，找到一個感病品種“日本晴”在該位置的一個“T”堿基的插入。
[0009]然后，本發明在插入的兩側開發了一對引物，利用該標記我們已對46份重要品種進行抗性位點的基因分型，并與四引物擴增受阻突變體系PCR相互比較，分型結果完
全一致。[0010]本發明的具體技術內容如下:為了能夠找到一個便于應用的朽-1a分子功能標記，我們根據已公布的抗病位點在不同品種中的序列，比較抗感序列之間的單核苷酸多態性，于朽-h基因的2373位置找到一個在感病品種中的單“T”插入(圖1)。利用這個SNP設計了一個InDel分子標記，并對46份重要品種進行PCR擴增，利用12%PAGE(polyacrylamide gelelectrophoresis)電泳檢測到25份和陽性對照一致的帶型，其余21份則為陰性帶型；同時，我們還應用四引物擴增受阻突變體系PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測這些品種，得到完全一致的結果(圖2，3)。該InDel標記能對很多品種進行有效的分型，可提高A'-1a基因在育種中的效率。
[0011]相對于現有技術，本發明具有操作簡便、節約成本的優點，尤其適合于育種中的大規?？剐曰蜩b定及標記輔助選擇育種，適于推廣應用。
[0012]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1,含P1-ta抗性基因的不同水稻品種與感病品種“日本晴”在InDel標記位點的序列Alignment分析圖,框內堿基即為本發明的InDel標記所在的SNP位點；
圖2,本發明InDel標記的設計圖；
圖3,不同水稻品種的InDel分子標記的電泳分析圖；
圖3中:M:marker; 1-48:Tet印、日本晴、早恢89、圭630、鹽都295、鎮稻187、連嘉粳I號、長粒爪、C101PKT、培矮64、連豐糯、F-124-1、明恢63、桂朝2號、寧恢627、吉粳509、鹽豐47、鹽粳456、圣稻068、鹽粳16、嘉花I號、新稻22、新稻10號、明恢86、蜀恢527、廣恢128、遼粳727、臺灣50、連粳7號、密陽46、9311、揚稻2號、臺灣65、抗鹽100、Tequing、臺灣30、寧恢311、津1007、先恢207、津原85、津粳235、鄭稻19、蜀恢881、中花15、廣占63S、巴西陸稻、淮糯12、臺灣65。
[0013]圖4，按圖3不同水稻品種的順序，采用四引物擴增受阻突變體系PCR擴增的電泳分析圖；
圖5，按明恢86和蜀恢527配組的F2代，1:明恢86，2:蜀恢527，3-23是F2代株系。
[0014]【具體實施方式】
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。以下實施例用于說明本發明而不限制本發明的范圍。實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0015]實施例1，一種稻痕病抗病基因輔助育種的InDel分子標記，該分子標記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
[0016]實施例2，一種PCR擴增實施例1所述的稻瘟病抗病基因朽-1a輔助育種的InDel分子標記的擴增引物，所述的PCR擴增引物為下列引物對，其核苷酸序列為5’ 一 3’正向引物:GTACATGTTTCATACCC, SEQ ID N0.2，
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA，SEQ ID N0.3。
[0017]實施例3，實施例1所述的稻瘟病抗性基因P1-ta輔助育種的InDel分子標記在P1-ta抗性位點的基因分型或者基因的輔助選擇育種中的用途。
[0018]實施例4，參照圖1-5，實施例1所述的稻瘟病抗病基因朽-1a輔助育種的InDel分子標記的功能標記方法，其步驟如下:
1.根據對含朽-1a抗性基因的7個品種——(Tetep, C101PKT, C101A51, P1-4, Tequing, Katy, F-124-1)測序，其序列分別參見SEQ ID N0.4 — SEQ ID N0.10，并與日本晴序列進行比對分析，發現在朽-te基因的2373位點處，感病品種“日本晴”有一個” T”插入，由此，我們在此SNP前后設計一對PCR引物，
正向引物:GTACATGTTTCATACCC，
反向引物:TAGTTTAGTCGCCTAA，
PCR擴增的產物在朽-te抗性基因為44 bp,感病基因為45 bp。圖1為以Tet印的P1-ta基因為參照，與截取其它品種中的包含設計引物序列的比對。
[0019]2.DNA提取:按CTAB法提取水稻基因組DNA。
[0020]3.PCR擴增PCR擴增反應體系為:2 X Taq Master Mix 12.5 μ I,上游引物(10μ mol/L) I μ?，下游引物(10 μ mol/L) I μ?,模板DNA I μ?,反應總體積25 μ I。反應程序為:94°C預變性5 min，94°C變性30s，48°C退火30s，72°C延伸20s，35個循環，72°C延伸10 min，4°C保存。
[0021 ] 4.PCR產物電泳:配制12%的PAGE，取步驟3擴增所得的PCR產物2.0 μ I，以DNAMARKERDL500作為分子量對照，親本分型采用雙垂直電泳槽，在170V恒壓下電泳1:30小時，F2分型采用垂直電泳槽，在100V恒壓下電泳10:00小時。銀染顯示DNA條帶。
[0022]5.電泳圖譜分析:用凝膠成像系統拍照，通過比對DNAMarker找到目標條帶，根據片段大小判斷抗感基因。
[0023]SEQ ID N0.1中2343— 2435序列為該發明設計引物的區域。
[0024]為了證明本發明的適用性，本發明設置了如下對比試驗:
實驗1，隨機選取國內不同地區比較有代表性的品種46個，以本發明的PCR標記與前人開發的四引物擴增受阻突變體系進行PCR擴增對比分析，結果完全一致。
[0025]實驗2，以本發明標記分型的抗性品種明恢86與感性品種蜀恢527雜交，F2代隨機取樣21株進行抗性位點的基因分型(如圖5)，結果顯示抗性、感性及雜合帶型都能比較明顯區分出來。
[0026]以上列舉的僅限于本發明具體實施例，事實上還應有許多變形，若本領域的相關人員能從本發明公開的內容直接導出或引申出的所有變形，均應為本發明的保護范圍。
[0027]SEQUENCE LISTING
〈110〉江蘇金萬禾農業科技有限公司 江蘇勝田農業科技發展有限公司 〈120〉稻痕病抗病基因P1-ta輔助育種的InDel分子標記、標記方法、擴增引物與用途 〈160〉 10
<170> PatentIn version 3.3
【權利要求】
1.一種稻痕病抗病基因/輔助育種的InDel分子標記,其特征在于:該分子標記的核苷酸序列為SEQ ID N0.1。
2.—種PCR擴增權利要求1所述的稻瘟病抗病基因輔助育種的InDel分子標記的擴增引物，其特征在于:所述的PCR擴增引物為下列引物對，其核苷酸序列為5’ 一3’
正向引物:GTACATGTTTCATACCC, SEQ ID N0.2 ； 反向引物:TAGITTAGTCGCCTAA，SEQ ID N0.3。
3.權利要求1所述的稻瘟病抗性基因輔助育種的InDel分子標記在Pi_ta抗性位點的基因分型或者基因的輔助選擇育種中的用途。
4.權利要求1所述的稻瘟病抗病基因輔助育種的InDel分子標記的功能標記方法，其特征在于，其步驟如下: (I)引物設計:根據對含朽-1a抗性基因的7個品種SEQ ID N0.4- SEQ ID N0.10, BPTetep, C101PKT, C101A51, P1-4, Tequing, Katy, F-124-1 進行測序，并與日本晴序列進行比對分析，發現在朽-te基因的2373位點處，感病品種“日本晴”有一個“T”插入，由此，在此SNP前后設計一對PCR引物，正向引物:GTACATGTTTCATACCC,反向引物:TAGTTTAGTCGCCTM，PCR擴增的產物在朽-1a抗性基因為44 bp,感病基因為45 bp ; (2) DNA提取:按CTAB法提取水稻基因組DNA ； (3)PCR 擴增:PCR 擴增反應體系為:2 X Ta^Master Mix 12.5 μ 1,10 μ mol/L 上游引物I μ 1， 10 μ mol/L下游引物I μ I,模板DNA I μ I,反應總體積25 μ I ;反應程序為:94°C預變性5 min， 94°C變性30s，48°C退火30s，72°C延伸20s，35個循環，72°C延伸.10 min，4°C保存； (4)PCR產物電泳:配制12%的PAGE，取步驟3擴增所得的PCR產物2.0 μ 1，以DNAMARKERDL500作為分子量對照，親本分型采用雙垂直電泳槽，在170V恒壓下電泳1:30小時，F2分型采用垂直電泳槽，在100V恒壓下電泳10:00小時；銀染顯示DNA條帶； (5)電泳圖譜分析:用凝膠成像系統拍照，通過比對DNAMarker找到目標條帶，根據片段大小判斷抗感基因。
【文檔編號】C12Q1/68GK103834648SQ201410112643
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月25日 優先權日:2014年3月25日
【發明者】溫以斌, 劉輝, 查日揚, 孟德龍, 潘啟民 申請人:江蘇金萬禾農業科技有限公司, 江蘇勝田農業科技發展有限公司