專利名稱：用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法
技術領域：
本發明涉及了一種培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，特別是用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法。
背景技術：
人胚胎干細胞(human embryonic stem cell，hESC)最初由 Thomson 等于 1998 年從處于囊胚階段的早期胚胎中分離。通過分離人囊胚內細胞團，以35Gy γ射線照射的小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblast, MEF)作為培養層體外培養，約9_15天后將細胞團吹散，然后繼續在MEF上培養，挑選具有均一未分化形態的單克隆細胞團進行培養，如此重復培養至成系。hESC具有自我更新和分化的全能性的特點，注射到重癥聯合免疫缺陷的小鼠(severe combined immunodeficiency mice，SCID)中,可獲得包含3個胚層分化細胞的畸胎瘤；體外懸浮培養hESC可發育成胚樣體(embryoid body)，亦可檢測到3個胚層的細胞存在。為使體外培養的hESC長久地保持未分化狀態，除特殊的培養條件外，需要與滋養層細胞(feeder layer)共培養。培養層細胞(例如MEF)能分泌多種細胞因子，抑制hESC 的自發分化(Martin，1981)。但由于MEF屬鼠源的特性，出于臨床應用的安全性考慮，為防止動物源性病原體的傳播，MEF作為培養層細胞培養hESC的臨床應用受到了極大的限制。研究人員嘗試開發人體組織作為培養層細胞，如胚胎皮膚、肌肉組織，成人輸卵管上皮細胞，尿道內皮細胞，包皮成纖維細胞，成體骨髓基質細胞等(Cheng et al.，2003 ；Hovatta et al. ,2003 ；Inzunza et al. ,2005 ；Lee et al. ,2005 ；Richards et al. ,2003)。然而這些細胞的實際取材非常困難，加上倫理學的限制，使其作為大規模臨床應用培養hESC的培養層細胞幾乎不可能。因為hESC分離培養自人胚胎組織，倫理學問題極大的限制了它在臨床上的實際應用。2006年和2007年，日本科學家山中伸彌帶領的研究團隊分別發現了小鼠體細胞和人的成熟體細胞能通過人工方法誘導成具有hESC特點的多潛能干細胞，命名為人源性人工誘導多潛能干細胞(iPS Jnduced pluripotent stem cell) (Takahashi K et al.，2006 ； Takahashi K et al.，2007)，這一發現一舉克服了 hESC應用范疇的倫理學問題，為若干非感染性疾病的治療開啟了希望之門。iPS細胞技術在全世界實驗室中逐漸被成熟和完善， 其安全性也逐漸得到了加強，比如現在已不需要使用病毒介導即可達到誘導iPS細胞的目的，成瘤性問題也逐漸得到了解決(Kaji et al.，2009)。然而，iPS細胞的培養和hESC — 樣，需要動物源性的MEF作為飼養層細胞才能使之保持未分化的狀態，這一問題成為了 iPS 臨床應用中的一大亟需克服的障礙和難題。

發明內容
本申請的發明目的在于克服現有技術的缺陷，而提供一種安全可靠地培養未分化的人源性人工誘導多潛能干細胞的方法。為了完成本申請的發明目的，本發明采用以下技術方案本發明的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，它包括以下步驟(1)用人羊膜間充質細胞的培養基，將體外的人羊膜間充質細胞培養在15cm的細胞培養瓶中達到80-90%融合；其中( 去掉步驟(1)中的人羊膜間充質細胞的培養基，加入IOml新鮮人羊膜間充質細胞的培養基，在該培養基中加入100 μ 1濃度為lmg/ml的絲裂霉素C混勻，然后將其放置于36. 5-37. 5°C的(X)2細胞培養箱中40分鐘，去掉含有絲裂霉素C的培養基，再用 IOml D-Hank' s平衡鹽溶液洗滌3次，再加入15ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養
基備用；(3)將在15cm細胞培養瓶中生長到直徑為4mm-6mm的人源性人工誘導多潛能干細胞去掉多余的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，只在細胞培養瓶保留5ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，加入濃度為10mg/ml的膠原酶IV，使膠原酶IV的最終濃度為 lmg/ml，混勻后置于36. 5-37. 5°C的(X)2細胞培養箱中15分鐘，去掉含膠原酶IV的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，用IOml Knockout DMEM洗滌3次后，再加入IOml人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，用5ml移液管對準克隆的人源性人工誘導多潛能干細胞快速吹打，使其脫落在培養基中，對于貼附緊密的人源性人工誘導多潛能干細胞，可用移液管輕刮人源性人工誘導多潛能干細胞，用機械力使其脫落，待人源性人工誘導多潛能干細胞全部脫落在培養基后，再次吹打使其破碎成較小的人源性人工誘導多潛能干細胞的細胞團， 然后將其轉移到4個預處理過的上述步驟O)的培養瓶中，每瓶放入2. 5ml ；(4)在室溫下，對步驟C3)培養瓶中的細胞進行培養，每隔1天更換一次人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，待3-4天后長出肉眼可見的人源性人工誘導多潛能干細胞后，每天更換一次人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，每隔7天傳代一次，待人源性人工誘導多潛能干細胞生長到4mm-6mm，重復步驟( 或經過步驟(；3)破碎成較小的人源性人工誘導多潛能干細胞的細胞團后進行使用；本發明的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其中步驟(1)包括以下步驟將體外人羊膜間充質細胞放置在裝有人羊膜間充質細胞培養基的15cm細胞培養瓶中，待細胞密度達到90%融合以上，去掉培養基，用5ml D-Hanks'平衡鹽溶液洗滌3次，再加入^il 0. 25%的胰蛋白酶放于36. 5-37. 5°C的CO2細胞培養箱內2-3分鐘，在顯微鏡下觀察，待大部分細胞邊緣發亮時，拍打培養瓶，使細胞處于懸浮狀態，加入5ml的含有DMEM/F12和10%胎牛血清的終止液，將其轉移到50ml離心管中，加入30ml D-Hanks'平衡鹽溶液，在室溫下將其放入離心機中以lOOOr/min的轉速離心5分鐘，然后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入30ml人羊膜間充質細胞培養基使細胞重新懸浮，用移液管吹打均勻上述細胞，再將上述細胞平均種植到3個15cm細胞培養瓶中后，放置在36. 5-37. 5°C的(X)2細胞培養箱內，每隔3天換一次羊膜間充質細胞培養基，培養到在15cm的細胞培養瓶中達到80-90%融合；本發明的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其中所述的人羊膜間充質細胞的培養基包括DMEM/F12、5%胎牛血清、2%B27、20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、20ng/ml的表皮生長因子和0. 2g/l的L-谷氨酰胺；本發明的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其中所述的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基包括=Knockout DMEM.20% Knockout血清替代物、2mmol/l的L-谷氨酰胺、1 X 10_4mol/l的非必需氨基酸、4ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、0. 5%的青霉素、0. 5%的鏈霉素和lX10_4mOl/l的2-巰基乙醇。本發明成功地建立起了使用hAMCS作為培養層培養人源性人工誘導多潛能干細胞細胞系Hl的實驗方法，目前已培養超過6個月。其細胞形態表現為邊緣清楚，單層未分化的形態，與培養在MEF上的人源性人工誘導多潛能干細胞形態一致；增殖速度與培養在 MEF上的人源性人工誘導多潛能干細胞比較略快；未分化的標準即干細胞全能性標記蛋白如 0CT3/4，S0X2, NANOG，SSEA-4，TRA-1-81，TRA-1-60 均有表達。


圖1為由本發明得到的人源性人工誘導多潛能干細胞通過免疫熒光檢測0CT3/4、 S0X2、NANOG, SSEA-4、TRA-1-81、TRA-1-60 的表達；圖2為用western blot方法對人源性人工誘導多潛能干細胞維持自我更新和多潛能性的關鍵蛋白的表達進行鑒定，其中圖中的a表示人羊膜間充質細胞；b表示以人羊膜間充質細胞作為培養層培養的人源性人工誘導多潛能干細胞；c表示以MEF作為培養層培養的人源性人工誘導多潛能干細胞；d表示以人羊膜上皮細胞作為培養層培養的人源性人工誘導多潛能干細胞；圖3為分別用本發明人羊膜間充質細胞作培養層(HAMC)、用小鼠胚胎成纖維細胞作為培養層(MEF)和用人羊膜上皮細胞(HAEC)來培養人源性人工誘導多潛能干細胞，人源性人工誘導多潛能干細胞在生長2天和5天時克隆直徑大小比較圖；圖4為用小鼠胚胎成纖維細胞作為培養層(MEF)培養出來的人源性人工誘導多潛能干細胞的形態圖；圖5為用人羊膜間充質細胞作培養層(HAMC)培養出來的人源性人工誘導多潛能干細胞的形態圖。
具體實施例方式本發明的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，它包括以下步驟(1)將體外人羊膜間充質細胞放置在裝有人羊膜間充質細胞培養基的15cm細胞培養瓶中，待細胞密度達到90%融合以上，去掉培養基，用5ml D-Hanks'平衡鹽溶液 (Hanks' balanced salt solution without calcium and magnesium, lnvitrogen 公司生產)洗滌3次，再加入aiil 0.25%的胰蛋白酶(Trypsin，hvitrogen公司生產)放于 36. 5-37. 5°C的(X)2細胞培養箱內2_3分鐘，在顯微鏡下觀察，待大部分細胞邊緣發亮時， 拍打培養瓶，使細胞處于懸浮狀態，加入5ml的含有DMEM/F12 (lnvitrogen公司生產)和 10%胎牛血清(lnvitrogen公司生產)的終止液，將其轉移到50ml離心管中，加入30ml D-Hanks ‘平衡鹽溶液，在室溫下將其放入離心機中以lOOOr/min的轉速離心5分鐘，然
6后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入30ml人羊膜間充質細胞培養基使細胞重新懸浮， 用移液管吹打均勻上述細胞，再將上述細胞平均種植到3個15cm細胞培養瓶中后，放置在 36. 5-37. 5°C的(X)2細胞培養箱內，每隔3天換一次羊膜間充質細胞培養基，培養到在15cm 的細胞培養瓶中達到80-90%融合；(2)去掉步驟(1)中的人羊膜間充質細胞的培養基，加入IOml新鮮人羊膜間充質細胞的培養基，在該培養基中加入100 μ 1濃度為lmg/ml的絲裂霉素C(Sigma-Aldrich公司生產)混勻，然后將其放置于36. 5-37. 5°C的(X)2細胞培養箱中40分鐘，去掉含有絲裂霉素C的培養基，再用IOml D-Hank' s平衡鹽溶液洗滌3次，再加入15ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基備用；(3)將在15cm細胞培養瓶中生長到直徑為4mm-6mm的人源性人工誘導多潛能干細胞去掉多余的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，只在細胞培養瓶保留5ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，加入濃度為10mg/ml的膠原酶IV，使膠原酶IV的最終濃度為 lmg/ml，混勻后置于36. 5-37. 5°C的(X)2細胞培養箱中15分鐘，去掉含膠原酶IV的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，用IOml Knockout DMEM洗滌3次后，再加入IOml人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，用5ml移液管對準克隆的人源性人工誘導多潛能干細胞快速吹打，使其脫落在培養基中，對于貼附緊密的人源性人工誘導多潛能干細胞，可用移液管輕刮人源性人工誘導多潛能干細胞，用機械力使其脫落，待人源性人工誘導多潛能干細胞全部脫落在培養基后，再次吹打使其破碎成較小的人源性人工誘導多潛能干細胞的細胞團， 然后將其轉移到4個預處理過的上述步驟O)的培養瓶中，每瓶放入2. 5ml ；(4)在室溫下，對步驟C3)培養瓶中的細胞進行培養，每隔1天更換一次人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，待3-4天后長出肉眼可見的人源性人工誘導多潛能干細胞后，每天更換一次人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，每隔7天傳代一次，待人源性人工誘導多潛能干細胞生長到4mm-6mm，重復步驟( 或經過步驟(；3)破碎成較小的人源性人工誘導多潛能干細胞的細胞團后進行使用。人羊膜間充質細胞的培養基包括DMEM/F12anvitr0gen公司生產)、5%胎牛血清(Invitrogen公司生產)、2% B27 (Invitrogen公司生產)、20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子Tech公司生產)、20ng/ml的表皮生長因子(P印ro Tech公司生產)和 0. 2g/l的L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich公司生產)。人源性人工誘導多潛能干細胞培養基包括Knockout DMEM(Invitrogen公司生產)、20 % Knockout血清替代物anvitrogen公司生產)、2mmol/l的L-谷氨酰胺 (Sigma-Aldrich公司生產)、1 X 1θΛιο1/1的非必需氨基酸(Invitrogen公司生產)、4ng/ ml的堿性成纖維細胞生長因子(P^ro Tech公司生產)、0. 5%的青霉素Qnvitrogen 公司生產)、0. 5%的鏈霉素(Invitrogen公司生產)和lX10_4mol/l的2-巰基乙醇 (Invitrogen 公司生產)。從圖1和圖2中可以看出人源性人工誘導多潛能干細胞培養在人羊膜間充質細胞上經過20代克隆后，通過免疫熒光(圖1)和western blot方法(圖2~)對人源性人工誘導多潛能干細胞維持自我更新和多潛能性的關鍵蛋白的表達進行鑒定的結果。免疫熒光結果顯示以人羊膜間充質細胞作為培養層細胞培養的人源性人工誘導多潛能干細胞表達 0ct3/4、S0X2、NANOG, SSEA-4、TRA-1-81、TRA-1-60等分子，表明其具有自我更新與分化的多潛能性。Western blot顯示以人羊膜間充質細胞作為培養層培養人源性人工誘導多潛能干細胞，0ct3/4、S0X2和NANGO分子的表達與MEF作為培養層相比較基本相一致。這些結果說明以人羊膜間充質細胞作為培養層細胞來培養人源性人工誘導多潛能干細胞，能使人源性人工誘導多潛能干細胞保持自我更新和多潛能性。圖3表明培養在不同培養層細胞上的人源性人工誘導多潛能干細胞(hES)增殖比較，人源性人工誘導多潛能干細胞傳代時平均分成3份，均勻的培養在鼠胚胎成纖維細胞 (MEF)、人羊膜間充質細胞(HAMC)和人羊膜上皮細胞(HAEC)上，隔天換液，在第2天和5天對細胞克隆拍照，測量細胞克隆的直徑。結果顯示培養在人羊膜間充質細胞上的人源性人工誘導多潛能干細胞克隆直徑最大，培養在鼠胚胎成纖維細胞(MEF)上的克隆直徑僅次于培養在人羊膜間充質細胞上的克隆，而培養在人羊膜上皮細胞(HAEC)上的克隆直徑明顯較小，并且在人羊膜上皮細胞(HAEC)克隆出來的人源性人工誘導多潛能干細胞會一定程度的分化。以下的表1表示用上述三種不同的細胞來培養人源性人工誘導多潛能干細胞， 在2天和5天后，所得到的人源性人工誘導多潛能干細胞的直徑。表1 (單位微米)
權利要求
1.一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，它包括以下步驟(1)用人羊膜間充質細胞的培養基，將體外的人羊膜間充質細胞培養在15cm的細胞培養瓶中達到80-90%融合；其特征在于(2)去掉步驟(1)中的人羊膜間充質細胞的培養基，加入IOml新鮮人羊膜間充質細胞的培養基，在該培養基中加入100 μ 1濃度為lmg/ml的絲裂霉素C混勻，然后將其放置于36. 5-37. 50C的(X)2細胞培養箱中40分鐘，去掉含有絲裂霉素C的培養基，再用IOml D-Hank' s平衡鹽溶液洗滌3次，再加入15ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基備用；(3)將在15cm細胞培養瓶中生長到直徑為4mm-6mm的人源性人工誘導多潛能干細胞去掉多余的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，只在細胞培養瓶保留5ml的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，加入濃度為10mg/ml的膠原酶IV，使膠原酶IV的最終濃度為Img/ ml，混勻后置于36. 5-37. 5°C的(X)2細胞培養箱中15分鐘，去掉含膠原酶IV的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，用IOml Knockout DMEM洗滌3次后，再加入IOml人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，用5ml移液管對準克隆的人源性人工誘導多潛能干細胞快速吹打，使其脫落在培養基中，對于貼附緊密的人源性人工誘導多潛能干細胞，可用移液管輕刮人源性人工誘導多潛能干細胞，用機械力使其脫落，待人源性人工誘導多潛能干細胞全部脫落在培養基后，再次吹打使其破碎成較小的人源性人工誘導多潛能干細胞的細胞團，然后將其轉移到4個預處理過的上述步驟O)的培養瓶中，每瓶放入2.5ml ；(4)在室溫下，對步驟C3)培養瓶中的細胞進行培養，每隔1天更換一次人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，待3-4天后長出肉眼可見的人源性人工誘導多潛能干細胞后，每天更換一次人源性人工誘導多潛能干細胞培養基，每隔7天傳代一次，待人源性人工誘導多潛能干細胞生長到4mm-6mm，重復步驟( 或經過步驟( 破碎成較小的人源性人工誘導多潛能干細胞的細胞團后進行使用。
2.如權利要求1所述的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其特征在于步驟(1)包括以下步驟將體外人羊膜間充質細胞放置在裝有人羊膜間充質細胞培養基的15cm細胞培養瓶中，待細胞密度達到90%融合以上， 去掉培養基，用5ml D-Hanks'平衡鹽溶液洗滌3次，再加入^il 0. 25%的胰蛋白酶放于 36. 5-37. 5°C的CO2細胞培養箱內2_3分鐘，在顯微鏡下觀察，待大部分細胞邊緣發亮時，拍打培養瓶，使細胞處于懸浮狀態，加入5ml的含有DMEM/F12和10 %胎牛血清的終止液，將其轉移到50ml離心管中，加入30ml D-Hanks'平衡鹽溶液，在室溫下將其放入離心機中以 1000r/min的轉速離心5分鐘，然后將上述溶液中的上清液倒掉，再加入30ml人羊膜間充質細胞培養基使細胞重新懸浮，用移液管吹打均勻上述細胞，再將上述細胞平均種植到3個 15cm細胞培養瓶中后，放置在36. 5-37. 5°C的CO2細胞培養箱內，每隔3天換一次羊膜間充質細胞培養基，培養到在15cm的細胞培養瓶中達到80-90%融合。
3.如權利要求1或2所述的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其特征在于所述的人羊膜間充質細胞的培養基包括DMEM/F12、 5%胎牛血清、2% B27、20ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、20ng/ml的表皮生長因子和.0. 2g/l的L-谷氨酰胺。
4.如權利要求3所述的一種用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，其特征在于所述的人源性人工誘導多潛能干細胞培養基包括 KnockoutDMEM,20 % Knockout 血清替代物、2mmol/l 的 L-谷氨酰胺、1 X l(T4mol/l 的非必需氨基酸、4ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子、0.5%的青霉素、0.5%的鏈霉素和 1 X 10_4mol/l的2-巰基乙醇。
全文摘要
本發明涉及用人羊膜間充質細胞作培養層來培養人源性人工誘導多潛能干細胞的方法，它包括用人羊膜間充質細胞的培養基，將體外的人羊膜間充質細胞培養在15cm的細胞培養瓶中達到80-90％融合；再加入人源性人工誘導多潛能干細胞培養基備用；將放在15cm細胞培養瓶中的人源性人工誘導多潛能干細胞吹打使其破碎成較小的干細胞的細胞團，放入人羊膜間充質細胞培養瓶中進行培養，待人胚胎干細胞生長到4mm-6mm，重復將上述干細胞吹打使其破碎成較小干細胞的細胞團放入新的人羊膜間充質細胞培養瓶中繼續進行培養或用于其他目的使用，本發明得到與培養在MEF上的人源性人工誘導多潛能干細胞形態一致；而且用比MEF培養的更加安全。
文檔編號C12N5/074GK102409022SQ20101029041
公開日2012年4月11日 申請日期2010年9月25日 優先權日2010年9月25日
發明者張可華, 李凌松, 蔡哲 申請人:李凌松, 蔡哲