專利名稱：檢測常見高危型人乳頭瘤病毒的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發 明涉及檢測臨床樣品中常見高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV，High-RiskHuman PappillomavirudDNA的方法，特別是涉及使用實時聚合酶鏈反應(PCR)方法檢測HPV。該方法使用分子信標熒光探針技術，能特異且靈敏地檢測出臨床樣品中13種常見的高危型人乳頭瘤病毒DNA。本發明還進一步涉及用于該臨床檢測的試劑盒。
背景技術：
宮頸癌(CC)是女性最常見的惡性腫瘤之一，在女性人群中，其致死率僅次于乳腺癌。據估計，全球每年約新增病例大約473，000，每年死于宮頸癌的人數可高達253，500，約 85%發生在發展中國家(http://www.nccc-online.org/)。我國每年新增病例13. 15萬， 約3. 5萬人死于宮頸癌。近年來，隨著環境污染和社會風氣的變化，原本多發于50歲左右女性身上的宮頸癌如今也盯上了年輕女性。所以，宮頸癌的預防、診斷和治療對提高女性健康水平是非常必要的。所幸的是，宮頸癌是一種發病原因比較清楚的惡性腫瘤，約99. 7%的宮頸癌是由高危型人乳頭瘤病毒的持續或反復感染所致(Walboomers JM, Jacobs MV. Manos MM, et al.J Pathol, 1999 ；189(1) :50_53)。目前已確定的HPV型別已超過150個，常見的高危型有 15 種(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和 82 型)(Munoz N, Bosch FX, de SanjoseS, Herrero R, CastellsagueX, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ (2003). N. Engl. J. Med. 348 (6) :518_27.)。其中，70% 的宮頸癌是由 HPV16、18 引起的；另夕卜，HPV31、 33、35 也是宮頸癌的主要致病因素(Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA,Shah KV,Snijders PJ,Peto J,Meijer CJ, Munoz N(1999). J. Pathol. 189(1) 12-9)。HPV型別分布有地域差別，在中國人群中，HPV16、52、58相對多見，而HPV73、82幾乎沒有。過去，宮頸癌篩查的主要方法有巴氏涂片法、陰道鏡檢查法及組織活檢等，這些方法缺點明顯，靈敏度不高特異性不強。而近年來出現的HPV DNA或RNA的檢測對診斷高度病變的宮頸癌的靈敏度可達80% -100%，陰性預測值幾乎是100%，所以，這種方法目前被認為是診斷宮頸癌的金標準。有研究者提出，對宮頸癌的準確診斷需要HPV DNA或RNA檢測結果和細胞學檢測結果的綜合分析(Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA,Shah KV,Snijders PJ,Peto J,Meijer CJ,Munoz N(1999).J.Pathol. 189(1) 12-9)。檢測HPV DNA或RNA的常見方法包括測序法、雜交捕獲法、原位雜交法及PCR法。 測序法的結果相對準確，但操作繁瑣，且對操作者的要求較高，不適于臨床應用；雜交捕獲法如Digene公司的Hybrid CaptureII已被美國FDA批準并已在臨床上應用，該法假陽性的問題仍然十分嚴重，且成本高，不宜在經濟較不發達的發展中國家推廣；原位雜交法靈敏度過低，這也就限制了其在臨床上的大規模應用；傳統的PCR法(電泳鑒定結果)雖然靈敏度尚可，但擴增后的產物暴露容易造成交叉污染，且步驟繁瑣，臨床應用的局限性過大。而上世紀90年代中期在傳統的PCR基礎上發展起來的實時熒光PCR技術不但靈敏度高特異性強，自動化程度高，成本適中，幾乎不會造成污染，這些優點無疑給人乳頭瘤病毒的早期診斷帶來了福音。目前已上市的檢測高危型HPV DNA的實時熒光PCR試劑有達安的8種型檢測試劑 (國食藥監械(準)字2007第3401103號)，上海復星的10種型檢測試劑(國食藥監械 (準)字2008第3400985號，分兩管檢測)以及潮州凱普的13種型檢測試劑(國食藥監械 (準)字2008第3401104號)等。達安和復星的HPV試劑所檢測的型別過少，而凱普公司的HPV熒光PCR試劑雖然能檢測常見的13種高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59、68)，但由于采用的是Taqman探針，特異性較差，只有85%左右。所以，為了滿足臨床的更高需求，本專利旨在利用分子信標技術開發特異性更強(大于95%)的13種常見高危型人乳頭瘤病毒DNA的熒光PCR檢測方法和試劑盒。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種檢測臨床宮頸樣本中常見高危型人乳頭瘤病毒DNA 的方法，特別是提供了一種使用分子信標熒光探針技術的實時PCR檢測方法。該方法包括以下步驟(1)從待檢的宮頸樣本中提取病毒DNA; (2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信標探針對提取的病毒DNA進行實時PCR監測；(3)根據實時PCR的擴增曲線，分析并判斷待檢樣本中是否有常見的高危型人乳頭瘤病毒DNA。該方法的特征在于聚合酶鏈反應體系中使用的正向和方向引物共有9條，它們序列如下(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTAT TTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且實時PCR反應中所用的分子信標探針有(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的待檢宮頸樣本是指用無菌棉拭子或宮頸刷取疑似人乳頭瘤病毒感染患者的宮頸脫落細胞，以及用于活檢的組織標本或疣組織，這些樣本需在低于4°C的環境下運送到檢測實驗室，并置于-70°C或-20°C冷凍保存根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的分子信標探針是用來檢測宮頸樣本中常見的高危型人乳頭瘤病毒DNA，并且其中探針的5’端標記有FAM熒光基團，3’端標記有DABCYL淬滅基團。序列表中，分別用FAM和DABCYL代表熒光基團和淬滅基團。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的實時PCR擴增所用的程序是 50 "C 120秒(1個循環)一95 °C 180秒(1個循環)一95 °C 5秒，45。C 45秒(5個循環)—950C 5秒，55°C 45秒(35個循環)。其中55°C是檢測熒光的溫度。本發明的另一個目的是提供用于檢測臨床宮頸樣本中常見高危型人乳頭瘤病毒 DNA的的試劑盒，該試劑盒包括(1)宮頸樣本中人乳頭瘤病毒DNA提取試劑；(2)聚合酶鏈反應混合液；(3)酶混合液；⑷陽性對照；(5)陰性對照。其特征在于聚合酶鏈反應體系中使用的正向和反向引物有(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且實時PCR反應中所用的分子信標探針有(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的DNA提取試劑由提取液A、提取液B 和提取液C組成。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的聚合酶鏈反應混合液由10XPCR緩沖液、dUTPs、正反向引物、分子信標探針等組成。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的酶混合液由普通Taq酶(Tag DNA聚合酶)和UNG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)組成。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的陽性對照是經過測序確認過的含試劑盒檢測范圍內的一種高危型人乳頭瘤病毒DNA片段的質粒；陰性對照是高壓滅菌水。根據本發明的再一個優選實施方案，其中用于聚合酶鏈反應的正向和反向引物有 (1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且實時PCR反應中所用的分子信標探針有(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。本發明提供一種檢測臨床樣本中宮頸癌、尖銳濕疣的病原體——高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的方法，特別是一種實時PCR檢測方法。該方法使用分子信標熒光探針技術， 能特異且靈敏地檢測出13種常見的高危型人乳頭瘤病毒，這13種HR-HPV是指HPV-16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。本發明還進一步提供用于該臨床檢測的試劑盒。為了彌補市場上現有產品的缺陷和不足，本發明提供了一種適于檢測常見高危型人乳頭瘤病毒DNA的方法，該方法包括⑴從待檢的宮頸樣本中提取病毒DNA ；⑵使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信標探針對提取的病毒DNA進行實時PCR ； (3)根據實時PCR 的擴增曲線，分析并判斷待檢樣本中是否存在常見的高危型人乳頭瘤病毒DNA。該方法的特征在于聚合酶鏈反應體系中使用的正向和方向引物共有9條，分別是(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且實時PCR反應中所用的分子信標探針有
( 10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO : 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO : 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO : 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的待檢宮頸樣本是指用無菌棉拭子或宮頸刷取疑似人乳頭瘤病毒感染患者的宮頸脫落細胞，以及用于活檢的組織標本或疣組織，這些樣本需在低于4°C的環境下運送到檢測實驗室，并置于-70°C或-20°C冷凍保存。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的分子信標探針是用來檢測宮頸樣本中常見的高危型人乳頭瘤病毒DNA，其中探針的5’端標記有FAM熒光基團，3’端標記有 DABCYL淬滅基團。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的實時PCR擴增所用的程序是 50 "C 120秒(1個循環)一95 °C 180秒(1個循環)一95 °C 5秒，45。C 45秒(5個循環)—950C 5秒，55°C 45秒(35個循環)。其中55°C是檢測熒光的溫度。簡單地說，為了完成本發明的方法，首先提取待檢臨床宮頸樣本中人乳頭瘤病毒 DNA，然后以提取的DNA為模板，使用合成的正向和反向寡核苷酸引物進行PCR擴增；擴增時以FAM和DABCYL修飾的分子信標熒光探針檢測常見的高危型人乳頭瘤病毒DNA ；最后再根據PCR的擴增曲線判斷標本中是否含有常見的高危型人乳頭瘤病毒DNA。現針對本發明的幾個主要步驟，分別詳述如下1.人乳頭瘤病毒DNA的提取本發明采用的是常見的人乳頭瘤病毒DNA的提取方法。首先是在約50 μ 1的臨床宮頸樣本中加入蛋白酶k、Triton-100和PBS，混勻后于37°C溫育1個小時，然后在96°C溫育10分鐘使得蛋白酶K失活，最后離心后取5μ 1上清用于PCR擴增。2.引物的設計和合成為了特異、高效地擴增待檢臨床宮頸樣本中常見的高危型人乳頭瘤病毒的靶DNA 片段，我們從GeneBank中調出各亞型(包括低危亞型)人乳頭瘤病毒的Ll區DNA序列，然后通過DNAStar軟件進行各亞型Ll區序列比較，在高危型序列相對保守的區域設計引物序列并進行合成。本發明中設計的正向和反向引物序列有(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)
(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)其中 Y = C/T = A/T ;R = A/G。3.探針的合成和標記我們從GeneBank中查詢各亞型(包括低危亞型)人乳頭瘤病毒的Ll區DNA序列， 然后通過DNAStar軟件進行各亞型Ll區序列比較。為了使得試劑盒的特異性滿足市場需求，我們在各高危型序列特異的區域設計分子信標探針并進行合成。我們共設計了 8條探針，序列如下(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中W = A/T ;K = T/G。4.核酸擴增體系的優化為了提高試劑盒檢測的靈敏度和特異性我們首先對PCR擴增程序的各個參數(主要是退火溫度和時間以及檢測溫度和時間)進行優化，最終選擇的PCR運行程序是50°C 120秒(1個循環)—95°C 180秒(1個循環)—95°C 5秒，45°C 45秒(5個循環)一95°C 5秒，550C 45秒(35個循環)。其中55°C是檢測熒光的溫度。然后在這個PCR 擴增程序的基礎上再對MgCl2濃度、酶、dUTPs、Tris-HCl、KCl、引物和探針的用量進行優化。5.擴增結果的分析和判斷熒光明顯比熒光域值(在熒光擴增曲線上根據基線設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段的任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍)高，擴增曲線光滑且明顯呈S型趨勢的才能判斷為陽性； 否則為陰性。每個實驗的陽性對照的擴增結果都應確定為陽性，而陰性對照的擴增結果都應是確定的陰性才可以。如前所述，由于本發明在各高危亞型人乳頭瘤病毒DNA的Ll區相對保守的區域設計引物，在正反向引物間各高危亞型序列特異區域設計探針，使得常見高危亞型的人乳頭瘤病毒DNA檢測的靈敏度和特異性都完全可以符合臨床需求。另外，本發明對MgCl2濃度、 酶、dUTPs、Tris-HCl, KC1、引物和探針的用量進行優化，使得實時PCR的擴增曲線更加美觀和穩定，從而使得檢測結果更加可靠。此外，本發明檢測只用到最通用的熒光——FAM熒光，適用于市場上所有的熒光PCR儀檢測，而且標記這種熒光的探針成本最低，從而使得試劑盒的成本也大大降低，利于大規模推廣應用。本發明的另一個目的是提供用于檢測常見高危型人乳頭瘤病毒DNA的試劑盒，該試劑盒包括(1)宮頸樣本中人乳頭瘤病毒DNA提取試劑；(2)聚合酶鏈反應混合液；(3)酶混合液；(4)陽性對照；(5)陰性對照。
其特征在于聚合酶鏈反應體系中使用的正向和反向引物有(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4) (5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且實時PCR反應中所用的分子信標探針有(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的DNA提取試劑由提取液A(20mg/ml 蛋白酶k)、提取液B(Triton-IOO)和提取液C(10mM PBS, pH7. 0)組成。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的聚合酶鏈反應混合液(每人份)由 5μ 1 10XPCR buffer (500mM KCl,700mM Tris-Cl, pH8. 9,35mM MgCl2, 50 % v/v 甘油)、 0. 4μ 1 dUTPs(dATP、dUTP、dGTP、dCTP 各 25mM)、正反向引物(都是 100 μ Μ)各 0. 1 μ 1、分子信標探針(100 μ Μ)各0. 05 μ 1等組成。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的酶混合液由普通Taq酶(5υ/μ 1)和 UNG 酶(1U/ μ 1)按 ν/ν = 4 1 組成。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的陽性對照是經過測序確認過的含試劑盒檢測范圍內的一種高危型HPV DNA片段的質粒；陰性對照是高壓滅菌水。根據本發明的再一個優選實施方案，其中用于聚合酶鏈反應的正向和反向引物有(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)
(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且實時PCR反應中所用的分子信標探針有 (10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。本發明的試劑盒不但對低危型人乳頭瘤病毒DNA以及HPV DNA呈陰性的臨床宮頸標本的特異性強，而且對常見高危型人乳頭瘤病毒DNA的檢測靈敏度高，能檢測到濃度約為1. OX IO2-L OX 103COpieS/ml的各高危型人乳頭瘤病毒DNA片段的質粒；引物序列非常保守，探針序列非常特異，所以試劑盒檢測的準確性極高，漏檢率極低，假陽率幾乎沒有。所以本發明的方法和試劑盒完全適用于臨床宮頸樣本中常見高危型人乳頭瘤病毒DNA的確認。


圖1顯示各高危亞型的靈敏度檢測結果。所用的模板是經過測序確認過的13種含高危型人乳頭瘤病毒DNA片段的質粒，濃度約為1. OX IO2-L OX 103COpieS/ml。圖2顯示各低危亞型的特異性檢測結果。所用的模板是經過測序確認過的5種含低危型人乳頭瘤病毒DNA片段的質粒，濃度約為1. OX 107COpieS/ml。圖3顯示35例高危型人乳頭瘤病毒DNA呈陽性的標本的檢測結果。圖4顯示12例低危人乳頭瘤病毒DNA呈陽性的標本以及12例不含人乳頭瘤病毒 DNA的標本的檢測結果。發明的
具體實施例方式實施例1 臨床宮頸樣本中人乳頭瘤病毒DNA的提取從臨床宮頸脫落細胞標本中取出50 μ 1到一高壓過的1.5ml的離心管中，加入 10 μ 1提取液A(20mg/ml蛋白酶k)，8. 1μ 1提取液B (Triton-100)以及210μ 1提取液 CdOmM PBS，pH7. 0)，振蕩混勻后于37°C溫育60min ；接著96°C放置IOmin以失活蛋白酶k ； 最后12，500g離心lOmin，取5 μ 1上清進行PCR擴增。實施例2 靶核酸的PCR擴增在一 PCR反應管中加入單人份的PCR反應混合液，再加入0. 5 μ 1的酶混合液，最后再加入5μ1模板(待檢模板或陰陽性對照品)，充分混勻后稍稍離心(約5秒)。然后將反應管放入熒光PCR儀(能檢測到FAM的PCR儀)，按下列條件擴增50°C 120秒(1 個循環)—95°C 180秒(1個循環)—95°C 5秒，45°C 45秒(5個循環)—95 °C 5秒， 550C 45秒(35個循環)其中55°C是檢測熒光的溫度。所使用的PCR擴增體系中包括5μ 1IOXPCR buffer (500mM KCl, 700mMTris-Cl, pH8. 9,35mM MgCl2, 50 % v/v 甘油)、0. 4 μ 1 dUTPs(dATP、dUTP、dGTP、dCTP 各 25mM)、正反向引物(SEQ ID NO 1 到 SEQ ID NO :9，都是 ΙΟΟμΜ)各 0. 1μ 1、分子信標探針(SEQ ID NO 10 到 SEQ ID NO 17，都是 100 μ Μ)各 0· 05 μ 1、0· 5 μ 1酶混合液等組成，最后補水到50 μ 1實施例3 高危型人乳頭瘤病毒DNA的靈敏度檢測以經過測序確認過的13種含高危型人乳頭瘤病毒DNA片段的質粒(濃度約為1.0X 102-1.0X 103COpieS/ml)為模板，使用本發明的試劑進行檢測，檢測結果參見附圖1。從圖1的結果可以看出，本發明的方法和試劑盒可以檢測到濃度約為 1.0X IO2-L OX 103copies/ml的各高危型人乳頭瘤病毒DNA模板，可以滿足臨床的需求。實施例4 低危型人乳頭瘤病毒DNA的特異性檢測以經過測序確認過的5種含低危型人乳頭瘤病毒DNA片段的質粒(濃度約為 1.0X107copies/ml)為模板，使用本發明的試劑進行檢測，檢測結果參見附圖2。從圖2的結果可以看出，本發明的方法和試劑盒對濃度約為1.0X107COpieS/ml的各低危型人乳頭瘤病毒DNA模板的檢測結果呈陰性，說明試劑盒的特異性良好。實施例5 臨床宮頸標本的檢測使用本發明的方法和試劑盒，對59份已經凱普芯片試劑確認的的臨床宮頸標本進行檢測，其中35例含高危型人乳頭瘤病毒DNA，12例含低危型人乳頭瘤病毒DNA，另12例不含人乳頭瘤病毒DNA。結果顯示，35例高危型人乳頭瘤病毒DNA陽性的標本用本發明的試劑盒檢測，有兩例呈陰性，33例為陽性，陽性檢出率94. 29% (結果如圖3)；而12例低危型人乳頭瘤病毒DNA陽性的標本以及12例不含人乳頭瘤病毒DNA的標本用本發明的試劑盒檢測，結果均為陰性，特異性100% (結果如圖4)。可見本發明的方法和試劑盒完全可以滿足臨床檢測的需要。本發明的試劑與凱普芯片試劑的比較結果如下列表1所示。表1 分別使用本發明的試劑盒與凱普芯片試劑盒檢測59例臨床標本的結果比較
權利要求
1.一種用于檢測常見高危型人乳頭瘤病毒DNA的試劑盒，該試劑盒由(1)宮頸樣本中人乳頭瘤病毒DNA提取試劑；(2)聚合酶鏈反應混合液；(3)酶混合液；(4)陽性對照和(5) 陰性對照樣品組成，特征在于其中所使用的正和反向引物是(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3‘(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQID NO 9) 其中 Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G。所使用的分子信標探針序列為(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO: 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO: 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQID NO: 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQID NO: 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQID NO: 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQID NO: 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQID NO: 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO: 17) 其中 W = A/T ；K = T/G,
2.根據權利要求1的試劑盒，其中所說的常見高危型人乳頭瘤病毒是指中國人群中常見的宮頸癌相關人乳頭瘤病毒，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13種型。
3.根據權利要求1的試劑盒，其中所說的宮頸樣本是指用無菌棉拭子或宮頸刷取的疑似人乳頭瘤病毒感染患者的宮頸脫落細胞，以及用于活檢的組織標本或疣組織，這些樣本需在低于4°C的環境下運送到檢測實驗室，并置于-70°C或-20°C冷凍保存。
4.根據權利要求1的試劑盒，其中所說的人乳頭瘤病毒DNA提取試劑由提取液A、提取液B和提取液C組成。
5.根據權利要求1的試劑盒，其中所說的聚合酶鏈反應混合液由10XPCR緩沖液、 dUTPs、正和反向引物、分子信標探針組成。
6.根據權利要求1的試劑盒，其中所說的酶混合液由普通Taq酶(TagDNA聚合酶)和 UNG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)組成。
7.根據權利要求1的試劑盒，其中所說的陽性對照是指經過測序確認過的含試劑盒檢測范圍內的高危型HPV DNA片段的質粒。
8.根據權利要求1的試劑盒，其中所說的陰性對照是高壓滅菌水。
全文摘要
本發明涉及一種檢測臨床樣本中宮頸癌、尖銳濕疣的病原體——高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的方法，特別是涉及一種實時PCR檢測方法，該實時PCR檢測方法使用分子信標熒光探針技術，能特異且靈敏地檢測出13種常見的高危型人乳頭瘤病毒，這13種HR-HPV是指HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。本發明還進一步涉及用于該臨床檢測的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102199671SQ201010147430
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月24日 優先權日2010年3月24日
發明者宋慶濤, 蔡劍英 申請人:英科新創(廈門)科技有限公司