專利名稱：一種菊花抗旱基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種菊花抗旱相關基因OtMYB，同時涉及 OtMYB基因在提高菊花抗旱能力中的應用。
背景技術：
太行菊(Opisthopappus taihangensis)是菊科太行菊屬植物，分布在我國河北、 山西等地，大多生長于海拔1，OOOm的山坡和懸崖巖石上，是我國特有的廣義菊屬植物中具 有較高抗旱性和抗逆性的種，并具有較強的觀賞性。研究太行菊的抗逆分子途徑并發現重 要的抗逆基因，將會為菊屬植物的抗逆基因工程奠定良好的理論基礎，并能提供優良的抗 旱基因資源。菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是世界上最重要的觀賞花卉之一， 也是我國栽培歷史悠久的傳統名花，加強菊花育種工作具有很高的經濟效益和社會效益。 多年來，自然突變、雜交和其它傳統育種方法在菊花新品種培育上取得了巨大成就。但是， 可利用資源的缺乏嚴重制約了菊花育種進程，因此，研究種質資源的多樣性，利用獲得的優 秀基因資源進行分子育種工程，結合常規育種方法，對獲得菊花新種質具有重要的作用。干旱是影響植物生長和發育的主要環境因子之一。據報道全球各地每年因不同程 度的干旱環境條件導致的植物及其產品減產的約在30%左右。尤其在我國北方和西部地 區，干旱脅迫嚴重地影響了觀賞植物的生長，進而限制其推廣應用。我國近年來年南方地區 的旱情也嚴重影響了作物和各種觀賞植物的生長。植物的抗旱性是指植物在干旱條件下的 生存能力，而觀賞植物的抗旱性是指在土壤干旱或大氣干旱條件下植物不僅能存活下來， 而且使其觀賞價值保持在一定水平的能力。因此，培養優良的抗旱花卉品種成為解決這一 問題的重要措施之一。植物觀賞價值的降低是植物遺傳基因在特定環境下表達的產物，其 中干旱是重要的影響因子之一。傳統農業中，主要利用常規的方法來選育抗旱的品種，但是 常規育種不僅費時、費力，而且不能滿足人們對抗旱節水新品種的需求。近年來，隨著分子 生物學研究的不斷深入和生物技術的迅猛發展，利用基因工程技術進行培育觀賞性強、耐 旱、耐鹽、抗病的優良觀賞植物新品種，已經成為當前研究熱點。MYB類轉錄因子為一類含MYB結構域的轉錄因子，MYB結構域為一段約51_52個 氨基酸的肽段，由一系列高度保守的氨基酸殘基和間隔序列組成。在MYB類轉錄因子中，每 隔約18個氨基酸出現一個規則的色氨酸殘基，以此形成了轉錄因子空間。植物中的MYB類 轉錄因子可簡單分成3個亞類，其中的R2R3亞構域類含有兩個MYB結構域，對應于動物中 C2MYB蛋白的R2和R3，其在植物次生代謝的調節、細胞的分化控制和對激素刺激的應答方 面起著重要作用(Heine，2007)。通過對擬南芥干旱、高鹽和ABA誘導基因的啟動子區域進 行分析，鑒定出了 MYB結合位點的核心序列為TAACTG，當MYB類轉錄因子和下游靶基因啟動 子的TAACTG核心序列結合后，即可誘導抗脅迫基因的表達。自1982年以來，在擬南芥和玉米中都發現存在著大量的MYB轉錄因子，它們是植 物轉錄因子中最大的家族之一，并在轉錄調節中起著多方面的重要作用。絕大多數的MYB 轉錄因子可以起到轉錄激活的作用。
在擬南芥中首次發現了受ABA誘導表達的AtMYB2基因，AtMYB2蛋白與bHLH類蛋 白RdBPl相互作用，協同調節Rd22基因的表達。這表明擬南芥中的R2R32MYB轉錄因子廣 泛地參與了植物對激素的應答。Agarwal等研究發現擬南芥MYB15為一類調控CBF和其他 冷脅迫應答基因的轉錄因子。Dai等在擬南芥中過量表達來自水稻的0sMYB3R22基因，發現 轉基因擬南芥提高了對冷、旱和鹽脅迫的耐受力，在種子發芽過程中，轉基因植株Tl代比 野生型更能忍受ABA及NaCl脅迫。擬南芥中的5個AtMYB3R基因所編碼的MYB蛋白的功 能在對細胞周期的調控中起作用。上述研究表明，MYB類轉錄因子在植物應答外界脅迫環 境中起著重要作用。對菊花育種而言，抗性育種是菊花品種培育的重點之一。然而傳統的育種方法雖 然取得了重大成就，但菊花的遺傳背景復雜，在傳統的育種中常受到基因資源和遠緣雜交 障礙等不利因素的限制。分子育種可以進行定向育種而不改變其它性狀，有利于打破遠緣 雜交障礙，擴大基因庫。因此，轉基因分子育種成為培育抗旱性新品種的捷徑。分離差異表 達基因對于了解和揭示植物生長發育規律，進行生物的改良、提高抗逆和抗病性等研究具 有重要的意義，為進一步培育出更新奇、抗旱的菊花新品種奠定基礎。

發明內容
本發明的目的在于提供一種菊花抗旱相關基因OtMYB屬于典型的R2R3-MYB轉錄 因子。本發明的另一個目的在于提供一種抗旱相關基因OtMYB在提高菊花品種抗旱能 力中的應用。本發明利用差異顯示(DDRT-PCR)和差減雜交(SSH)技術相結合，研究太行菊在干 旱脅迫下基因的表達情況，進行差異基因的分離。對獲得的差異片段進行序列分析，采用 RACE擴增得到抗旱相關基因OtMYB的全長cDNA序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示， 該基因共編碼424個氨基酸的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，C-端存在一個絲氨 酸豐富區，該基因具有兩個典型的MYB類轉錄因子的DNA結合區，屬于典型的R2R3-MYB轉 錄因子。應當理解，本領域技術人員可根據本發明公開的氨基酸序列，在不影響其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一個或幾個氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發明 蛋白還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有 同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白質。本發明基因包括編碼所述蛋白的核酸序列。此外，應理解，考慮到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領域技術 人員可以根據需要使用適合特定物種表達的密碼子。本發明的基因和蛋白質可以從太行菊中克隆或分離得到，或者通過DNA或肽合成 的方法得到。可將本發明基因與表達載體可操作地連接，得到能夠表達本發明蛋白的重組表達 載體，進而可以通過諸如農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等轉基因方法，將所述表 達載體導入宿主，得到轉OtMYB基因的轉化體。本發明通過將外源OtMYB基因整合進菊花基因組，轉基因植株的抗脅迫能力增 強，并且生長未受到干旱脅迫的顯著影響。表明OtMYB可用于提高菊花對干旱脅迫的抗性。


圖ImRNA差異顯示結果。1-6 不同干旱處理。圖2pBI_0tMYB植物表達載體的構建。圖 3 轉 OtMYB 基因植株的 PCR 檢測。M :2000bp DNAMarker ；1 :pBI121_0tMYB 陽性 對照；2 陰性對照；3-14 =PCR陽性植株。圖4轉基因植株和對照植株在正常澆水和水分脅迫下的表型變化。左對照植株； 中轉基因株系1 ；右轉基因株系2。圖5干旱脅迫處理對轉基因株系和對照植株生長的影響。左-右T1，T2，Τ3，Τ4， Τ5，對照。
具體實施例方式實施例IOtMYB基因的克隆1.建立定位群體采用PEG溶液對太行菊組培苗進行干旱脅迫，取樣后液氮速凍，-80°C保存，作為 抗旱基因定位群體；2.總RNA的提取和mRNA的分離1)RNA提取方法取幼嫩材料lOOmg，加液氮充分研磨，置入2ml離心管中，加入 ImlTrizol試劑，劇烈振蕩混勻，室溫靜置IOmin ；4°CT 12000rpm離心15min，去除沉淀； 將上清液移入新的離心管，加入等體積酚/氯仿/異戊醇(25 24 1)，劇烈振蕩，靜置 IOmin ；再次4°C下12000rpm離心15min ；將上層水相移至新的離心管中，加入等體積氯仿/ 異戊醇(24 1)，劇烈振蕩，靜置IOmin ；4°C下12000rpm離心15min ；將上層清液移入新離 心管，加入等體積異丙醇沉淀RNA，混勻靜置30min ；4°C下12000rpm離心IOmin ；棄上清，加 入75%乙醇1ml，洗沉淀3遍；再用100%乙醇洗滌沉淀；室溫或真空干燥沉淀10-30min ； 加入30-50 μ 1 DEPC處理水溶解RNA ；55_60°C溫育IOmin ；測OD值定量RNA濃度。2)分別提取葉片、根系的總RNA然后進行等量混合，得到的RNA中采用磁珠法進行 mRNA分離。3. OtMYB基因的克隆及序列分析在獲得的和擬南芥MYB基因有高度相似性的序列上設計特異引物，進行RACE克 隆。首先用 Clontech 公司的 SMART RACE cDNAAmplification Kit 分別合成用于 RACE 的 3，-cDNA和5，-cDNA，太行菊的mRNA用于反轉錄的模板。特異RACE引物包括5，-RACE引 物和3，-RACE引物，按照說明書中對PCR引物的要求(23-28nt, 50-70% GC, Tm > 65°C )， 選擇合適的位置，設計特異性引物如下5，-RACE 引物為5，-GGTGTCGCATACTTTBCCCTCGGG-3，3，-RACE 引物為5，-GGCTGGAAGCAGGCGGGACGAGAAC-3，根據5’ -RACE和3’ -RACE的測序結果，分別在起始密碼子和終子密碼子附近設計 OtMYB全長基因的引物，以反轉錄得到的cDNA為模板進行PCR擴增。正向引物5，-GGCTGGAAGCAGGGGGCACGAGAAC-3，反向引物5，-GGTGTCGCATACTTTBCCCTCGGA-3，
1)反應體系如下PCR反應體系 2) PCR擴增程序如下
回收PCR產物，并測序檢測。
實施例20tMYB表達載體的構建1.利用大腸桿菌DH5a制備感受態細胞，配制OD值在0. 6-0. 9的菌落培養液。分 別取克隆載體和PBI121質粒DNA 3-5 μ L于感受態細胞中，重組質粒轉化大腸桿菌；提取大 腸桿菌質粒DNA。2. DNA片段的酶切和回收質粒酶切所用的緩沖液參照Takara試劑目錄選擇，單酶切選用產品附帶的緩沖 液，雙酶切根據試劑目錄選擇最適緩沖液。一般1 μ g質粒至少加IU的酶，37°C溫育2h。在本實驗使用了試劑盒提取質粒，純度較高，酶切效果較好。一般酶切時間Ih即 可切開，3-4h可以完全酶切，對沒有星號活性的酶進行過夜酶切效果更好，較難切的酶可 在中間補加一次酶，因為酶比重較大易于沉淀管底，所以要最后加酶，加完后用槍輕輕吸打 混合，不要用震蕩儀劇烈震蕩，最后短暫離心，把管壁上的液體甩下來，酶切總體積一般為 10-20 μ L，盡量保持體積大小不變。DNA片段的回收選用博大泰克公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，操作步驟如下1)將單一的目的DNA條帶從凝膠中切下(盡量切除多余部分)，放入干凈的離心
管中稱取重量。
2)向膠中加入3倍體積溶膠液PN (如凝膠重為0. Ig,其體積可視為100 μ L，則加 入300 μ L溶膠液)，50°C水浴放置lOmin，其間不斷溫和地上下翻轉離心管，以確保膠塊充 分溶解。如還有未溶的膠塊，可再補加一些溶膠液。待溶膠液降至室溫時，加入10yL3M的 醋酸鈉，以調節PH值。3)將上步所得溶液加入吸附柱中，13000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱重新放 入收集管中。4)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液PW，13000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱重
新放入收集管中。5)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液PW，13000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱重 新放入收集管中，13000rpm再離心2min，盡量去除漂洗液，將吸附柱置于室溫或50°C烘箱 數分鐘，徹底的晾干。6)將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65_70°C 水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2min，13000rpm離心Imin收集DNA溶液。3.表達載體的構建所用植物表達載體為pBI121，含有篩選標記基因Npt錯誤！未找到引用源。和報 告基因⑶S。Npt錯誤！未找到引用源。基因的啟動子為N0S-pro，Gus基因的啟動子為花椰 菜花葉病毒的(CaMV) 35S啟動子。用限制性內切酶XbaI和SmaI分別酶切表達載體pBI121 和中間克隆載體，分別回收載體大片段和目的片段，然后進行定向粘端-平末端的連接。連 接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，PBI121中含有篩選標記基因NPT II，因此含重組質粒的 大腸桿菌可以在平板上生長，未轉入重組質粒的則不能正常生長。通過PCR擴增初步確定 陽性克隆，并進行雙酶切鑒定，確定目的基因已經連接到植物表達載體。把經酶切鑒定的陽 性克隆通過凍融法轉化農桿菌感受態細胞，進行類似的PCR和酶切鑒定。4.農桿菌感受態細胞的制備和液氮凍融法轉化農桿菌1)從平板中挑取農桿菌EHA105單菌落接種于含100 μ g/mL利福平的IOmL LB液 體培養基中，28°C，200rpm震蕩培養約20h。2)把上述培養過夜的培養物按1 100轉接入液體LB培養基中，28°C，200rpm繼 續震蕩培養約4-6h，使農桿菌OD值約為0. 3-0. 5。3)將菌液倒入預冷的無菌離心管中，冰浴20-30min，4°C，5000rpm離心lOmin，棄上清。4)加入 20mL 預冷的 0. IM CaCl2 和 0. 05M MgSO4 溶液，懸浮菌體，冰浴 30min。4°C， 5000rpm離心lOmin，棄上清。5)加入預冷的ImL含20_25%甘油的0. IM CaCl2和0. 05MMgS04溶液，懸浮菌體。 按每管150 μ L分裝于離心管中，液氮速凍l-2min，于_70°C保存備用。取_70°C保存的EHA105農桿菌感受態細胞置于冰上融化，取5 μ L質粒于感受態細 胞中，旋轉混勻，冰浴30min，液氮中速凍lmin，37°C熱激5min，迅速放置冰上2min，然后加 入800-1000 μ L液體LB培養基(不含抗生素)，28°C 140-160rpm振蕩培養4_5h使農桿菌 復蘇。取300 μ L培養液均勻涂布于含100 μ g/mL Rif和100 μ g/mLKan的平板上，待菌液 被培養基吸收后倒置培養皿，28°C暗培養2d左右。5.根癌農桿菌Ti質粒的提取
1)挑取根癌農桿菌單菌落接種在40mL液體YEB培養基中，28°C，200rpm振蕩培養 過夜。2)將40mL菌液分別置于4個IOmL的離心管中，6000rpm離心5min收集菌體。3)每管各加入900μ L溶液I，用渦旋振蕩器充分懸浮菌體，室溫下放置約lmin。4)每管加入1. 5mL溶液II，緩慢地上下翻轉離心管十多次，溫和混勻，室溫放置 5min。5)每管加入180 μ L預冷的溶液III，上下翻轉離心管十多次，溫和混勻，冰浴 IOmin,或放入 _20°C冰箱 5min。6) 12000rpm, 4 °C，離心5min，移取上清液，加入2/3倍體積的酚/氯仿抽提， 12000rpm 離心 5min。7)移取上清液，加入2倍體積的無水乙醇，混勻。放入_20°C冰箱30min。8) 12000rpm離心5min，倒掉無水乙醇，再瞬時離心，然后用移液槍盡可能地吸去 無水乙醇，再用0. 5mL70%乙醇洗DNA沉淀兩次，12000rpm離心2min，倒掉乙醇。9)再次12000rpm離心30s，風干lOmin，以進一步去除殘留的乙醇。10)每管各加入15 μ L無菌水溶解DNA沉淀，輕彈至完全溶解。6.農桿菌中陽性克隆的篩選和鑒定當單菌落長出后，隨機挑取單菌落接種于含100 μ g/mL Rif和100 μ g/mL Kan的 液體LB培養基中，于28°C 200rpm振蕩培養l_2d。反應程序為94°C預變性4min，94°C變性 30s，56°C復性lmin，72°C延伸lmin，30個循環，最后在72°C延伸lOmin。用于擴增hpt基 因的引物是 Pl :5，-GAT GTT GGC GAC CTC GTA ΤΤ-3，，P2 :5，-TCG TTA TGT TTA TCG GCA CTT T-3，，預期產物大小為584bp。反應程序為94°C預變性4min，94°C變性30s，55°C復性 45s，72°C延伸lmin，30個循環，最后在72°C延伸5min。結果表明得到了鑒定正確的陽性克 隆。實施例3對抗旱相關基因OtMYB表達的結果和應用根據OtMYB基因所在的克隆序列，用限制性內切酶XbaI和SmaI分別酶切表達載 體PBI121和中間克隆載體進行定向粘端-平末端的連接，采用農桿菌EHA105介導的遺傳 轉化方法，將基因組載體導入地被菊品種‘晚粉’葉片外植體中，最終獲得OtMYB陽性植株 5株。將地被菊品種‘晚粉’的5個轉基因株系T1、T2、T3、T4、T5和對照CK，栽植于培養 箱中。選取8-10片真葉時期的菊花苗進行脅迫處理，在30°C 30% RH的條件下控水4d。選 擇生長40天的菊花成苗進行控水4d處理，綜合分析其抗旱性。經過4天的控水脅迫后，5個轉基因株系的幼苗生長和對照相比，株高值均比對照 值大。從表型上觀察，5個轉基因株系的生長未受到顯著的影響，總體的萎蔫程度均比對照 低，葉子相對挺拔，植株干旱受害程度較對照輕。這表明在輕度的干旱脅迫下，轉基因株系 的抗旱能力有所提高，轉入的轉錄因子基因延緩了轉基因植株的受害程度。經過4天的干 旱后，對轉基因株系和對照的株高、冠幅和節間進行了比較，結果顯示轉基因植株的株高明 顯比對照株高大，差異較顯著，平均冠幅差異達到了 2. 42cm。由于干旱脅迫導致菊花的節間 伸長受影響，因而對照與轉基因植株相比，節間長度也明顯受到抑制。因此，抗旱相關基因OtMYB可以在菊花品種中應用，有助于提高菊花對干旱脅迫的抗性。
權利要求
菊花抗旱蛋白OtMYB，其為1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白。
2.編碼權利要求1所述蛋白的菊花菊花抗旱基因OtMYB。
3.如權利要求1所述的基因，其核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權利要求4所述載體的宿主細胞。
6.權利要求2或3所述基因在菊花品種選育中的應用。
7.權利要求2或3所述基因在提高菊花抗旱能力中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種菊花抗旱相關基因OtMYB，同時涉及OtMYB基因在提高菊花抗旱能力中的應用。本發明菊花抗旱基因OtMYB具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。該基因具有兩個典型的MYB類轉錄因子的DNA結合區，屬于典型的R2R3-MYB轉錄因子。OtMYB與菊花抗旱性相關，通過遺傳轉化，將基因轉入普通菊花品種，能夠有效提高菊花品種對干旱脅迫的抗性。
文檔編號C12N5/10GK101928337SQ20101025574
公開日2010年12月29日 申請日期2010年8月18日 優先權日2010年8月18日
發明者張啟翔, 蔡明 , 趙伶俐, 陸苗, 高亦珂 申請人:北京林業大學