專利名稱：一種煙蚜hunchback基因cDNA及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于昆蟲分子生物學與植物基因工程領域，具體涉及一種煙蚜胚胎發(fā)育關鍵基因hunchback (.Mphb ) cDNA的克隆，表達Mphb dsRNA轉基因煙草的獲得。
背景技術：
刺吸式口器害蟲是一類重要的農業(yè)害蟲，主要包括同翅目、半翅目、及部分雙翅目昆蟲，如稻飛虱，稻葉蟬，棉盲蝽及各種蚜蟲等。刺吸式口器害蟲常群居于嫩枝、葉、芽、花蕾、果上，汲取植物汁液，掠奪其營養(yǎng)，造成枝葉及花卷曲，甚至整株枯萎或死亡。如稻飛虱一般危害損失為2到3成，嚴重危害損失3到5成，甚至絕收。而棉盲蝽近年來已上升為
棉田主要害蟲,轉基因抗蟲棉被棉盲蝽為害后,蕾鈴大量脫落,成鈴率明顯降低,棉花產量與品質大幅度下降。刺吸式口器害蟲還能傳播各種病毒，蚜蟲傳播植物病毒病的能力更是居病毒媒介昆蟲的首位，僅桃蚜一種至少可傳播107種植物病毒病，棉蚜一種至少可傳播55種植物病毒病。傳播病毒病所造成的危害往往遠遠超過蚜蟲本身造成的危害(宋新元，2005)。煙蚜是重要的刺吸式口器害蟲，食性雜，寄主廣泛，除危害煙草夕卜，還危害桃、李、梨等果樹、油菜、白菜、甘藍、芥菜、蘿卜等十字花科蔬菜以及瓜類、茄類和多種花卉林木。煙蚜發(fā)生數(shù)量大，危害時間長。若蚜或成蚜以口針刺入葉肉、嫩莖或嫩蕾、花、果吸食汁液，嚴重時致失水而葉片卷縮、變形，生長緩慢，組織破壞甚至死亡。煙蚜還可傳播黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(TMV)等多種病毒，對農業(yè)生產造成重大損失。目前，刺吸式口器害蟲防治主要依賴于具有強觸殺作用和內吸作用的化學農藥，如樂果、馬拉硫磷和溴氰菊酯等。化學殺蟲劑在害蟲防控中發(fā)揮了重要作用，但長期使用會破壞生態(tài)環(huán)境，危害人類健康。常規(guī)育種在抗蟲作物品種培育中發(fā)揮了重要的作用，但單純的常規(guī)育種手段周期較長，且受遠緣雜交不親和的限制，遠緣物種的優(yōu)良抗蟲基因難以被快速有效地利用。一些病原微生物能誘發(fā)刺吸式口器害蟲流行病，但多數(shù)是昆蟲專性病原真菌，一般較難培養(yǎng)和生產，目前在實際應用方面還存在一定困難。通過白僵菌、綠僵菌等生防真菌以及信息素、植物凝集素防治刺吸式口器害蟲尚處在研究與探索階段，目前國內尚未有針對刺吸式口器害蟲的高效生物農藥在大田推廣應用。而天敵昆蟲如瓢蟲、蚜繭蜂、草蛉等的大規(guī)模飼養(yǎng)和釋放還比較困難，成本較高，短期內難以發(fā)展成為一種常規(guī)生防措施在農業(yè)生產上大面積推廣應用。隨著現(xiàn)代生物技術的發(fā)展，植物基因工程在農業(yè)上的應用取得了巨大的進展，目前己有轉基因植物抗刺吸式口器害蟲的報道，所用的基因主要有Bt蛋白基因，蛋白酶抑制劑基因，植物凝集素基因。而且有報道稱，害蟲對轉基因植物的耐受性有上升的趨勢。RNA干擾(RNA Interference,RNAi)是由雙鏈RNA(double stranded RNA, dsRNA)引起的同源mRNA特異性降解的現(xiàn)象,小RNA(siRNA和microRNA)在RNA干涉機制中發(fā)揮關鍵作用。RNA干涉普遍存在于植物、動物和真菌中，是真核生物中存在的一種抵抗病毒入侵、抑制轉座子活動、調控基因表達的監(jiān)控機制。RNAi技術在農業(yè)害蟲生物防治領域具有廣闊的應用前景。1998年,有科學家首次利用RNAi技術研究了黑腹果蠅與frizzled2基因的功能。隨后的眾多研究也表明，在注射或進食靶標序列dsRNA后，昆蟲靶標基因的表達也可被有效阻斷。通過體外顯微注射dsRNA可以成功敲除刺吸式口器害蟲稻飛虱不同表達模式的基因。黃曲條跳甲在注射跨膜氣味受體基因dsRNA后，對十字花科寄主的偏好性減弱。在人工飼料中添加三磷酸腺苷酶基因dsRNA后，玉米根螢葉甲iicavirgifera rirgi/era)三磷酸腺苷酶基因表達明顯受抑制,幼蟲生長停滯甚至死亡。棉鈴蟲有一受棉酚誘導的P450全長基因GIP,當棉鈴蟲幼蟲進食表達P450全長基因GIP dsRNA的轉基因煙草后，幼蟲中腸組織中GIP的轉錄水平被顯著抑制并伴隨過氧化氫酶活性的上升，同時由于棉鈴蟲中腸內的表達的下調而使幼蟲生長受到抑制，對棉酚的耐受性降低。此外，通過dsRNA飼喂對白蟻內源纖維素基因與Hexamerin儲存蛋白基因的干擾具有致死與致畸效應。經dsRNA飼喂后默R比亞按蚊的幾丁質酶基因可被有效沉默。有報道稱在水稻中表達跨膜轉運蛋白基因或羧肽酶基因dsRNA可提高水稻對稻褐飛虱的抗性。除在害蟲生物防治中的應用外，RNAi技術也是昆蟲功能基因組研究的重要手段，目前已被廣泛應用于昆蟲胚胎發(fā)育的基因調控研究，但主要限于有性繁殖的昆蟲如果蠅、谷盜和金小蜂等。間隙基因m編碼一含鋅指的轉錄因子，是昆蟲胚胎發(fā)育中負責體·節(jié)分化的關鍵基因之一，研究表明其在膜翅目，直翅目，雙翅目，鞘翅目等昆蟲中普遍存在，但拷貝數(shù)存在差異。從mRNA可由母體提供,也可在合子中合成。母體M mRNA合成受后端母體因子(nos)的調控，而合子的mRNA則受前端母體基因AicoitZ (bed)的控制。在果妮中，從與orthodenticle {otd)基思是bicoid Ocor)基因的下游革G基因，ActZ和從的互作激活W和另外兩個前端間隙基因spiracles (ems)和buttonhead(btd)的表達。此外,從被發(fā)現(xiàn)在果蠅中樞神經系統(tǒng)細胞分化中發(fā)揮重要作用。昆蟲M基因的沉默具有強烈的致畸與致死效應。果蠅功能缺失會導致頜和胸部體節(jié)的缺失。通過RNAi沉默擬谷盜屬Tribolium和金小蜂yVasoflia的母體或合子A辦基因后，其頭部和胸部會發(fā)生缺陷。這些研究表明胎胚發(fā)育關鍵基因是害蟲生物防治的一個潛在靶標。在目前膜翅目(如蚊子)、直翅目(如蝗蟲)、半翅目(如蝽蟓)等昆蟲的從基因部分mRNA序列已能查詢。豆蟲牙(Acyrthosiphon pi sum)全基因組序列已公布，豆蟲牙力辦(,Aphb )基因以單拷貝存在。但目前煙姆hunchback iMphb )尚未被克隆,更沒有以Mphb為靶標來防治煙蚜的研究報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種煙姆(妙^ 5· persicae、hunchback基通(Mphb)的cDNA及其應用，通過將煙蚜胚胎發(fā)育關鍵基因i^AkDNA轉到植株中，獲得表達Mphb dsRNA的能抑制煙蚜繁殖的轉基因植物(特別是煙草)，煙蚜取食轉基因煙草后，Mphb表達受抑制，煙蚜胚胎發(fā)育受阻，日平均產蚜數(shù)減少，繁殖能力下降，從而用于煙蚜的生物防治。本發(fā)明提供的技術方案是一種物從基因的cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。該序列是發(fā)明人首次從煙蚜中克隆的#/ 基因，該基因能夠作為RNAi的靶標，在煙蚜的防治中具有很大的應用價值。本發(fā)明還提供所述cDNA編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
一種所述cDNA的克隆方法，包括以下步驟
(O從煙蚜成蟲提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA ；
(2)設計簡并引物，所述簡并引物正向序列如SEQID NO. 3所示，反向序列如SEQ IDNO. 4所示；
(3)以步驟(I)得到的cDNA為模板，用步驟(2)所述的引物進行PCR擴增；
(4)純化步驟(3)得到的PCR產物，回收目的片段，取純化產物連接到pMD18-T載體上得到pMD18-T-i^^i，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，篩選含pMD18_T_i^^i的陽性克隆子；
(5)將步驟(4)所得的陽性克隆子進行序列測定，得到權利要求I所述的cDNA。一種所述cDNA的應用所述cDNA用于防治煙蚜，從所述的cDNA序列中選取427bp·(見SEQ ID NO. I中第303-729位核苷酸)作為干涉靶標，構建合成物況7 dsRNA的植物表達載體，通過根癌農桿菌介導轉化獲得表達#/ dsRNA的能抑制煙蚜繁殖的轉基因植物，煙蚜取食所述轉基因植物后，煙蚜的#/ 表達受抑制，煙蚜胚胎發(fā)育受阻，繁殖能力下降。上述的應用，所述植物為煙草，果樹，十字花科蔬菜，瓜類或茄類。上述的應用，其中，獲得表達#/ dsRNA的能抑制煙蚜繁殖的轉基因煙草的方法步驟如下
(Y)MphbdMk片段靶標序列的擴增與酶切位點的引入設計引物，擴增MphbcMk片段427bp靶標序列，在上下游分別引入I與BeuM I位點，所述弓I物正向序列如SEQ IDNO. 5所示，反向序列如SEQ ID NO. 6所示；
(2)純化步驟(I)所得PCR產物，回收目的片段，取純化產物連接到pMD18-T載體上得到pMD18-T-i^^i，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，選含pMD18_T_i^^i的陽性克隆子，培養(yǎng)陽性克隆子，從中提取PMD18-T-姆質粒；
(3)mi^-Mphbi酶切以獲得靶標片段，酶切結束后，回收靶標片段；
(4)pUCCRNAi反向連接位點的酶切，酶切結束后，回收pUCCRNAi反向連接片段；
(5)pUCCRNAi反向連接片段與靶標片段連接得到pUCCRNAi-i^^-R，取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，篩選含pUCCRNAi-i^^-R的陽性克隆子；
(6)pUCCRNAi-i^^-R正向連接位點的酶切，酶切結束后，回收pUCCRNAi-R大片
段；
(8)pUCCRNAi-i^^-R大片段與姆靶標片段連接得到pUCCRNAi_i^^-F-R，取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，篩選含pUCCRNAi-i^^-F-R的陽性克隆子；
(9)pUCCRNAi-i^^-F-RdsRNA表達框物從-F-R的酶切，酶切結束后，回收^CCmki-Mphb-V-R dsRNA 表達框片段姆AA-F-R ；
(10)pCAMBIA2300的酶切，酶切結束后，回收pCAMBIA2300大片段。(11) PCAMBIA2300大片段與Mphb dsRNA表達框片段Mphb-Y-R的連接得到植物表達載體pCAMBIA2300-i^^i，取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，篩選含PCAMBIA2300-物從i的陽性克隆子；提取質粒pCAMBIA2300-物從i，通過酶切與測序，確認載體構建正確；
(12)植物表達載體pCAMBIA2300-i^^i轉化根癌農桿菌；
(13)轉基因煙草的獲得采用葉盤轉化法獲得轉基因煙草植株，將步驟(12)含有植物表達載體PCAMBIA2300-物從i的農桿菌接種于YEB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD6tltl=O. 6 I. 0，浸染煙草葉盤，然后將葉盤轉移到共培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)，再將葉盤轉移到分化培養(yǎng)基光照培養(yǎng)25-35天，保持28 30°C，分化出小苗后，將苗轉移到生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，生根后將苗移栽到土壤，繁殖到T2代。本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明首次從煙姆中克隆hunchback iMphb )基因cDNA。而且本發(fā)明人首次以Mphb為干涉靶標，通過植物介導的RNAi培育表達dsRNA的轉基因煙草，沉默的轉錄表達，抑制煙蚜的繁殖與種群數(shù)量，研究基礎好，前瞻性高，害蟲產生抗性的風險低，是一種防治蟲牙蟲的好方法。本發(fā)明利用煙姆基因的cDNA通過培育表達dsRNA的煙草來防治蚜蟲的方法具有雙重干涉功能。mkMphb dsRNA的轉基因煙草，被煙蚜取食后，煙蚜#/ 表達受抑制，神經系統(tǒng)發(fā)育被破壞，胚胎發(fā)育受阻，日平均產蚜數(shù)減少，繁殖
能力下降。此種轉基因煙草可直接應用于大田生產，提高煙草對煙蚜的抗性，降低因煙蚜危害引起的損失，提高煙葉產量與經濟價值。也可以將此種煙草與其它煙草品種雜交，育成新的抗煙蚜的煙草品種，并最終應用于大田生產。此外，本發(fā)明所述方法防治對象不僅包括直接取食轉基因煙草的蚜蟲，還包括蚜蟲的胚胎(后代)，這樣此方法又能通過雙重途徑防治蚜蟲。因此，本發(fā)明雖然只針對一個干涉靶標基因，卻具有雙重干涉功能與雙重防治途徑的特點。由于煙蚜食性雜，寄主廣泛，除危害煙草外，還危害桃、李、梨等果樹、油菜、白菜、甘藍、芥菜、蘿卜等十字花科蔬菜以及瓜類、茄類和多種花卉林木。因此，RNAi植物表達載體pCAMBIA2300-Mphbi載體可用于轉化其它作物，以獲得表達Mphb dsRNA的其它轉基因作物，同樣可用于煙蚜的生物防治。


圖I A為煙蚜Affi7C從ad (物從)基因的克隆及RNAi植物表達載體的構建。M:250bp ladder marker ；1 -.Mphb cDNA (1325bp)。B 為雄祝 干涉祀標序列擴增。M DL2000marker ； I -Mphb 干涉祀標序列(427bp)
圖2為RNAi植物表達載體的酶切驗證。M λ -Hind III digest DNA marker ；1 RNAi植物表達載體pCAMBIA2300-i^^i用I酶切的結果，顯示預期大小的兩條帶；2 :未經酶切的PCAMBIA2300-物從i。圖3為通過根癌農桿菌介導轉化獲得轉基因煙草的過程，以根癌農桿菌浸染煙草葉盤，經誘導，共培養(yǎng)，分化，生根，移栽最后獲得轉基因煙草。圖4為轉基因煙草的PCR檢測。設計引物對為dsRNA表達框上游的的35S啟動子序列進行擴增，得到預期的442bp條帶，說明為dsRNA表達框序列已成功轉化煙草。M DL2000 marker ;3、5、12為三個轉化pCAMBIA2300-i^^i的轉基因煙草株系；空白為轉化PCAMBIA2300空載體的轉基因煙草；野生型為沒有經過轉基因處理的野生型煙草。圖5為煙蚜取食轉基因煙草后日產蚜數(shù)減少。每株轉基因(株系3、5、12)煙草接種10頭新生若蚜，第7-12天統(tǒng)計每日產蚜數(shù)，以沒有經過轉基因處理的野生型煙草與轉化PCAMBIA2300空載體的煙草為對照。每種煙草設8個重復。
圖6為煙蚜取食轉基因煙草后繁殖總量降低。每株轉基因煙草接種10頭新生若蚜，第14天統(tǒng)計單株煙蚜頭數(shù)。圖7為煙蚜取食轉基因煙草后總生物量降低。每株轉基因煙草接種10頭新生若蚜，第14天統(tǒng)計單株煙草上的煙蚜總生物量。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。本發(fā)明從煙蚜中克隆到胚胎發(fā)育關鍵基因hunchback (Mphbm cDNA，它具有SEQID NO. I所示的序列
(1)SEQ ID NO. I 的信息
(a)序列特征
序列長度1325堿基對 類型核酸 鏈型雙鏈 拓撲結構線性
(b)分子類型cDNA
(c)假設否
(d)反義否
(e)最初來源煙姆(妙^ 5·per si cae )
(f)序列描述SEQID NO. I
(2)SEQ ID NO. 2 的信息
(a)序列特征
序列長度441氨基酸 類型氨基酸 鏈型單鏈 拓撲結構線性
(b)分子類型蛋白質
(c)序列描述SEQID NO. 2
本發(fā)明煙姆iMphb)基因cDNA的克隆方法,包括以下步驟
(O從煙蚜成蟲提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA ；
(2)根據(jù)豆蚜、膜翅目、直翅目及半翅目昆蟲d基因的保守序列設計簡并引
物
Mphb forward: 5’ -AAAAANCACAARTGCAAACANTG-3’ (SEQ ID NO. 3)
Mphb reverse: 5_’ CCCATGTGSATMGWGTASAKGA-3’ (SEQ ID NO. 4)
(3)以cDNA為模板，PCR擴增MpM基因
PCR條件為首先將下述試劑混合在一起，
煙蟲牙cDNA μ
脫氧核苷酸底物dNTPs 2μ1IOXTaq DNA聚合酶緩沖液2μ1 Ex-Taq DNA 聚合酶O. 2μ1
Mphb forward (10M-M) O. 4M-1
Mphb reverse (10M-M) 0. 4M-1
ddH20 14μ1
總體積20μ1
反應條件為首先94°C預變性3分鐘；然后進行如下循環(huán)94°C 30秒，57.6°C 30秒，72°C 80秒，共進行35循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。如圖IA所示，其中M為250bp ladder marker, I號泳道為預期的物從cDNA序列(1325bp)。(4)純化步驟(3)所得PCR產物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產物連接到PMD18-T載體上得到pMD18-T-i^^i，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，37°C平板培養(yǎng)，藍白斑篩選含pMD18-T-i^^i的陽性克隆子；
(5)將步驟(4)所得的陽性克隆子進行序列測定，得到基因1325 bp序列。上述獲得的姆 A6cDNA片段用于培育一種表達姆AAdsRNA的能抑制煙姆繁殖的轉基因煙草，培育步驟如下
(l)##6cDNA片段靶標序列的擴增與酶切位點的引入。設計引物，擴增姆AkDNA片段下游427bp靶標序列(見SEQ ID NO. I中第303-729位核苷酸)，在上下游分別引入I與BamW I位點，引物序列如下
MphbiY 辦’ -TGTCGACCAGCCTCAAGCAGCATC-3，( Sal I ) (SEQ ID NO. 5)
Mphb iR 5 -CGGATCCCGACGAGGAGTTGTTATT-3 ( BamH I ) (SEQ ID NO. 6)
PCR條件為首先將下述試劑混合在一起，
ΡΜ 18- -MpAbi 質粒O. 5μ1
脫氧核苷酸底物dNTPs 2μ1
IOXTaq DNA聚合酶緩沖液2μ1 Ex-Taq DNA 聚合酶O. 2μ1
Mphb iF (ΙΟμΜ) O. 4μ1
Mphb iR (ΙΟμΜ) O. 4μ1
ddH20 14. 5μ1
總體積20μ1
反應條件為首先94°C預變性3分鐘；然后進行如下循環(huán)94°C 30秒，52°C 30秒，72°C 45秒，共進行35循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。如圖IB所示，其中M為DL2000 marker,I號泳道為預期的427bp Mphb靶標序列。(2)純化步驟(I)所得PCR產物，瓊脂糖凝膠回收目的片段，取純化產物連接到PMD18-T載體上得到pMD18-T-i^^i，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，37°C平板培養(yǎng)，藍白斑篩選含pMD18-T-#/^^i的陽性克隆子，將陽性克隆子用液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，從菌液中提取pMD18-T-i^^i質粒；
(3)PMD18-T-姆酶切以獲得靶標片段，酶切體系如下
Sal I :3μ1BamW I : 3Μ-1ΡΜ 18- -MpAbi 28μ110XT buffer: 6M-I在37°C下反應2小時。酶切結束后，瓊脂糖凝膠回收#/ 靶標片段。(4) pUCCRNAi反向連接位點的酶切，酶切體系如下
Sal I : 4M-1
BamW I : 4M-1pUCCRNAi: 26μ110XT buffer: 6M-I在37°C下反應8小時。
·
酶切結束后，瓊脂糖凝膠回收pUCCRNAi反向連接片段。(5) pUCCRNAi反向連接片段與姆7況7靶標片段連接得到pUCCRNAi_i^^-R，連接體系如下
Mphb革巴標片段6. 5μ1 pUCCRNAi反向連接片段2μ1 T4 Iigase: O. 5Μ-1 T4 ligase buffer: IM-I 在16°C下反應8小時
取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，37°C平板培養(yǎng)，藍白斑篩選含pUCCRNAi-i^^-R的陽性克隆子；
(6) pUCCRNAi-i^^-R正向連接位點的酶切，酶切體系如下
Xho I : 4M-1Bgl II :4μ1pUCCRNAi: 28μ1IOXH buffer: 4M-1在37°C下反應8小時。酶切結束后，瓊脂糖凝膠回收pUCCRNAi-i^AA-R大片段。
(8)pUCCRNAi-i^^-R大片段與姆靶標片段連接得到pUCCRNAi_i^^-F-R，連接體系如下
Mphb革巴標片段6. 5μ1 pUCCRNAi-i^^-R 大片段2μ1 T4 ligase: O. 5M-1 T4 ligase buffer: IM-I 在16°C下反應8小時
取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，37°C平板培養(yǎng)，藍白斑篩選含pUCCRNAi-i^^-F-R的陽性克隆子；
(9)pUCCRNAi-A/^F-R dsRNA表達框i^6-F-R的酶切，反應體系如下； ^CCmki-Mphb-V-R 34μ1
Pst I :2μ1IOXH buffer: 4M-1在37°C下反應2小時。酶切結束后，瓊脂糖凝膠回收dsRNA表達框片段i^^-F-R。
(10)pCAMBIA2300的酶切，體系如下
PCAMBIA2300 34μ1
Pst I :2μ1
IOXH buffer: 4M-1
在37°C下反應2小時。酶切結束后，瓊脂糖凝膠回收pCAMBIA2300大片段。·
(11)pCAMBIA2300欠微與MphbdsRNA表達框片段姆AA-F-R的連接得到植物表達載體 pCAMBIA2300-J^^i，體系如下
Mphb~ -R\ 6. 5M-1PCAMBIA2300 大片段2μ1T4 ligase: O. 5M-1T4 ligase buffer: IM-I在16°C下反應8小時
取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，37°C平板培養(yǎng)，藍白斑篩選含PCAMBIA2300-物從i的陽性克隆子；提取質粒pCAMBIA2300-物從i，通過酶切與測序，確認載體構建正確。(12) pCAMBIA2300-物從i的酶切驗證，酶切體系如下 pCAMBIA2300-i^^i 5μ1
Pst I : μ IOXH buffer: 2μ1ddH20 12μ1
在37°C下反應2小時。酶切結束后，瓊脂糖凝膠檢測酶切效果。如圖2所示，其中M為250bp laddermarker, I號泳道為酶切后的pCAMBIA2300_J^^i，顯示預期的兩條帶，質粒pCAMBIA2300條帶與約IlOObp的dsRNA表達框i^6-F-R條帶，2號泳道為未經酶切的pCAMBIA2300t^^。(12)植物表達載體pCAMBIA2300_i^^i轉化根癌農桿菌
將經過酶切和測序檢測的植物表達載體用凍融法轉化根癌農桿菌EHA105。每支感受態(tài)細胞(100 μ I)加入pCAMBIA2300-i^^i質粒10 μ I，混勻，冰浴30 min,轉入液氮冷凍5min，迅速置37°C水浴5 min。在超凈臺上加入I ml不含抗生素的液體YEB培養(yǎng)基，28°C，180 r mirf1搖床上培養(yǎng)4 h。將菌液5000 r mirf1離心5 min,棄去上清液,吸取100 200μ I新鮮YEB液體培養(yǎng)基重懸沉淀后涂布固體YEB培養(yǎng)基(含50 mg Γ1的利福平和50 mg卡那霉素)，于28°C下培養(yǎng)約兩天，將長出的菌斑接種于液體YEB培養(yǎng)基(含50 mg L—1的利福平和50 mg L—1卡那霉素),于28°C搖床180 r mirT1培養(yǎng)約I天后從菌液提取質粒,通過電泳與PCR檢測，確認pCAMBIA2300-姆已成功轉化農桿菌。(13)轉基因煙草的獲得
采用葉盤轉化法獲得轉基因煙草植株。將健康煙草葉片置于大培養(yǎng)皿，用75%乙醇浸泡滅菌3 min，用滅菌水沖洗3次，O. 1%升汞浸泡滅菌8分鐘，用滅菌水沖洗5次。用滅菌的打孔器打孔得到葉盤。用誘導培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+ O. I mg Γ1 NAA + I mg Γ1 BA + 3%蔗糖+ O. 375% phytagel，pH，5. 7)25°C暗培養(yǎng)葉盤3 5天。將含有植物表達載體的農桿菌接種于YEB培養(yǎng)基(5g L—1胰蛋白胨，Ig L—1酵母提取物，5 g L—1牛肉膏，5 g L—1蔗糖，O. 5g Γ1 MgSO4. 7H20, 50 mg Γ1 利福平，50 mg L—1 卡那霉素)，180 200 r mirT1，28°C下培養(yǎng)至0D_=0. 6 I. 0，浸染葉盤30 min。將葉盤轉移到滅菌吸水紙上，吸干表面菌液后轉移到共培養(yǎng)基(MS 培養(yǎng)基 + O. I mg Γ1 NAA + I mg Γ1 BA + 3% 蔗糖+ O. 375% phytagel,pH，5. 7)，25°C左右暗培養(yǎng)兩天，將葉盤轉移到分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+0. I mg Γ1 NAA +I mg L-1 BA+ 3%鹿糖+ 500 mg L-1 頭孢霉素+100 mg L-1 卡那霉素+ O. 375% phytagel,pH, 5. 7)，光照培養(yǎng)一個月左右，保持28 30°C，每10天更換一次分化培養(yǎng)基。分化出小苗后，將苗轉移到生根培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+ O. I mg Γ1 NAA + 3%蔗糖+ 80 mg Γ1卡那霉素+ 250 mg L—1頭孢霉素+ O. 375% phytagel, pH, 5. 7),每天光照16 h。生根后將卡那霉素抗性苗移栽到土壤，繁殖到T2代。如圖3所示，經愈傷組織誘導，共培養(yǎng)，分化，生根培養(yǎng)，最后得到了煙草轉化子，并移栽成活。(14)轉基因煙草的PCR檢測針對dsRNA表達框的35S啟動子區(qū)設計引物，以轉·基因煙草基因組DNA為模板進行PCR擴增，以轉化空載體的煙草為對照。引物序列如下
35SF:5’ -ACAGAACTCGCCGTAAAG-3’ (SEQ ID NO. 7)
35SR:5’ -AGTGGGATTGTGCGTCAT-3’ (SEQ ID NO. 8)
PCR條件為首先將下述試劑混合在一起，
煙草 DNA μ
脫氧核苷酸底物dNTPs 2μ1
IOXTaq DNA聚合酶緩沖液2μ1 Ex-Taq DNA 聚合酶O. 2μ1
35SF (ΙΟμΜ) O. 4μ1
35SR (ΙΟμΜ) O. 4μ1
ddH20 14μ1
總體積20μ1
反應條件為首先94°C預變性3分鐘；然后進行如下循環(huán)94°C 30秒，50°C 30秒，72 °C 45秒，共進行35循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。PCR結束后，瓊脂糖凝膠檢測結果。如圖4所示，M DL2000 marker ;3、5、12為三個轉化pCAMBIA2300-物從i的轉基因株系；空白為轉化PCAMBIA2300空載體的煙草；野生型為沒有經過轉基因處理的野生型煙草。說明Aphb dsRNA表達框序列已成功轉化煙草。
轉基因煙草抗蚜試驗
T2代轉基因煙草在4-5葉期，在煙草頂葉用毛筆每株接種10頭初生煙蚜，接種后接煙草置于20X20X20 (長X寬X高)cm用紗布密封的養(yǎng)蟲籠內，保持恒溫25°C。每株轉基因煙草接種10頭新生若蚜，每種煙草設8個重復，第7-12天統(tǒng)計每日產蚜數(shù)。如圖5所示，以野生型煙草(野生型)與轉化空載體的煙草(空白)為對照，取食含有#/ dsRNA表達框的煙草后(株系3、5、12 )，煙蚜日產蚜數(shù)減少。
接種后第14天統(tǒng)計單株煙蚜頭數(shù)與煙蚜總生物量。如圖6所示，煙蚜取食含有 Mphb dsRNA表達框的轉基因煙草后繁殖總量降低。如圖7所示，煙蚜取食含有dsRNA表達框的轉基因煙草后總生物量也顯著降低。
權利要求
1.一種物況7基因的cDNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種#/ 基因表達的蛋白，其特征在于，其由權利要求I所述的cDNA所編碼，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種如權利要求I所述cDNA的克隆方法，包括以下步驟 (O從煙蚜成蟲提取總RNA，然后反轉錄合成cDNA ； (2)設計簡并引物，所述簡并引物正向序列如SEQID NO. 3所示，反向序列如SEQ IDNO. 4所示； (3)以步驟(I)得到的cDNA為模板，用步驟(2)所述的引物進行PCR擴增，得到擴增片段； (4)純化步驟(3)得到的PCR產物，回收目的片段，取純化產物連接到pMD18-T載體上，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，篩選含目的片段的陽性克隆； (5)將步驟(4)所得的陽性克隆進行序列測定，得到權利要求I所述的cDNA。
4.一種如權利要求I所述cDNA的應用，其特征在于從權利要求I所述的cDNA序列中選取SEQ ID NO. I中第303-729位的427bp作為干涉靶標，構建合成物從dsRNA的植物表達載體，通過根癌農桿菌介導轉化獲得表達#/ dsRNA的能抑制煙蚜繁殖的轉基因植物，煙蚜取食所述轉基因植物后，煙蚜的#/ 表達受抑制，煙蚜胚胎發(fā)育受阻，繁殖能力下降。
5.根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述植物為煙草，果樹，十字花科蔬菜，瓜類或茄類。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所述植物為煙草。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于獲得表達dsRNA的能抑制煙蚜繁殖的轉基因煙草的方法步驟如下 (OMphbdm片段靶標序列的擴增與酶切位點的引入設計引物，擴增MphbcMk片段427bp靶標序列，在上下游分別引入I與BeuM I位點，所述弓I物正向序列如SEQ IDNO. 5所示，反向序列如SEQ ID NO. 6所示； (2)純化步驟(I)所得PCR產物，回收目的片段，取純化產物連接到pMD18-T載體上得到pMD18-T-i^^i，然后轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，選含pMD18_T_i^^i的陽性克隆子，培養(yǎng)陽性克隆子，從中提取PMD18-T-姆質粒； (3)mi^-Mphbi酶切以獲得靶標片段，酶切結束后，回收#/ 靶標片段； (4)pUCCRNAi反向連接位點的酶切，酶切結束后，回收pUCCRNAi反向連接片段； (5)pUCCRNAi反向連接片段與靶標片段連接得到pUCCRNAi-i^^-R，取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，篩選含pUCCRNAi-i^^-R的陽性克隆子； (6)pUCCRNAi-i^^-R正向連接位點的酶切，酶切結束后，回收pUCCRNAi-R大片段； (8)pUCCRNAi-i^^-R大片段與姆靶標片段連接得到pUCCRNAi_i^^-F-R，取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，篩選含pUCCRNAi-i^^-F-R的陽性克隆子； (9)pUCCRNAi-i^^-F-RdsRNA表達框物從-F-R的酶切，酶切結束后，回收^CCmki-Mphb-V-R dsRNA 表達框片段姆AA-F-R ； (10)pCAMBIA2300的酶切，酶切結束后，回收pCAMBIA2300大片段； (11)pCAMBIA2300大片段與Mphb dsRNA表達框片段Mphb-Y-R的連接得到植物表達載體pCAMBIA2300-i^^i，取連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞ToplO，篩選含PCAMBIA2300-物從i的陽性克隆子；提取質粒pCAMBIA2300-物從i，通過酶切與測序，確認載體構建正確； (12)植物表達載體pCAMBIA2300-i^^i轉化根癌農桿菌； (13)轉基因煙草的獲得 采用葉盤轉化法獲得轉基因煙草植株，將步驟(12)含有植物表達載體PCAMBIA2300-物從i的農桿菌接種于YEB培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD6tltl=O. 6 I. 0，浸染煙草葉盤，然后將葉盤轉移到共培養(yǎng)基進行暗培養(yǎng)，再將葉盤轉移到分化培養(yǎng)基光照培養(yǎng)25-35天，保持28 30°C，分化出小苗后，將苗轉移到生根培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，生根后將苗移栽到土壤，繁殖到T2代。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種煙蚜hunchback基因的cDNA及其應用，通過將煙蚜(Myzuspersicae)胚胎發(fā)育關鍵基因hunchback(Mphb)cDNA轉到植物中，獲得表達MphbdsRNA的能抑制煙蚜繁殖的轉基因植物，煙蚜取食轉基因煙草后，Mphb表達受抑制，煙蚜胚胎發(fā)育受阻，日平均產蚜數(shù)減少，繁殖能力下降，從而用于煙蚜的生物防治。
文檔編號C12N15/10GK102851297SQ20121025702
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權日2012年7月23日
發(fā)明者毛建軍, 曾凡榮 申請人:中國農業(yè)科學院植物保護研究所