專利名稱：用于甜瓜枯萎病抗性鑒定的功能性分子標(biāo)記及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蔬菜抗病分子標(biāo)記育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種甜瓜枯萎病抗性基因 Fom-2功能性分子標(biāo)記及其應(yīng)用，從而為甜瓜枯萎病抗性的標(biāo)記輔助選擇提供一種新型分 子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
甜瓜(Cocumis melo L.)作為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物中一種重要的園藝 作物，具有較高的商業(yè)品價值和經(jīng)濟(jì)價值，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。近年來隨著甜瓜 種質(zhì)資源商品化和種植面積的不斷擴(kuò)大，病蟲害發(fā)生日益嚴(yán)重，迫使生產(chǎn)上大量使用化 學(xué)試劑，嚴(yán)重影響了甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)(Sherf and MacNab 1986)。其中甜瓜枯萎病是 由尖孢鐮刀菌導(dǎo)致的一種世界范圍內(nèi)毀滅性的土傳病害，導(dǎo)致甜瓜90%以上的經(jīng)濟(jì)損失 (Leach JG1938 ；Martyn RD 1987)。目前已經(jīng)鑒定分離得到4種枯萎病菌生理小種，分 別為生理小種0，1，2和1-2。遺傳分析表明，2個獨立的基因Fom-I和Fom-2分別控制對 生理小種 0，2 和 0，1 的抗性(Risser et al. 1976 ；Risser and Mas 1965 ；Robinson et al. 1976)。其中Fom-2基因已經(jīng)通過圖位克隆的方法得到分離(Joobeur et al. 2004)。 Fom-2 基因?qū)儆?NBS-LRR 類的 R 基因，這類基因編碼 NBS (nucleotide binding site, NBS) 和LRRdeucine-richr印eat，LRR)兩個比較保守的結(jié)構(gòu)域。通常植物專化抗性是由于宿 主對抗性蛋白產(chǎn)生的無毒基因的識別，進(jìn)而引發(fā)一個信號級聯(lián)反應(yīng)和防御反應(yīng)(Hammond Kosack and Jones 1997 ；Martin et al. 2003)。植物的R基因不斷變化來識別產(chǎn)生變異的 無毒基因，這有利于人們在分子水平上發(fā)現(xiàn)和認(rèn)識自然選擇。現(xiàn)在人們已從許多物種中克 隆得到R基因，并驗證了它們在抗性和不抗材料間的功能多樣性。許多研究表明擬南芥和 其他幾個物種R基因存在序列的多態(tài)性，這種種間或種內(nèi)影響表型的基因序列多態(tài)性的識 別有利于功能性分子標(biāo)記的發(fā)展(Andersen and Lubberstedt，2003)。目前培育優(yōu)良抗枯萎病甜瓜品種成為解決甜瓜枯萎病害問題的有效途徑之一，分 子輔助選擇(MAS)手段的發(fā)展能大大縮短甜瓜枯萎病抗性育種進(jìn)程。但目前抗病育種過程 中所使用的分子標(biāo)記與目標(biāo)基因存在一定遺傳距離，易發(fā)生重組交換而分離，從而影響選 擇的準(zhǔn)確性。功能性分子標(biāo)記是與表型相關(guān)的功能基因基序中功能性單核苷酸多態(tài)性位點開 發(fā)而成的新型分子標(biāo)記，功能性分子標(biāo)記的開發(fā)首先需要鑒定出群體中與表型相關(guān)的功能 基因的功能性基序的序列。AS-PCR和CAPS方法已成功應(yīng)用于基于SNPs的一系列功能性 分子標(biāo)記的開發(fā)(Chiapparino et al. 2004 ；Kim et al. 2006 ；Yeam et al. 2005)。功能性 分子標(biāo)記不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備或繁瑣的操作步驟，因此非常適合應(yīng)用于分子育種過 程。隨著越來越多的功能基因及其等位基因的分離和注釋，功能性分子標(biāo)記已成為一類新 型分子標(biāo)記，可以大大提高標(biāo)記的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種與甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2相關(guān)的功能 性分子標(biāo)記，其適用于甜瓜的抗枯萎病的輔助選擇。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種用于甜瓜枯萎病抗性鑒定的功能性分子 標(biāo)記，該分子標(biāo)記所采用的CAPS引物序列為以下任意一種CAPSl 正向引物為 5，-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3，(SEQ ID NO 3)反向引物為5，-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3，(SEQ ID NO 4),CAPS2 正向引物為 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，(SEQ ID NO 5)反向引物為5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，(SEQ ID NO 6),CAPS3 正向引物為 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，(SEQ ID NO 7)反向引物為5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，(SEQ ID NO 8)；或者，該分子標(biāo)記所采用的AS-PCR引物序列為AS-PCR 正向引物為 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3，(SEQ ID NO 9)反向引物為5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3，(SEQ ID N0:10)。本發(fā)明還同時提供了上述功能性分子標(biāo)記的用途用于甜瓜枯萎病的分子輔助育 種，或者用于鑒定甜瓜枯萎病抗性基因。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2在抗病與感病種質(zhì)的LRR區(qū)域有3個 SNP位點，甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2的核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所述。枯萎病 抗性和感病材料在序列表SEQ ID N0:1的281bp處有一個A-G的堿基突變，在1075bp處有 一個A-G的堿基突變，在1216bp處有一個T-C的堿基突變(圖1)。突變后的核苷酸序列如 序列表SEQ ID NO :2所述。根據(jù)上述SEQ ID NO 1的序列的SNP特征，分別設(shè)計引物，開發(fā)FMs，所述的CAPS 和AS-PCR方法的引物對分別為CAPS 1 正向引物為 5，-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3，反向引物為5，-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3，；CAPS2 正向引物為 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，反向引物為5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，；CAPS3 正向引物為 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，反向引物為5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，。AS-PCR 正向引物為 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3，反向引物為5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA 3，。該CAPS及AS-PCR引物對能成功鑒定出甜瓜抗病及感病種質(zhì)(圖2、3)，并且在F2 世代中呈單基因遺傳分離規(guī)律(表1、2)，應(yīng)用上述兩種方法可以成功鑒定出甜瓜種質(zhì)對枯 萎病抗性的基因型(表3)。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。圖1是本發(fā)明的甜瓜抗病及感病種質(zhì)Fom-2基因LRR區(qū)域SNP位點圖1中Fom-2-R代表枯萎病抗病基因型，F(xiàn)om-2-S代表枯萎病感病基因型；圖2是CAPS方法鑒定甜瓜抗病及感病種質(zhì)對比圖；圖2中FF為抗病純合基因型，F(xiàn)f為抗病雜合基因型，ff為感病純合基因型，M為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；圖3是AS-PCR方法鑒定甜瓜抗病及感病種質(zhì)對比圖；圖3中FF為抗病純合基因型，F(xiàn)f為抗病雜合基因型，ff為感病純合基因型，M為 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式實施例1、本發(fā)明的主要步驟和內(nèi)容為根據(jù)數(shù)據(jù)庫中甜瓜枯萎病抗性基因Fom-2 設(shè)計引物，以甜瓜抗病及感病種質(zhì)及它們Fp F2世代基因組DNA為模板，鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng) (PCR)方法擴(kuò)增目的片段、測序，然后應(yīng)用生物信息學(xué)然間對序列進(jìn)行分析。采用CAPS和 AS-PCR兩種方法開發(fā)枯萎病抗性相關(guān)的FMs，并在F1J2世代驗證其有效性和可靠性。應(yīng)用上 述兩種標(biāo)記方法，提取生產(chǎn)上應(yīng)用的不同甜瓜種質(zhì)基因組DNA，鑒定其枯萎病抗性的基因型。具體步驟如下(1)在NCBI數(shù)據(jù)庫(http://WWW· ncbi. nlm. nih. gov/)中找到甜瓜枯萎病抗性基 因Fom-2的序列信息，F(xiàn)om-2基因登錄號為AY583855。Fom_2基因?qū)儆贜BS-LRR類的R基 因，編碼NBS和LRR兩個比較保守的結(jié)構(gòu)域。(2)設(shè)計引物并合成，在Fom-2基因LRR區(qū)兩端設(shè)計引物，引物序列如下Fom-2 正向引物GAGTCTATTGTTTCGCTTC
反向引物TGCTCGTCTCTGGGTCACCTTC。(3)基因組DNA的提取(a)分別取0. 5g上述甜瓜抗病(Cantaloupe，高抗枯萎病材料)和感病種質(zhì)(仙 果027-5，高感枯萎病材料)、Fp F2的不同甜瓜種質(zhì)嫩葉于研缽中，液氮狀態(tài)下研磨，加入 600 μ 1 65°C預(yù)熱的2 X CTAB (30 μ 1巰基乙醇混勻)，轉(zhuǎn)移到離心管中，65°C保溫1小時。(b)加入600 μ 1的氯仿異戊醇(24/1的體積比)輕輕搖勻，4°C，13000rpm離心， 10分鐘。(C)取上清，重復(fù)(b)步驟一次。(d)取步驟(C)所得的上清于另一離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，顛倒混 勻，靜置5分鐘，13000rpm，離心10分鐘。(e)倒去上清，加入700 μ 1 Wash Buffer漂洗DNA沉淀，離心，重復(fù)一次。(f)加 15 μ ITE-Rnase, 37°C保溫 1 小時。(g)力口 入 2mol/L NaCl 100 μ 1+100 % 乙醇 250 μ 1 混勻，-20 °C 靜置 30min， 13000rpm離心10分鐘。(h)倒去上清，加入500 μ 1 70% (體積比)乙醇，漂洗，倒去乙醇，重復(fù)一次，常溫晾干。(i)加入 3O-5Oyl ddH20 或 TE，回溶，_20°C 保存?zhèn)溆谩Ｗ?XCTAB配方CTAB 4g
5
IM Tris-HCl (pH8. 0)EDTA NaCl 16. 3
16.352g
20ml 1. 488g先用70ml ddH20溶解，再定容至200ml滅菌，冷卻后0. 2-1% 2-巰基乙醇(400 μ 1) 氯仿-異戊醇(24 1)先加96ml氯仿，再加4ml異戊醇，搖勻即可。TE-Rnase :15 μ 1 TE 力口入 1/100 體積的 Rnase0Wash Buffer :10mmol/L 乙酸氨75 % (體積比)乙醇(4)鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)的試劑與條件首先將下列試劑混和在一起10 X Taq DNA聚合酶緩沖液5 μ 1模板 DNA1 μ 1正向引物(1·25μ g/1)0. 4μ 1反向引物(1·25 μ g/1)0. 4μ 1脫氧核苷酸混合物(dNTP)1 μ 1Taq DNA 聚合酶0. 4 μ 1滅菌水41·8μ1總體積50 μ 1PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min后，94 °C變性30s，50°C退火45s，72 °C延伸 1. 5min，35個循環(huán)后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。對目的條帶 進(jìn)行克隆測序，具體方法如下(a)連接反應(yīng)，離心管順序加入以下各組分H2O 2 μ 1T4DNA Ligase IOXBuffer 1 μ 1pUCM-T 載體1 μ 1PCR 產(chǎn)物4 μ 1PEG4000 1 μ 1T4DNA Ligase 1 μ 1 ；(b)感受態(tài)細(xì)胞的制備(CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞):①挑取新活化的E. coli DH5a單菌落，接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C下振蕩 培養(yǎng)12h左右，直至對數(shù)生長后期。②將菌液以1 100-1 150的比例(重量比)接種于IOOml LB液體培養(yǎng)基中， 37°C下振蕩培養(yǎng)2h左右，至0D600 = 0. 5左右。③將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置lOmin，然后于4°C下IOOOOrpm離心lOmin。④棄上清，用預(yù)冷的0. lmol/L的CaC12溶液30ml輕輕懸浮細(xì)胞，冰上放置IOmin 后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。重復(fù)操作一次。⑤棄上清，加3ml預(yù)冷的含15% (體積比)甘油的0. lmol/L的CaCl2溶液輕輕懸 浮細(xì)胞，冰上放置5min后，即成感受態(tài)細(xì)胞，分裝成200 μ 1的小份，置于_70°C保存?zhèn)溆谩?c)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a
①取上述(b)步驟制備的感受態(tài)細(xì)胞懸浮液200 μ 1，搖勻后加入4μ 1上述(a)步 驟的連接產(chǎn)物，用槍頭輕輕吹打均勻，冰浴30分鐘；②42 °C保溫90秒，迅速放入冰中，冰浴5分鐘；③加入37°C預(yù)熱的Iml LB液體培養(yǎng)基(Amp_)，混勻，37 °C保溫1個小時，使細(xì)胞 恢復(fù)正常生長狀態(tài)；④ 3000rpm 離心 10 分鐘；⑤棄去上清，余下的200 μ 1用槍頭輕輕吹打均勻，使細(xì)菌充分懸浮后均勻涂布于 含 15 μ 1 X-Gal (20mg/ml)禾Π 100 μ 1 IPTG (24mg/ml)的 LB 篩選平板培養(yǎng)基上(Amp+)；⑥37°C正面向上放置半個小時后，倒置培養(yǎng)8-12小時，觀察。LB培養(yǎng)基配方IOOml體系中加入以下各組分蛋白胨(Typtone)Ig酵母提取物(YeastExtract) 0. 5gNaCl IgNaOH (Imo 1/L) 100 μ 1先用70ml ddH20溶解，再定容至100ml，高壓高溫滅菌后4°C保存。(5)質(zhì)粒純化(a)在超凈工作臺中用無菌槍頭挑取單個白色菌落，接種于含50μ g/ml Amp的 5mlLB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)過夜。(b)取 l-2ml 菌液于 Epeendorf 管中，12000rpm 離心 1 分鐘；(c)加入100 μ 1 Solution I，用槍頭充分懸浮菌液；(d)加入 200 μ 1 SolutionIIjMgj Epeendorf 管，冰浴 3 分鐘；(e)加入 150 μ 1 預(yù)冷的 Solution III，顛倒 Epeendorf 管，冰浴 5 分鐘；(f) 40C，12000rpm離心5分鐘，上清液加入等體積的苯酚/氯仿混勻；(g) 40C，12000rpm離心5分鐘，上清液加入2倍體積的乙醇，室溫放置5分鐘；(h) 40C，12000rpm離心5分鐘，用70%乙醇漂洗一下，涼干沉淀，50 μ 1 TE融解沉 淀，-20°C保存?zhèn)溆谩Ｆ渲蠸olution I :100ml 體系lmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)20% Glucose (1.1 lmol/L)dH20 高溫高壓滅菌后4°C保存。Solution II :100ml 體系10% SDS 10ml2mol/LNa0H 10ml加滅菌水至100ml，充分混勻，室溫保存，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。SolutionIII :100ml 體系2. 5ml 2. Oml 4. 5ml 91ml
7
CH3COOH 11.5ml加滅菌水至100ml，高溫高壓滅菌后4°C保存。序列測定與分析序列測定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。將所得序列在 Genebank及分子生物學(xué)軟件DNAMAN、Clustalff等分析，得到SNP位點信息(圖1)。(6) CAPS 方法采用dCAPS 2. 0(http://helix. wustl.edu/dcaps/dcaps. html)軟件設(shè)計引物， 引物序列如下CAPS 1 正向引物 5，-TGTTTGGAGAAAGTTGAAAGTC-3，反向引物5，-ACCATACAAACCTATCTCTATT-3，CAPS2 正向引物 5，-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3，反向引物5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，CAPS3 正向引物 5，-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3，反向引物為5，-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3，反應(yīng)體系和條件同上，PCR產(chǎn)物分別采用AccI，EcoRI和XbaI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行 酶切，三種內(nèi)切酶均采用20 μ 1的反應(yīng)體系如下
0133]反應(yīng)體系
0134]PCR 產(chǎn)物5-10 μ 1
0135]0. 1 % BSA2μ 1
0136]IOXbuffer2μ 1
0137]酶5U補充dd H2O 至 20μ 1 ；將混合溶液置于37 °C，TaqI體系置于65 °C條件下各保溫4小時，產(chǎn)物采用 HDA-GT 12TM(eGene，USA)毛細(xì)管電泳系統(tǒng)進(jìn)行檢測。利用CAPS標(biāo)記分析F2群體遺傳規(guī)律，3個SNP位點均呈1:2:1的分離比例 (表1)，符合孟德爾單基因遺傳規(guī)律，因此CAPS方法可以有效區(qū)分抗性和敏感植株。表1、CAPS方法鑒定的SNP位點在F2世代中遺傳分離 (7) AS-PCR 方法將SNP位點置于引物的3’端，合成等位基因特異性引物，我們在位點2和3處設(shè) 計了 5條AS-PCR引物，配對得到6個引物組合，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，篩選到一條特異性引物 對，通過PCR方法直接區(qū)分高抗和高感種質(zhì)。
引物對序列如下AS-PCR 正向引物為 5，-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3，反向引物為5，-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3，。PCR反應(yīng)體系(25 μ 1)如下dNTP(10mmol/L)0. 5 μ 110 X PCR buffer (添加 MgCl2) (25mmol/L) 2. 5 μ 1上下游引物(10ymol/L)各0· 5 μ 1基因組DNAΙ.ΟμΙ雙蒸水定容至25 μ 1反應(yīng)條件94°C變性5min，94°C 30s、56°C 30s,72°C 45s，共 30 個循環(huán)，72°C延伸 7min,采用3 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。隨即選取100株F2代甜瓜遺傳分離植株進(jìn)行上述試驗，結(jié)果76株擴(kuò)增到清晰的 目的條帶，24株無條帶，符合3 1的單基因分離遺傳學(xué)規(guī)律(表2)，因此AS-PCR方法可 以有效區(qū)分Fom-2抗性和敏感植株。表2、AS-PCR方法鑒定的SNP位點2和3在F2世代中遺傳分離 實施例2、選取浙江地區(qū)栽培面積較多的薄皮和厚皮甜瓜品種及當(dāng)?shù)氐奶厣贩N，共計34 個(表3)。采用AS-PCR及CAPS方法對其進(jìn)行枯萎病抗性篩選。其中CAPS方法，我們采用特異性擴(kuò)增引物正向引物CAPS2-F 5，-GGAAGTGAGG-TGTTGAATT-3，與反向引物 CAPS2-R :5，-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3，)，以 待測品種基因組DNA為模板進(jìn)行特異性PCR(反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件同上)。產(chǎn)物純化 后采用EcoR I限制型內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，HAD-GT12 全自動毛細(xì)管核酸分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳分 析，數(shù)據(jù)校正后，記錄并分析結(jié)果。AS-PCR方法中，我們采用特異性擴(kuò)增引物正向引物2-3F1 5，-GTGTAACACAAA-TTCCTCAACA-3，與反向引物 2-3R1 :5，-GTGTAACACAAATTCCTCATCA-3，)， 以待測品種基因組DNA為模板進(jìn)行特異性PCR(反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件同上)，產(chǎn)物經(jīng) 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察電泳結(jié)果，記錄并分析結(jié)果。表3、常見甜瓜栽培品種Fom-2型與枯萎病抗性鑒定
我們采用AS-PCR與CAPS兩種方法對常規(guī)栽培品種進(jìn)行Fom-2功能性分子標(biāo)記，兩種方 法得到相同的結(jié)果。從試驗結(jié)果可以看出，我們從34份栽培品種中篩選到枯萎病抗性材料11份， 其中包含純合抗病品種2個，雜合抗病品種9個，為今后枯萎病抗性育種提供了良好的種質(zhì)資源。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā) 明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容 直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
一種用于甜瓜枯萎病抗性鑒定的功能性分子標(biāo)記，其特征是所述分子標(biāo)記所采用的CAPS引物序列為以下任意一種CAPS1正向引物為5’ TGCTCCTTTGGCTTCCTGT 3’反向引物為5’ GAGTCTATTGTTTCGCTTCA 3’，CAPS2正向引物為5’ GGAAGTGAGGTGTTGAATT 3’反向引物為5’ TACACATTGGTCCGTTAGAC 3’，CAPS3正向引物為5’ AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG 3’反向引物為5’ TGGCATCCTTCAGCACCTTC 3’；或者，所述分子標(biāo)記所采用的AS PCR引物序列為AS PCR正向引物為5’ GTGTAACACAAATTCCTCAACA 3’反向引物為5’ GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA 3’。
2.如權(quán)利要求1所述的功能性分子標(biāo)記的用途，其特征是用于甜瓜枯萎病的分子輔 助育種，或者用于鑒定甜瓜枯萎病抗性基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于甜瓜枯萎病抗性鑒定的功能性分子標(biāo)記，其所采用的CAPS引物序列為以下任意一種正向引物5’-TGCTCCTTTGGCTTCCTGT-3’，反向引物5’-GAGTCTATTGTTTCGCTTCA-3’；正向引物5’-GGAAGTGAGGTGTTGAATT-3’，反向引物5’-TACACATTGGTCCGTTAGAC-3’；正向引物5’-AGACGTAGCATTGCTTCTCTAG-3’，反向引物為5’-TGGCATCCTTCAGCACCTTC-3’；或者，其所采用的AS-PCR引物序列是正向引物5’-GTGTAACACAAATTCCTCAACA-3’，反向引物5’-GACGTAGCATTGCTTCTGTAGA-3’。該功能性分子標(biāo)記用于甜瓜枯萎病的分子輔助育種，或者用于鑒定甜瓜枯萎病抗性基因。
文檔編號C12Q1/68GK101899437SQ201010147650
公開日2010年12月1日 申請日期2010年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月15日
發(fā)明者張明方, 楊景華, 王士偉 申請人:浙江大學(xué)