一種體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，即利用海藻酸鹽凝膠支架對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外三維培養(yǎng)，通過(guò)改變海藻酸鈉的分子量、古羅糖醛酸含量與甘露糖醛酸含量（GM）比、鈣離子濃度、鈣化時(shí)間等支架制備參數(shù)調(diào)控凝膠支架的剛度，用于模擬不同腫瘤組織微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)的軟硬程度，以實(shí)現(xiàn)不同組織來(lái)源腫瘤干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，成本低廉，性能可控，易于規(guī)模放大，是一種很好的將不同來(lái)源的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增的方法。
【專利說(shuō)明】一種體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及提供一種體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，特別涉及一種基質(zhì)剛度可控的海藻酸鹽凝膠支架的制備。
【背景技術(shù)】 [0002]腫瘤干細(xì)胞已被證實(shí)為惡性腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根本原因，其研究對(duì)于闡明腫瘤的發(fā)生機(jī)制、生物學(xué)行為以及為今后尋找靶向腫瘤干細(xì)胞的根治治療方案都具有十分重要的意義。然而腫瘤干細(xì)胞在腫瘤組織及腫瘤細(xì)胞系中含量很低，難以得到足夠量的純度高的腫瘤干細(xì)胞用于研究，這是當(dāng)前腫瘤干細(xì)胞研究所面臨的障礙之一。
[0003]細(xì)胞微環(huán)境按其性能可分為生物化學(xué)因素和生物物理因素。基質(zhì)剛度(substratestiffness)作為生物物理因素之一，近年來(lái)被證實(shí)與細(xì)胞生物學(xué)行為密切相關(guān)。體內(nèi)實(shí)體組織表現(xiàn)出一系列的剛度，用彈性模量(E)來(lái)表示，例如腦組織為0.Ι-lkPa，肌肉組織為10kPa-15kPa，而骨組織為25_45kPa。對(duì)于干細(xì)胞，培養(yǎng)基質(zhì)的剛度影響其未分化狀態(tài):剛度為0.6kPa時(shí)，胚胎干細(xì)胞可長(zhǎng)期維持在未分化狀態(tài)；適當(dāng)?shù)幕|(zhì)剛度(12kPa)促進(jìn)骨骼肌干細(xì)胞的自我增殖。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC細(xì)胞)的分化方向也受到基質(zhì)剛度調(diào)節(jié)；當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境的剛度類似肌肉組織的剛度時(shí)，MSC細(xì)胞會(huì)分化成肌肉細(xì)胞；而周圍環(huán)境剛度降到和腦組織相似的時(shí)候，MSC細(xì)胞則會(huì)分化成神經(jīng)細(xì)胞。對(duì)于腫瘤細(xì)胞，基質(zhì)剛度則參與調(diào)解其增殖、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。在較硬的基質(zhì)上，腫瘤細(xì)胞伸展，形成應(yīng)力纖維和成熟的黏著斑，迅速轉(zhuǎn)移；在與正常組織相似硬度的基質(zhì)上，腫瘤細(xì)胞呈圓形，失去轉(zhuǎn)移能力，增殖減緩。研究表明，基質(zhì)剛度對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)是通過(guò)細(xì)胞膜表面的跨膜蛋白受體integrin提高胞外信號(hào)調(diào)解激酶(ERK)活性和增加ROCK (Rho kinase)產(chǎn)生的收縮。有證據(jù)表明，腫瘤干細(xì)胞特性的維持有賴于特殊的腫瘤微環(huán)境，而該微環(huán)境中的生物物理因素一基質(zhì)剛度是調(diào)控腫瘤干細(xì)胞生物學(xué)行為的重要因素。因此，不同組織來(lái)源的腫瘤干細(xì)胞其最適基質(zhì)剛度是不同的。本發(fā)明利用的海藻酸鹽凝膠體系能夠構(gòu)建出不同基質(zhì)剛度即適合不同來(lái)源的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，是一種普適性的腫瘤干細(xì)胞體外擴(kuò)增體系。
[0004]目前腫瘤干細(xì)胞的體外培養(yǎng)主要由與滋養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)或通過(guò)特殊的干細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)實(shí)現(xiàn)，雖然滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的某些細(xì)胞因子能夠在一定程度上達(dá)到維持腫瘤干細(xì)胞不分化的目的，但與體內(nèi)腫瘤組織的三維生長(zhǎng)方式不同，該方法中腫瘤干細(xì)胞呈現(xiàn)一種二維生長(zhǎng)方式，失去了腫瘤干細(xì)胞的眾多特性。取而代之的是利用添加生長(zhǎng)因子EGF和bFGF的干細(xì)胞培養(yǎng)基擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞。然而，該培養(yǎng)基以及生長(zhǎng)因子價(jià)格十分昂貴，不利于培養(yǎng)體系的放大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的是一種體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0007]一種體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，[0008]I)確定所需體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞于生物體內(nèi)所處環(huán)境的基質(zhì)剛度；
[0009]2)利用海藻酸鹽凝膠支架包埋所需體外擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞，使包埋后的凝膠支架的基質(zhì)剛度為步驟I)所確定的腫瘤干細(xì)胞所處環(huán)境的基質(zhì)剛度的90-110% ；
[0010]3)進(jìn)行包埋后腫瘤細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
[0011 ] 即利用海藻酸鹽凝膠支架包埋腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行體外三維培養(yǎng)(示意圖1 )，通過(guò)改變海藻酸鈉的分子量、GM比、濃度及形成凝膠所必需的二價(jià)陽(yáng)離子濃度和作用時(shí)間等凝膠支架制備參數(shù)調(diào)控凝膠支架的基質(zhì)剛度，以實(shí)現(xiàn)不同組織來(lái)源的腫瘤干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
[0012]其特征在于:所述海藻酸鈉分子量范圍為100-1000kDa、濃度為0.5%_3%、G/M比范圍為0.2-0.7 ;并且海藻酸鈉包括使用多肽(如精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，即RGD等)或有機(jī)化合物(如聚乙二醇等)進(jìn)行修飾。
[0013]所述二價(jià)陽(yáng)離子種類為鈣、鋇等陽(yáng)離子，濃度范圍為IOmmol.L^l-SOOmmol.L_S作用時(shí)間為15-60分鐘；
[0014]所述凝膠支架為200微米至5毫米的凝膠微球以及其它形狀如立方體、片層狀等;
[0015]所述凝膠支架的基質(zhì)剛度在IkPa-1OOkPa之間；
[0016]所述不同腫瘤組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞為肝癌、肺癌、頭頸部鱗癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤來(lái)源的一種；
[0017]所述構(gòu)建不同基質(zhì)剛度的凝膠支架可以通過(guò)改變海藻酸鈉的分子量、濃度、G/Μ比和二價(jià)陽(yáng)離子濃度及作用時(shí)間來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0018]所述腫瘤干細(xì)胞包括肝癌、`肺癌、頭頸部鱗癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中的一種。
[0019]所述體外三維培養(yǎng)為靜態(tài)或者動(dòng)態(tài)條件下的細(xì)胞三維培養(yǎng)。
[0020]所述銳孔擠壓法為一種公知的技術(shù)，如靜電液滴法。
[0021]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0022]1.操作簡(jiǎn)單，成本低，本發(fā)明利用海藻酸鹽凝膠作為細(xì)胞三維培養(yǎng)的載體，容易制備，避免使用昂貴材料和工藝；
[0023]2.海藻酸鹽凝膠為其內(nèi)部細(xì)胞提供了三維生長(zhǎng)環(huán)境，且制備的凝膠其基質(zhì)剛度具有可控性；
[0024]3.本發(fā)明不但在常規(guī)靜態(tài)培養(yǎng)下能實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤干細(xì)胞的擴(kuò)增，還可以應(yīng)用到動(dòng)態(tài)培養(yǎng)體系如轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)體系中，利于規(guī)模化放大；
[0025]4.應(yīng)用范圍廣，本發(fā)明方法通過(guò)模擬不同來(lái)源腫瘤的微環(huán)境，能夠適合不同組織來(lái)源的腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增，并可用于抗腫瘤藥物的篩選。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為利用海藻酸鹽凝膠體外三維培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的示意圖。
[0027]圖2為利用不同基質(zhì)剛度海藻酸鈣凝膠培養(yǎng)的舌鱗癌細(xì)胞:㈧海藻酸鈉濃度為
1.5% (w/v) ; (B)海藻酸鈉濃度為2.5% (w/v) ; (C)海藻酸鈉濃度為3% (w/v)0
[0028]圖3為不同基質(zhì)剛度對(duì)腫瘤干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響。(A) 0ct3/4; (B)Nanog;(C)ABCG2:(D)CD44。[0029]圖4為濃度0.5% (w/v)的海藻酸鈉形成的凝膠培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞。
[0030]圖5為不同濃度鈣離子形成海藻酸鈣凝膠培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞其0ct3/4基因的表達(dá)情況。【具體實(shí)施方式】
[0031]實(shí)施例1:擴(kuò)增舌鱗癌干細(xì)胞
[0032]I)確定舌鱗癌干細(xì)胞于人體內(nèi)所處環(huán)境的基質(zhì)剛度為8_17kPa (Engler, A.J.，et al., Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.Cell, 2006.126(4):p.677-689.);
[0033]2)將舌鱗癌細(xì)胞分別與不同濃度1.5%、2.5%、3%(g/100ml)的海藻酸鈉(分子量200kDa，GM比0.4)溶液混合，調(diào)整細(xì)胞密度為IO6ceIls.mL—1，利用靜電液滴法滴入IOOmmol.L4CaCl2溶液中，室溫韓化30min,形成粒徑400_500um海藻酸韓凝膠。其凝膠支架的基質(zhì)剛度為4kPa、10kPa、20kPa;
[0034]3)之后，用DMEM培養(yǎng)液洗滌3次，然后添加含有質(zhì)量濃度10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37° C、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)15天后(圖2)，利用55mmol.L—1檸檬酸鈉溶解包埋有舌鱗癌細(xì)的海藻酸鈣凝膠，收獲內(nèi)部類組織化細(xì)胞團(tuán)，提RNA,分析0ct3/4、Nanog等干細(xì)胞自我更新相關(guān)基因表達(dá)(Schrader, J., et al., Matrixstiffness modulates proliferation, chemotherapeutic response, and dormancy inhepatocellular carcinoma cells.Hepatologyj2011.53(4):p.1192-1205.)，
[0035]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，濃度為1%的海藻酸鈉形成的海藻酸鈣凝膠(ALG-BEADS)培養(yǎng)的舌鱗癌細(xì)胞中干細(xì)胞相關(guān)的基因表達(dá)最高。說(shuō)明該彈性模量的海藻酸鈣凝膠適合舌鱗癌干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
[0036]實(shí)施例2:擴(kuò)增肝癌干細(xì)胞
[0037]I)確定肝癌干細(xì)胞于人體內(nèi)所處環(huán)境的基質(zhì)剛度為0.6-3kPa(YEH, ff.-C., Elastic modulus measurements of human liver and correlation withpathology.Ultrasound in Med.&Biol, 2002.28 (4):p.467-474.)；
[0038]2)將肝癌細(xì)胞與0.5%(g/100ml)的海藻酸鈉(分子量200kDa，GM比0.4)溶液混合，調(diào)整細(xì)胞密度為IO6ceIls.πι?Λ利用靜電液滴法滴入IOOmmol.[1CaCl2溶液中，室溫鈣化30min,形成粒徑300-400um海藻酸鈣凝膠。其凝膠支架的基質(zhì)剛度為lkPa。
[0039]3)之后，用培養(yǎng)液洗滌3次，然后添加含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液。
[0040]培養(yǎng)一段15天后(圖4)，利用55mmol.1檸檬酸鈉溶解海藻酸鈣凝膠，收獲內(nèi)部類組織化細(xì)胞團(tuán)，提RNA，分析肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物在的表達(dá)情況。結(jié)果表明，肝癌干細(xì)胞標(biāo)記物⑶90、⑶133表達(dá)均顯著上調(diào)。說(shuō)明該彈性模量的海藻酸鈣凝膠適合肝癌干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
[0041]實(shí)施例3:通過(guò)改變鈣離子濃度改變凝膠支架彈性模量
[0042]將肝癌細(xì)胞與0.5%(g/100ml)的海藻酸鈉(分子量430kDa，GM比0.4)溶液混合，調(diào)整細(xì)胞密度為IO6Cells.mL—1，利用靜電液滴法分別滴入25mmol.r50mmol.L'IOOmmol.L_1>200mmol.L1CaCl2溶液中，室溫|丐化30min,形成粒徑300-400um海藻酸鈣凝膠。之后，用培養(yǎng)液洗滌3次，然后添加含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37°C、5%C02、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2天更換培養(yǎng)液。
[0043]培養(yǎng)一段時(shí)間后，用55mmol.T1檸檬酸鈉溶解海藻酸鈣凝膠，收獲內(nèi)部類組織化細(xì)胞團(tuán)，提RNA，分析相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著鈣離子濃度增加，干細(xì)胞因子0ct3/4的表達(dá)上調(diào)，且當(dāng)鈣離子濃度為200mM時(shí)，0ct3/4上調(diào)40多倍(圖5)。當(dāng)海藻酸鈉質(zhì)量濃度為0.5%，鈣離子濃度為200mM時(shí)形成海藻酸鈣凝膠的彈性模量與肝組織彈性模量最接近，因此最適合肝癌干細(xì)胞 的體外擴(kuò)增。
【權(quán)利要求】
1.一種體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于: 1)確定所需體外擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞于生物體內(nèi)所處環(huán)境的基質(zhì)剛度； 2)利用海藻酸鹽凝膠支架包埋所需體外擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞，使包埋后的凝膠支架的基質(zhì)剛度為步驟I)所確定的腫瘤干細(xì)胞所處環(huán)境的基質(zhì)剛度的90-110% ； 3)進(jìn)行包埋后腫瘤細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
2.按照權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于: 利用海藻酸鹽凝膠支架包埋腫瘤細(xì)胞，并進(jìn)行體外三維培養(yǎng)；通過(guò)改變海藻酸鈉分子量、GM比、濃度以及形成凝膠必需的陽(yáng)離子濃度和反應(yīng)時(shí)間等支架制備參數(shù)調(diào)控凝膠支架的基質(zhì)剛度，模擬不同腫瘤組織的基質(zhì)剛度，以實(shí)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的體外擴(kuò)增。
3.按照權(quán)利要求1所述的擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于: 所述腫瘤細(xì)胞為不同腫瘤組織來(lái)源的腫瘤細(xì)胞，它們?yōu)楦伟⒎伟㈩^頸部鱗癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤來(lái)源的一種； 對(duì)應(yīng)的，所述腫瘤干細(xì)胞為肝癌、肺癌、頭頸部鱗癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、骨肉瘤、膠質(zhì)瘤來(lái)源的腫瘤干細(xì)胞的一種； 所述體外三維培養(yǎng)為靜態(tài)或者動(dòng)態(tài)的細(xì)胞三維培養(yǎng)。
4.按照權(quán)利要求1所述擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于: 利用海藻酸鹽凝膠支架包埋所需體外擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞過(guò)程為:將腫瘤細(xì)胞與海藻酸鈉溶液均勻混合，利用銳孔擠壓·法將混合后的溶液噴射入含有二價(jià)陽(yáng)離子的溶液中，作用一定時(shí)間后得到包埋有腫瘤細(xì)胞的海藻酸鹽球形凝膠支架； 或者采用直接將混合均勻的腫瘤細(xì)胞與海藻酸鈉溶液轉(zhuǎn)移到孔板中，加入含有二價(jià)陽(yáng)離子的溶液，作用一定時(shí)間后，根據(jù)需要切割為所需形狀的海藻酸鹽凝膠支架； 腫瘤細(xì)胞于海藻酸鈉溶液中的密度為IO5-1O7ceIls -mr1 ;所述海藻酸鈉溶液的質(zhì)量濃度為 0.5%-3% ； 所述二價(jià)陽(yáng)離子種類為鈣或鋇離子，它們于溶液中的濃度為IOmmol ^dOOmmol作用時(shí)間為15-60分鐘。
5.按照權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述海藻酸鈉分子量為 100-1000KDa、GM 比范圍為 0.2-0.7。
6.按照權(quán)利要求4或5所述的擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述海藻酸鈉為使用多肽或有機(jī)化合物進(jìn)行修飾后的海藻酸鈉。
7.按照權(quán)利要求4所述的擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于:權(quán)利要求4所獲得的包埋有腫瘤細(xì)胞的海藻酸鹽凝膠支架表面用聚賴氨酸或殼聚糖修飾，得到修飾的海藻酸鹽凝膠支架。
8.按照權(quán)利要求4或5所述的擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述凝膠支架的基質(zhì)剛度在1-1OOkPa之間。
9.按照權(quán)利要求4或7所述的擴(kuò)增腫瘤干細(xì)胞的方法，其特征在于:所述海藻酸鹽凝膠支架粒徑為200微米至5毫米。
【文檔編號(hào)】C12N11/10GK103571792SQ201210259932
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2012年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月25日
【發(fā)明者】馬小軍, 劉暢, 孫廣煒, 徐小溪, 劉洋, 于煒婷 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所