專利名稱：一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法
技術領域：
屬于生物育種技術領域，確切地說是涉及一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的 方法。
背景技術：
蘭屬(Cymbidium)是蘭科(Orchidaceae)植物中最早引入栽培的屬之一。國蘭狹 義地指蘭屬中的五種地生種春蘭Spring Orchid (C. goeringii)、建蘭AutumnOrchid (C. ensifolium)、寒蘭 Winter Orchid(C. hanran)、墨蘭 Dark Orchid(C. sinense)和 惠蘭 Fragrant Orchid (C. faberi)，其香氣馥郁、色澤淡雅，花姿秀美，葉態飄逸。我國具有非常豐富的國蘭原生種和栽培品種，其種質資源相當豐富，蘊藏有極為 豐富的優良基因，但在新品種培育中尚未得到開發利用。目前，對于國蘭的研究主要集中在 快速繁殖方面，利用莖尖、莖段、花梗、葉片、花瓣、根段等作為外植體進行組織培養的研究 有較多的文獻資料，而雜交育種工作國內的報告很少，幾乎沒有開展。目前，國蘭的品種培 育仍然主要依靠從野生植株中選擇的傳統觀念和做法，蘭花的人工新品種培育工作一直沒 能得到應有的重視，人工培育的具有經濟價值的新品種則少之又少，在花卉新品種的培育 中(包括農林園藝的其它作物)很少有像國蘭這樣仍從野生變異中選擇品種的做法，國蘭 新品種培育的道路應當是寬廣的。雜交育種是培育蘭花新品種最重要的方法，蘭花在種內或種間，甚至與其他蘭屬 植物進行雜交都可能獲得雜交后代。傳統國蘭在花色、瓣型、香味方面具有極大的優勢，通 過雜交將這些優良基因轉入到國蘭的新品種中來，必定能培育出優秀的國蘭新品種。從長 遠來看，蘭屬內的廣泛雜交育種必然會出現。

發明內容
本發明的目的是提供可以大大提高親本選擇效率，加快育種進程，促進國蘭種質 資源創新的一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法。本發明采取的技術方案按以下步驟實施雜交育種(1)采用CTAB法提取國蘭DNA基因組；(2)篩選國蘭ISSR引物;(3)用篩選出的引物由PCR擴增國蘭雜交親本；
(4)待選雜交親本親緣關系聚類分析；(5)結合待選雜交親本形態表現和親緣關系選定雜交親本，制定雜交策略；(6)培育親本著花，采收父本花粉，與母本人工授粉；(7)培育授粉后的胚珠至發育的果莢成熟。實施本發明后的積極效果是為人工選育國蘭的品種創造出嶄新途徑；而不必要再從野生植株中選擇。本方法可以大大提高親本選擇效率，加快育種進程，促進國蘭種質資源的創新。本發明的ISSR標 記技術具有多態性水平高，操作簡單，重復性好和穩定性高等特點，能夠檢測出豐富的遺傳 多樣性。且可以在分子水平上，比較直觀的選擇遺傳距離合適，表現型良好的雜交親本，以 提高雜交的成功率。
具體實施例方式現對本發明作進一步說明按以下步驟實施雜交育種(1)采用CTAB法提取國蘭DNA基因組；(2)篩選國蘭ISSR引物;(3)用篩選出的引物由PCR擴增國蘭雜交親本；(4)待選雜交親本親緣關系聚類分析；(5)結合待選雜交親本形態表現和親緣關系選定雜交親本，制定雜交策略；(6)培育親本著花，采收父本花粉，與母本人工授粉；(7)培育授粉后的胚珠至發育的果莢成熟。1.所述的 CTAB (Cetyltrimrthyl ammonium-bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法 提取國蘭DNA基因組，其步驟是1)稱取供試國蘭幼嫩葉片50mg，在液氮中研磨三至四次，將粉末放入2ml離心管， 加入800 μ 1 2XCTAB提取緩沖液于其中，65°C水浴約1小時，每隔15分鐘顛倒混勻數次， 以使其充分裂解；2)待樣品冷卻到室溫加入氯仿異戊醇為24 1的溶液800μ 1，顛倒混勻， 12000rpm 離心 15min ；3)取上清液到新的2ml離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇為24 1的溶液， 上下顛倒混勻，12000rpm離心15min ；4)第二次取上清液到新的2ml離心管中，加入等體積的異戊醇，顛倒混勻 后，_20°C靜置，沉淀30min ； 12000rmp離心15min，去上清液；5) 500 μ 175%乙醇洗滌沉淀，12000rmp離心lOmin，洗滌兩次；6)去上清液，室溫晾干，無殘留乙醇，加入約100 μ 1滅菌水溶解DNA ；7)0.8%瓊脂糖電泳檢測。2、所述的由PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應)擴增國蘭雜 交親本是在PCR儀上進行PCR擴增反應，反應體系共20 μ 1，包括10\8吐作1~(含2011111101 mg2+) 2 μ 1、1· Ommol/LdNTPU. 2U Taq polymerase、1. 5 μ mol/LISSR 引物、模版 IOOng,用 ddH20補齊20 μ 1 ；所述的PCR擴增反應是由PCR擴增程序實現，所述的PCR擴增程序是 94°C預變性360s，然后94°C變性70s，52 °C退火復性50s，72°C延伸70s，40個循環；72°C 延伸420s，4°C終止反應；PCR產物在含有0. 5 μ g/mL EB的2. 0%瓊脂糖凝膠中電泳lh，通 過凝膠成像系統獲取電泳凝膠圖像，進行拍照分析；引物807、811、812、825、827、835、840、 862、866、880用于上述反應體系，擴增出的條帶清晰，多態性高。3、所述的待選雜交親本親緣關系聚類分析，是利用ISSR(Inter-Simple SequenceRepeat)分子標記結果，分析親本之間的親緣關系，采用人工讀帶，同一引物、同一位點按其擴增產物的有表示為(1)，無表示為(0)得到二元資料，形成0、1矩陣，利用NTSYS 統計軟件的UPGMA法構建不同種之間的分子系統樹，并計算種間的遺傳相似系數；根據雜 交親本的形態表現及育種目標，選定抗逆性強、觀賞性高、適應性廣且親緣關系較近的品種 作為親本。4、所述的培育所選擇親本著花，是在新生苗的終止葉出現后但尚未完全展開之 前，將氮磷鉀(N P K)比例為7 9 16的花寶一號按照1 1000比例溶于水， 從蘭花根部施澆，每周一次，并在蘭花耐受范圍之內，在白天保證足夠的光照并增加晝夜溫 差，促進花芽分化。花芽分化后，將氮磷鉀(N P K)比例為25 5 20的花寶四號按照
1 1000比例溶于水之后，從蘭花根部施澆，每周一次直至著花。5、所述的與母本人工授粉，起步驟是所選親本開花后1-2天，在晴天上午進行， 輕輕撥掉藥帽，再用干凈鑷子將雄花花粉塊送入雌花合蕊柱分泌粘液的藥腔內。實施案例實驗材料供試材料為收集到的野生春蘭、寒蘭、建蘭、墨蘭和寒蘭五種國蘭，共 38個品種，并分別編號。1.國蘭總DNA的提取采用CTAB法按照以下步驟提取國蘭DNA基因組并進行電泳檢測，稱取38種供 試國蘭幼嫩葉片各50mg，在液氮中研磨三至四次，將粉末放入2ml離心管，加入800 μ 1
2X CTAB提取緩沖液于其中，65°C水浴約1小時，其間混勻數次，以使其充分裂解；待樣品冷 卻到室溫加入氯仿異戊醇為24 1的溶液800 μ 1，顛倒混勻，12000rpm離心15min ；取 上清液到新的2ml離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇為24 1的溶液，上下顛倒混勻， 12000rpm離心15min ；第二次取上清液到新的2ml離心管中，加入等體積的異戊醇，顛倒混 勻后，_20°C靜置、沉淀30min ； 12000rmp離心15min，去上清液；500 μ 175%乙醇洗滌沉淀， 12000rmp離心lOmin，洗滌兩次；去上清液，室溫晾干，無殘留乙醇，加入約100 μ 1滅菌水溶 解 DNA。2. ISSR引物篩選選擇2種國蘭DNA，對100種ISSR引物進行擴增篩選，反應體系共20 μ 1，包括 10XBuffer(#20mmol mg2+) 2 μ 1、1. Ommol/LdNTP、1. 2U Taq polymerase、L 5 μ mol/LISSR 引物、模版100ng，用ddH20補齊20 μ 1。PCR擴增程序是94°C預變性360s，然后94°C變性70s，52°C退火復性50s，72°C延 伸70s，40個循環；72°C延伸420s，4°C終止反應；PCR產物在含有0. 5 μ g/mL EB的2.0%瓊 脂糖凝膠中電泳lh，通過凝膠成像系統獲取電泳凝膠圖像，進行拍照分析。引物 807、811、812、825、827、835、840、862、866、880 用于上述 ISSR-PCR 體系，擴增 出的條帶清晰，多態性高。3. 38種國蘭雜交親本的PCR擴增用篩選出的10條ISSR引物對38種國蘭進行擴增，PCR反應產物在含有0. 5 μ g/ mL EB的2. 0 %瓊脂糖凝膠中電泳lh，電泳緩沖液為1 X TAE,用DGL2000DNA Marker做分子 量標記，通過FR-200A全自動紫外與可見分析裝置獲取電泳凝膠圖像，進行拍照分析。4.國蘭雜交親本的親緣關系聚類分析
對待選雜交親本親緣關系進行聚類分析，是利用ISSR分子標記結果，分析親本之 間的親緣關系，采用人工讀帶，同一引物、同一位點按其擴增產物的有表示為(1)，無表示為 (0)得到二元資料，形成0、1矩陣，利用NTSYS統計軟件的UPGMA法構建不同種之間的分子 系統樹，并計算種間的遺傳相似系數。5.雜交策略的制定根據聚類結果，來自浙江的下山春蘭(與來自福建的下山墨蘭在遺傳相似系數為 0. 67處聚在一起，說明兩者親緣關系較近，理論上推測兩者雜交獲得優勢植株的潛力較大。 浙江下山春蘭花萼片寬大，花朵呈荷瓣型，香氣馥郁，福建的下山墨蘭的花序上生長12朵 花，如果以它們作為親本雜交，可以定向培育花大且花多的新品種。6.培育待選親本著花在新生苗的終止葉出現后但尚未完全展開之前，將氮磷鉀比例為7 9 16 的花寶一號按照1 1000比例溶于水，從蘭花根部施澆，每周一次，并在蘭花耐受范圍之 內，在白天保證足夠的光照并增加晝夜溫差，促進花芽分化；花芽分化后，將氮磷鉀比例為25 5 20的花寶四號按照1 1000比例溶
于水之后，從蘭花根部施澆，每周一次直至著花。7.人工授粉，培育受精胚珠至果莢成熟所選親本開花后1-2天，在晴天上午進行，輕輕撥掉藥帽，再用干凈鑷子將雄花花 粉塊送入雌花合蕊柱分泌粘液的藥腔內。經過幾個月的栽培管理，已經獲得了雜交果實。采用ISSR分子標記進行國蘭雜交 育種，可以避免雜交親本選擇的盲目性，提高了雜交的成功率，提高了獲得優勢植株的可能 性，同時可以避免盲目的雜交行為，從而大大減少了雜交親本的選擇的時間以及雜交后代 優勢植株篩選過程中的人力物力。
權利要求
一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法，其特征是按以下步驟實施雜交育種(1)采用CTAB法提取國蘭DNA基因組；(2)篩選國蘭ISSR引物；(3)用篩選出的引物由PCR擴增國蘭雜交親本；(4)待選雜交親本親緣關系聚類分析；(5)結合待選雜交親本形態表現和親緣關系選定雜交親本，制定雜交策略；(6)培育親本著花，采收父本花粉，與母本人工授粉；(7)培育授粉后的胚珠至發育的果莢成熟。
2.根據權利要求1所述的一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法，其特征是所 述的CTAB法提取國蘭DNA基因組，其步驟是1)稱取供試國蘭幼嫩葉片50mg，在液氮中研磨三至四次，將粉末放入2ml離心管，加入 800 μ 1 2 X CTAB提取緩沖液于其中，65°C水浴約1小時，每隔15分種顛倒混勻數次；2)待樣品冷卻到室溫加入氯仿異戊醇為24 1的溶液800μ 1，顛倒混勻，12000rpm 離心15min ；3)取上清液到新的2ml離心管中，加入等體積的氯仿異戊醇為24 1的溶液，上下 顛倒混勻，12000rpm離心15min ；4)第二次取上清液到新的2ml離心管中，加入等體積的異戊醇，顛倒混勻后，-20°C靜 置，沉淀30min ； 12000rmp離心15min，去上清液；5)500 μ 175%乙醇洗滌沉淀，12000rmp離心lOmin，洗滌兩次；6)去上清液，室溫晾干，無殘留乙醇，加入約100μ 1滅菌水溶解DNA ；7)0.8%瓊脂糖電泳檢測。
3.根據權利要求1所述的一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法，其特征是 所述的由PCR擴增國蘭雜交親本是在PCR儀上進行PCR擴增反應，反應體系共20 μ 1，包括 IOXBuffer 2 μ 1、1. Ommol/L dNTP、1.2U Taq polymerase、1· 5 μ mol/LISSR 引物、模 版lOOng，用ddH20補齊20 μ 1 ；所述的PCR擴增反應是由PCR擴增程序實現，所述的PCR擴 增程序是94°C預變性360s，然后94°C變性70s，52°C退火復性50s，72°C延伸70s，40個循 環；72°C延伸420s，4°C終止反應；PCR產物在含有0. 5 μ g/mL EB的2. 0%瓊脂糖凝膠中電 泳lh，通過凝膠成像系統獲取電泳凝膠圖像，進行拍照分析；引物807、811、812、825、827、 835、840、862、866、880用于上述ISSR-PCR體系，擴增出的條帶清晰，多態性高。
4.根據權利要求1所述的一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法，其特征是 所述的待選雜交親本親緣關系聚類分析，是利用ISSR分子標記結果，分析親本之間的親緣關系，采用人工讀帶，同一引物、同一位點按其擴增產物的有表示為(1)，無表示為(0) 得到二元資料，形成0、1矩陣，利用NTSYS統計軟件的UPGMA法構建不同種之間的分子系統 樹，并計算種間的遺傳相似系數；根據雜交親本的形態表現及育種目標，選定抗逆性強、觀 賞性高、適應性廣且親緣關系較近的品種作為親本。
5.根據權利要求1所述的一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法，其特征是 所述的培育親本著花，是在新生苗的終止葉出現后但尚未完全展開之前，將氮磷鉀比例為7 9 16的花肥按照1 1000比例溶于水，從蘭花根部施澆，每周一次，并在蘭花耐受范圍之內，在白天保證足夠的光照并增加晝夜溫差，促進花芽分化；花芽分化后，將氮磷鉀比例為25 5 20的花肥按照1 1000比例溶于水之后， 從蘭花根部施澆，每周一次直至著花。
6.根據權利要求1所述的一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法，其特征是 所述的與母本人工授粉，其步驟是所選親本開花后1-2天，在晴天上午進行，輕輕撥 掉藥帽，再用干凈鑷子將雄花花粉塊送入雌花合蕊柱分泌粘液的藥腔內。
全文摘要
一種利用分子標記進行國蘭雜交育種的方法，屬于生物育種技術領域。其特點是按以下步驟實施雜交育種采用CTAB法提取國蘭DNA基因組，篩選引物，選定雜交親本，培育所選擇親本著花，取親本花藥粉，進行人工授粉，培育授粉后的親本至發育的果莢成熟。其積極效果是為人工選育國蘭的品種創造出嶄新途徑；而不必要再從野生植株中選擇。本方法可以大大提高親本選擇效率，加快育種進程，促進國蘭種質資源的創新。本發明的ISSR標記技術具有多態性水平高，操作簡單，重復性好和穩定性高等特點，能夠檢測出豐富的遺傳多樣性，且可以在分子水平上，比較直觀的選擇遺傳距離合適，表現型良好的雜交親本，以提高雜交的成功率。
文檔編號C12Q1/68GK101897293SQ20101024462
公開日2010年12月1日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者嚴華, 張冬梅, 高和平 申請人:上海市園林科學研究所;上海平良綠化工程有限公司