專利名稱：一種微生態(tài)制劑中枯草芽孢桿菌有效數(shù)量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸用生物制品領(lǐng)域，具體地說是提供一種微生物數(shù)量檢測方法，即涉及一種益生菌添加劑中有效枯草芽孢桿菌的檢測方法。
背景技術(shù)：
微生態(tài)飼料添加劑是根據(jù)微生態(tài)學(xué)理論研制的含有對動物有益微生物的活菌制劑，它們通過維持動物腸道內(nèi)微生態(tài)平衡而發(fā)揮作用，具有促進動物生長發(fā)育，提高動物機體免疫力等多種功能，且無污染、無殘留、無耐藥性和對環(huán)境無害等，是一類新型綠色環(huán)保飼料添加劑。這些禽畜用的益生菌制劑含有芽孢桿菌，乳酸桿菌，糞鏈球菌，雙歧桿菌，酵母等，光合細(xì)菌和梭狀芽胞桿菌屬的部分菌株及噬菌蛭弧菌等也偶然被用做益生菌添加到仔豬和仔雞飼料中。微生態(tài)飼料添加劑一種新型的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資源，已在我國推廣并展現(xiàn)出美好的應(yīng)用前景。為了穩(wěn)定微生態(tài)制劑的應(yīng)用效果，必須首先保證微生態(tài)制劑的產(chǎn)品質(zhì)量。微生態(tài)制劑中有效微生物的活菌數(shù)量，是產(chǎn)品的質(zhì)量核心。因此有效微生物活菌數(shù)量檢測方法的準(zhǔn)確性，對指導(dǎo)生產(chǎn)、保證產(chǎn)品質(zhì)量有著非常重要的意義。使用益生菌添加劑時，其活菌數(shù)是影響作用效果的主要因素之一。研究認(rèn)為，要達(dá)到一定的作用效果，飼料中活菌數(shù)應(yīng)不低于1.0X106cfU/g。在畜牧生產(chǎn)中常用的微生態(tài)添加劑是乳酸菌和芽胞桿菌類。與乳酸菌、雙歧桿菌等相比，芽孢桿菌的優(yōu)點在于它對外界不良環(huán)境有很強的抵抗力，能耐60°C以上高溫，保存時間長(常溫下1年以上)，培養(yǎng)容易，便于加工制成各種制劑，效果穩(wěn)定。而目前在微生態(tài)制劑產(chǎn)品中，有效微生物數(shù)量的穩(wěn)定性(出廠檢驗至產(chǎn)品規(guī)定的有效期)是一個直接影響產(chǎn)品質(zhì)量和應(yīng)用效果的問題。由于大多數(shù)種類的微生物菌體，不能耐受高溫和干燥的影響，因此在產(chǎn)品中經(jīng)過一段時間就會喪失生活能力。即使選用具有抗高溫、抗干燥的芽孢桿菌，也因力生產(chǎn)工藝不同，在大生產(chǎn)條件下，真正形成芽孢的數(shù)量和比例也存在很大差異。而現(xiàn)在在檢測微生物制劑生產(chǎn)及產(chǎn)品中的芽孢桿菌時，使用常規(guī)的微生物稀釋平板測定法進行檢測，雖然可以相對準(zhǔn)確的測出樣品中的有效微生物活菌的總數(shù)，但卻無法區(qū)分出不同菌體形態(tài)所形成的菌數(shù)，即無法分辨出菌落是由性狀穩(wěn)定的芽孢萌發(fā)而形成的，還是由形狀不穩(wěn)定的營養(yǎng)體直接生產(chǎn)形成的。所以，使用現(xiàn)有方法難以測出產(chǎn)品中具體穩(wěn)定性的有效微生物數(shù)量，給評價產(chǎn)品的真正質(zhì)量帶來困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測方法的結(jié)果，不能反映出產(chǎn)品中有效活菌的真實數(shù)量，不能準(zhǔn)確評價產(chǎn)品的真正質(zhì)量的缺陷，從而在現(xiàn)有通用檢測方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)芽孢桿菌的生物學(xué)特性，提供一種用于微生物制劑的有效芽孢桿菌數(shù)量的檢測方法。本發(fā)明的目的是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的本發(fā)明提供的微生物制劑中有效芽孢桿菌數(shù)量的檢測方法，包括如下的步驟
(1)準(zhǔn)備采樣用的滅菌容器和采樣工具，如試管、三角瓶和勺等；(2)采樣，采用1)提供的滅菌工具采樣。對于飼料多的采不同點的樣品，充分混合，取500g左右檢測，對于小量存貯的采取上、中、下各部位樣品混合采樣；(3)用無菌生理鹽水對樣品進行10倍系列稀釋，根據(jù)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇庸烙嫞x擇2 3個適宜稀釋度進行下步試驗；(4)將上述稀釋液裝入三角瓶或試管中，置于恒溫水浴中進行高溫處理5 10分鐘；(5)同時，采用與步驟4)中相同的三角瓶或試管，加入與步驟3)中的稀釋樣品同體積的生理水，作為溫度處理的參照標(biāo)準(zhǔn)液，置于同一個水浴槽中進行高溫處理5 10分鐘；(6)取出經(jīng)高溫處理的樣品稀釋液，按照常規(guī)方法吸取Iml于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作2個平皿；(7)稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將涼至45士 1°C的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(可放置水浴鍋內(nèi)保溫)注入平皿約15ml，小心轉(zhuǎn)動平皿使試樣與培養(yǎng)基充分混勻。從稀釋試樣到傾注培養(yǎng)基之間，時間不能超過15min ；(8)待培養(yǎng)基凝固后，倒置平皿于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72士池取出，進行常規(guī)的菌落計數(shù)和計算，獲得該樣品中純芽孢萌發(fā)形成的菌數(shù)，則可代表該樣品的有效活菌數(shù)量。上述步驟(4)的恒溫水浴的溫度為75 100°C。上述步驟(5)的恒溫水浴的溫度為75 100°C。上述步驟(8)的恒溫培養(yǎng)箱溫度為洲 32°C。本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌計數(shù)結(jié)果可代表該樣品的有效活菌數(shù)量。
2、能保證有效期內(nèi)產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定，保證產(chǎn)品質(zhì)量。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的描述。實施例1 地衣芽孢桿菌制劑的制備方法，包括下述步驟(1)準(zhǔn)備采樣用的滅菌容器和采樣工具，如試管、三角瓶和勺等；(2)采樣，采用1)提供的滅菌工具采樣。對于飼料多的采不同點的樣品，充分混合，取500g左右檢測，對于小量存貯的采取上、中、下各部位樣品混合采樣；(3)用無菌生理鹽水對樣品進行10倍系列稀釋，根據(jù)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇庸烙嫞x擇2 3個適宜稀釋度一部分進行下一步試驗，一部分進行常規(guī)方法檢測；(4)將上述稀釋液裝入三角瓶或試管中，置于75°C恒溫水浴中進行高溫處理10分鐘；(5)同時，采用與步驟4)中相同的三角瓶或試管，加入與步驟3)中的稀釋樣品同體積的生理水，作為溫度處理的參照標(biāo)準(zhǔn)液，置于同一個水浴槽中75°C高溫處理10分鐘；(6)取出經(jīng)高溫處理的樣品稀釋液，按照常規(guī)方法吸取Iml于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作2個平皿；(7)稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將涼至45士 1°C的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(可放置水浴鍋內(nèi)保溫)注入平皿約15ml，小心轉(zhuǎn)動平皿使試樣與培養(yǎng)基充分混勻。從稀釋試樣到傾注培養(yǎng)基之間，時間不能超過15min ；(8)待培養(yǎng)基凝固后，倒置平皿于37°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72士池取出，進行常規(guī)的菌落計數(shù)和計算，獲得該樣品中純芽孢萌發(fā)形成的菌數(shù)，則可代表該樣品的有效活菌數(shù)量。結(jié)果見表1表1兩種方法的檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種微生態(tài)制劑中枯草芽孢桿菌有效數(shù)量的檢測方法，其特征包括如下的步驟1)準(zhǔn)備采樣用的滅菌容器和采樣工具，如試管、三角瓶和勺等；2)采樣，采用1)提供的滅菌工具采樣，對于飼料多的采不同點的樣品，充分混合，取 500g左右檢測，對于小量存貯的采取上、中、下各部位樣品混合采樣；3)用無菌生理鹽水對樣品進行10倍系列稀釋，根據(jù)飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或?qū)υ嚇庸烙嫞?選擇2 3個適宜稀釋度進行下步試驗；4)將上述稀釋液裝入三角瓶或試管中，置于恒溫水浴中進行高溫處理5 10分鐘；5)采用與步驟4)中相同的三角瓶或試管，加入與步驟幻中的稀釋樣品同體積的生理水，作為溫度處理的參照標(biāo)準(zhǔn)液，置于同一個水浴槽中進行高溫處理5 10分鐘；6)取出經(jīng)高溫處理的樣品稀釋液，按照常規(guī)方法吸取Iml于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作2個平皿；7)稀釋液移入平皿后，應(yīng)及時將涼至45士1°C的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(可放置水浴鍋內(nèi)保溫)注入平皿約15ml，小心轉(zhuǎn)動平皿使試樣與培養(yǎng)基充分混勻，從稀釋試樣到傾注培養(yǎng)基之間，時間不能超過15min ；8)待培養(yǎng)基凝固后，倒置平皿于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72士池取出，進行常規(guī)的菌落計數(shù)和計算，獲得該樣品中純芽孢萌發(fā)形成的菌數(shù)，則可代表該樣品的有效活菌數(shù)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有效芽孢桿菌數(shù)量的檢測方法，其特征在于所述步驟4)的恒溫水浴的溫度為75 100°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有效芽孢桿菌數(shù)量的檢測方法，其特征在于所述步驟5)的恒溫水浴的溫度為75 100°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的有效芽孢桿菌數(shù)量的檢測方法，其特征在于所述步驟8)的恒溫培養(yǎng)箱溫度為28 32°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種有效枯草芽孢桿菌數(shù)量檢測方法，該方法的特點是將檢測樣品進行簡便的物理方法處理后，按照常規(guī)方法吸取并計數(shù)，72h后平板上長出可見菌落，再進行常規(guī)的菌落計數(shù)和計算，獲得該樣品中純枯草芽孢桿菌數(shù)。本發(fā)明提供的方法適用于采用枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的微生態(tài)產(chǎn)品的質(zhì)量檢測。有利于指導(dǎo)生產(chǎn)，保證產(chǎn)品質(zhì)量。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明提供的檢測方法簡便，準(zhǔn)確易行。
文檔編號C12Q1/06GK102373263SQ201010254568
公開日2012年3月14日 申請日期2010年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月16日
發(fā)明者劉瑩, 王偉穎, 王小武, 閆亮亮, 魏德寶 申請人:瑞普(天津)生物藥業(yè)有限公司