專利名稱：編碼新型的具有d-絲氨酸合成活性的酶的dna、該酶的制備方法、及利用該酶的d-絲氨酸 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及編碼具有由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的活性的新型酶的DNA、將該DNA整合到載體中形成的重組DNA、由該重組DNA轉化得到的轉化體、具有由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的活性的新型酶及利用該酶由甲醛和甘氨酸制備D-絲氨酸的方法。
背景技術：
已知D-絲氨酸作為D-環絲氨酸等醫藥品的合成中間體是十分有用的化合物。目前，作為具有由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的活性的酶，只公開了來自節桿菌(Arthrobacter) sp. DK-19的D-蘇氨酸醛縮酶(以下，簡稱“DTA”)(參見特開昭58-116690號公報)。已有報道指出，使用甲醛及甘氨酸各50mmol，在30°C下利用所述DTA使其進行反應，40小時后D-絲氨酸的生成量為2. 5mmol (相對于甲醛的收率僅為5% )。針對于此，已有報道指出，來自同為節桿菌屬微生物的節桿菌sp. DK-38的DTA，盡管具有對D-蘇氨酸、D- β -羥基苯基絲氨酸、D- β -羥基-α -氨基戊酸等響應的廣泛的底物特異性，但不對D-絲氨酸響應(參見Eur. J. Biochem.，1997，248，ρ385_393)。另外,有報道指出，通過使用來自黃單胞菌屬(Xanthomonas)的DTA,能夠由甘氨酸和醛類化合物制備D-β -羥基氨基酸類，但尚無使用來自黃單胞菌屬的DTA由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的報道(參見特開平5-168484號公報)。

發明內容
鑒于上述背景技術，本發明的目的在于，提供編碼具有由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的活性的新型酶的DNA、將該DNA整合到載體中形成的重組DNA、由該重組DNA轉化得到的轉化體、具有由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的活性的新型酶、及利用該酶由甲醛和甘氨酸制備D-絲氨酸的方法。本發明人等認為在具有與公知的DTA類似的結構的未知酶中，可能存在具有由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的能力的酶，因此對與公知的DTA的氨基酸序列相關的信息進行了研究。其結果發現了與來自黃單胞菌屬(GenBank登錄號Ε05055)、無色桿菌(Achromobacter)屬(GenBank 登錄號 ΑΒ026892)、及節桿菌屬(GenBank 登錄號 ABO10956)的DTA的氨基酸序列相關的信息。比較上述氨基酸序列進行研究，結果發現，DTA的N末端區域及C末端區域的氨基酸序列具有高度的同源性。本發明人等以上述氨基酸序列中的N末端區域及C末端區域為基礎設計引物，嘗試使用此引物通過PCR擴增各種微生物的染色體DNA時，成功地擴增了來自無色桿菌屬微生物、編碼具有由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的活性的酶的DNA。 與該DNA相當的氨基酸序列和公知的來自無色桿菌屬的DTA的氨基酸序列的同源性約為50%左右，是與公知的來自無色桿菌屬的DTA的氨基酸序列有很大差異的序列。另一方面，與公知的來自黃單胞菌屬的DTA的氨基酸序列的同源性約為90%。之后本發明人等嘗試使用由將上述新型DNA整合到載體中形成的重組DNA轉化得到的重組大腸桿菌(Escherichia coli)使甲醒和甘氨酸反應合成D-絲氨酸時,令人1驚奇地發現，與現有公知的DTA不同，能夠利用IOOmM甘氨酸和甲醛以反應收率在70%以上的高收率合成D-絲氨酸。此外，還確認了如果使用此重組大腸桿菌進行D-絲氨酸累積反應，會生成微量的L-絲氨酸。
D-絲氨酸用于醫藥中間體等要求高純度的領域時，不希望在D-絲氨酸中混入L-絲氨酸。由于DL-絲氨酸的溶解度比D-絲氨酸的溶解度低，因此在制備D-絲氨酸時副生的L-絲氨酸會大幅度地降低D-絲氨酸的精制收率。為了解決此問題，本發明人等進行了更加深入的研究，結果發現，通過在2價金屬離子存在的條件下實施有機溶劑處理及/或加熱處理能夠抑制L-絲氨酸的副生。另外，發現即使不進行上述處理，通過將反應中的甲醛濃度維持在150mM以上，也能夠抑制L-絲氨酸的副生。并且發現，通過使用L-絲氨酸合成酶基因缺失的微生物作為生產用于D-絲氨酸合成的DSA的宿主，也能夠抑制L-絲氨酸的副生。基于上述發現完成了本發明。即，本發明內容如下(I) 一種編碼下述(a)或(b)的蛋白質的DNA，(a)蛋白質，含有序列號4、6、8中任一序列號記載的氨基酸序列，(b)蛋白質，所述蛋白質含有在(a)氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的酶活性。(2)下述(a)或(b)的 DNA，(a)DNA,由序列表中序列號3、5、7中任一序列號記載的堿基序列或其互補序列構成，(b) DNA,所述DNA與含有下述DNA序列的DNA片段在嚴格的條件下雜交，所述DNA序列為在序列表中序列號3、5、7中任一序列號記載的堿基序列或其互補序列中的至少20個連續堿基的序列，并且所述DNA編碼具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶。(3) 一種將上述(I)或⑵所述的DNA整合到載體中形成的重組DNA。(4) 一種使用上述(3)所述的重組DNA轉化宿主細胞得到的轉化體。(5)如上述⑷所述的轉化體，其中，被轉化的宿主細胞為微生物。(6)如上述(5)所述的轉化體，其中，被轉化的微生物為D-絲氨酸脫氨酶缺失的微生物。(7)下述(a)或(b)的蛋白質，(a)蛋白質，含有序列號4、6、8中任一序列號記載的氨基酸序列，(b)蛋白質，所述蛋白質含有在(a)氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的酶活性。
(8) 一種制備具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶的方法，其特征在于，培養上述(4) (6)中任一項所述的轉化體，從所得的培養物中獲取具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的酶活性的蛋白質。(9) 一種D-絲氨酸的制備方法，其中，包含在上述(4) (6)中任一項所述的轉化體或其處理物的存在下使甘氨酸和甲醛反應。(10) 一種D-絲氨酸的制備方法，其中，包含在上述(7)所述的蛋白質的存在下使甘氨酸和甲醛反應。(11) 一種D-絲氨酸的制備方法，所述制備方法在具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的微生物或其處理物的存在下使甘氨酸和甲醛反應合成D-絲氨酸，其中，采用下述Q) Qv)中一種以上的方法，將在所述反應的反應液中副生的L-絲氨酸抑制在相對于D-絲氨酸為I. 5摩爾％以下，
(i)對具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的微生物進行有機溶劑處理及/或加熱處理的方法；(ii)將反應液中的甲醛濃度，在a)通過所述(i)的方法進行有機溶劑處理及/或加熱處理時，控制在2M以下；在b)未進行有機溶劑處理及/或加熱處理時，控制在150mM以上2M以下的方法；(iii)使用含有具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶、且L-絲氨酸合成酶基因缺失的微生物作為催化劑的方法；(iv)向反應液中添加含有具有L-絲氨酸脫氨酶活性的酶的微生物的方法。(12)如上述(11)所述的制備方法，其中，所述有機溶劑為選自甲醛、苯甲醛、二氯乙烷及異丙醇中的一種以上的有機溶劑。(13)如上述(11)或(12)所述的制備方法，其中，所述有機溶劑處理及/或加熱處理在2價金屬離子存在下進行。(14)如上述(13)所述的制備方法，其中，2價金屬為選自鎂、錳、鋅、鎳、鈷及鐵中的一種以上的金屬。(15)如上述(11)所述的制備方法，其中，具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的微生物為上述(5)或(6)所述的轉化體。I、編碼具有由甲醛和甘氨酸合成D-絲氨酸的活性的新型酶的DNA的基因的獲取含有序列表的序列號4、6、8中任一序列號記載的氨基酸序列、并且編碼具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶(以下，將具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶簡稱“DSA” )的DNA可以通過下述方法獲得，即，從細菌中萃取染色體DNA，使用具有序列表的序列號I及2所不的喊基序列的引物，通過進行PCR而獲得,所述細菌為例如可從 12301Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.的美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)取得的木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans) (ATCC9220)、可從獨立行政法人產品評價技術基礎機構(NationalInstitute of Technology and Evaluation)的生物遺傳資源部門(NITE BiologicalResource Center)(日本千葉縣木更津市上線鐮足2_5_8)取得的木糖氧化無色桿菌(NBRC13495)和反硝化無色桿菌(Achromobacter denitrificans)(等同于木糖氧化產堿桿菌反硝化亞種(Achromobacter xylosoXidans subsp. denitrificans)) (NBRC15125)。
進行PCR時，改良擴增時的條件使若干具有錯配堿基的基因也擴增是有效的。可以通過下述方法使難于擴增的基因擴增，例如，將退火溫度抑制至低溫的方法、向PCR反應液中加入5%左右的二甲基亞砜的方法、或使用PCR試劑盒(例如GC-RICH PCRSystem (Roche社制))使富含GC的基因易于擴增的方法，還有將上述方法組合使用的方法
坐寸ο作為編碼DSA的DNA的具體例，來自木糖氧化無色桿菌(ATCC9220)的DTA基因的DNA堿基序列示于序列號3，由該堿基序列翻譯得到的氨基酸序列示于序列號4。來自木糖氧化無色桿菌(NBRC13495)的DTA基因的DNA堿基序列示于序列號5，通過該堿基序列翻譯得到的氨基酸序列示于序列號6。來自反硝化無色桿菌(NBRC15125)的DTA基因的DNA堿基序列示于序列號7，通過該堿基序列翻譯得到的氨基酸序列示于序列號8。作為編碼DSA的DNA，除上述之外，只要是與DNA片段在嚴格條件下雜交的、并且可編碼具有DSA活性的蛋白質的DNA即可，可以來自任何生物，其中所述DNA片段含有序列 表中序列號3、5、7中任一序列號記載的堿基序列或其互補序列中的至少20個連續堿基的DNA序列。例如，即使是在該生物中沒有功能的沉默DNA，只要其能夠通過將分離的DNA連接到適當的表達載體上產生DSA則也可以使用。并且，對生物也無特殊限定，通過將土壤等直接作為模板DNA用于PCR，也能得到編碼DSA的DNA，其中PCR使用具有序列表中序列號I及2的堿基序列的引物。作為編碼DSA的DNA的具體獲取方法，例如可以舉出，將在含有D-絲氨酸的培養基中生長的微生物染色體DNA作為模板，使用具有序列表中序列號I及2記載的堿基序列的引物進行PCR，擴增得到DNA。另外，可以通過在序列表的序列號3、5、7中任一序列號記載的堿基序列或互補序列可于嚴格的條件下進行雜交的范圍內、并且不影響被編碼的酶的活性的范圍內，使用位點特異性誘變法(Nucleic Acid Res. , 10, pp. 6487 (1982) ；Nucleic Acid Res.,13, pp.4431 (1985) ； Methods in EnzymoI.，100, pp.448 (1983) ；Molecular Cloning2ndEdt. , Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989) ；PCR A Practical ApproachIRL Press pp. 200 (1991) ；Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & ；Sons(1987-1997) ；Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, pp. 6409(1982) ；Gene,34 315 (1985)；Proc. Natl. Acad. Sci. , USA, 82, pp. 488 (1985))等,適當地導入缺失、取代、插入、及/或添加變異，得到含有在序列號4、6、8中任一序列號記載的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或數個氨基酸的氨基酸序列、并且可以編碼具有DSA活性的蛋白質的DNA。本說明書中的氨基酸的缺失、取代、插入或添加可以通過上述作為本申請提交前的公知技術的位點特異性誘變法進行，另外，I個或多個氨基酸是指能夠通過位點特異性誘變法缺失、取代、插入或添加的氨基酸的數量，例如I 5個氨基酸，優選I 3個氨基酸。所謂用于雜交的條件，可以舉出本領域技術人員為了檢出特定的雜交信號而經常使用的條件。優選指嚴格的雜交條件和嚴格的洗滌條件。具體而言，例如可以舉出，在含有6 X SSC (I X SSC 的組成0. 15MNaCl、0. 015M 檸檬酸鈉、ρΗ7· 0) ,0. 5% SDS, 5 X Denhardt 及100mg/ml鯡魚精子DNA的溶液中，與探針一同在55°C下保溫一晚的條件等。接下來可以列舉在0. 2XSSC中、42°C下洗滌過濾器等。作為嚴格的條件，可以舉出過濾器的洗滌工序在
0.1父35(、501下進行的條件，作為更加嚴格的條件可以舉出該工序在0. 1XSSC、65°C下進行的條件。本說明書中使用的“含有在序列號3、5、7中任一序列號記載的堿基序列或其互補序列中的至少20個連續堿基的DNA序列的DNA片段”，是指選擇下述序列中的一個或多個得到的DNA片段，該序列是在序列表中序列號3、5、7中任一序列號記載的堿基序列或其互補序列中的任意的連續至少20個堿基，優選至少30個堿基、例如40、60或100個堿基的序列。2、具有該蛋白質基因的重組DNA的制備通過將編碼上述DSA的DNA整合到載體中可以得到重組DNA。作為克隆時的載體，可以使用由能夠在宿主微生物內自主增殖的噬菌體或質粒構建的用于基因重組的載體。作為噬菌體，例如在大腸桿菌作為宿主微生物時，可以舉出XgtlO、Xgtll等。另外，作為質粒，例如在大腸桿菌作為宿主微生物時，可以舉出 pBTrp2、pBTacl、pBTac2 (都為 Boehringer Mannheim 社制)、pKK233-2 (Pharmacia 社制)、pSE280 (Invitrogen 社制)、pGEME X-I (Promega 社制)、pQE-8 (QIAGEN 社制)、pQE-30 (QIAGEN 社制)、pBluescript IISK+、pBluescript II SK (-) (Stratagene 社制)、pET-3 (Novagen社制)、pUC18 (寶酒造社制)、pSTV28 (寶酒造社制)、pSTV29 (寶酒造社制)、pUC118 (寶酒造社制)等。作為啟動子，只要是能夠在宿主細胞中表達的啟動子即可。例如可以舉出trp啟動子(Ptap)、lac啟動子(Pla。)、啟動子、Ph啟動子、Pse啟動子等來自大腸桿菌或噬菌體等的啟動子。另外，也可以使用tac啟動子、lacT7啟動子之類人工設計改變的啟動子等。并且，為了使其在桿菌屬細菌中表達，還可以使用Np啟動子(特公平8-24586號公報)等。作為核糖體結合序列，只要是能夠在宿主細胞中表達的序列即可，可以為任意序列，但優選使用將SD(Shine-Dalgarno)序列和起始密碼子的間隔調整為適當距離(例如6 18個堿基)的質粒。為了高效地進行轉錄 翻譯，也可以使下述蛋白質表達，該蛋白質使具有該蛋白質活性的蛋白質N末端或其部分缺失的蛋白質與表達載體編碼的蛋白質N末端部分融合。在目標蛋白質的表達中，轉錄終止序列并非必須，但優選在緊靠結構基因的下游配置轉錄終止序列。在克隆時，通過用于剪切編碼上述DSA的DNA的限制酶剪切上述載體，可以得到載體片段，但不必一定使用與用于剪切該DNA的限制酶相同的限制酶。使該DNA片段與載體DNA片段結合的方法可以是使用公知的DNA連接酶的方法，例如，該DNA片段的黏性末端與載體片段的黏性末端退火后，通過使用適當的DNA連接酶，制備該DNA片段和載體DNA片段的重組載體。根據需要，也可以在退火后導入微生物等宿主中，利用生物體內的DNA連接酶制備重組載體。3、通過將編碼DSA的DNA整合到載體中而得到的重組DNA制備轉化體通過將上述重組DNA導入宿主細胞中，可得到被上述重組DNA轉化的轉化體。作為宿主細胞，只要是重組載體穩定、能夠自主增殖并且可使外源基因表型表達的細胞即可，沒有特殊的限制。作為宿主細胞，可以舉出微生物、例如細菌，作為上述細菌可以舉出大腸桿菌DH5ci ,XL-IBlue等大腸桿菌。另外，也可以使用其它的酵母等微生物或昆蟲細胞作為宿主細胞。
作為將重組DNA導入微生物的方法，例如在微生物為大腸桿菌時,可以使用由鈣處理的感受態細胞法或電穿孔法等。作為宿主細胞，為了抑制生成物D-絲氨酸的分解，可以使用D-絲氨酸脫氨酶活性低的微生物或D-絲氨酸脫氨酶活性缺失的微生物。作為D-絲氨酸脫氨酶活性缺失的微生物的具體例，例如可以舉出實施例6中所述的重組了 D-絲氨酸脫氨酶基因所得的大腸桿菌
坐寸ο另外，為了抑制在D-絲氨酸合成反應中L-絲氨酸生成，也可以通過使用L-絲氨酸脫氨酶活性高的微生物分解生成的L-絲氨酸。作為L-絲氨酸脫氨酶活性高的微生物，也可以使用實施例15中所述的重組了 L-絲氨酸脫氨酶基因所得的大腸桿菌等。作為微生物，由于使用丙氨酸消旋酶、絲氨酸羥甲基轉移酶、L-蘇氨酸醛縮酶等與 L-絲氨酸合成相關的酶的活性低的微生物或缺失上述酶活性的微生物時，不生成L-絲氨酸，因此優選。更優選使用完全缺失上述酶的微生物作為宿主細胞。4、DSA 的生成培養上述轉化體，之后通過收集所得的DSA，能夠制備DSA。轉化體的培養可以根據在宿主細胞培養中通常使用的方法進行。轉化體為大腸桿菌等原核微生物、酵母菌等真核微生物時，培養上述微生物的培養基，只要是含有該微生物能夠同化的碳源、氮源、無機鹽類等、可以高效地培養轉化體的培養基即可，可以為天然培養基、合成培養基中的任一種。作為碳源，只要是轉化體能夠同化的物質即可，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、含有上述物質的糖蜜、淀粉或淀粉水解物等碳水化合物、乙酸、丙酸等有機酸、乙醇、丙醇等醇類。作為氮源，可以舉出氨、氯化銨、硫酸銨、醋酸銨、磷酸銨等各種無機酸或有機酸的銨鹽、其它含氮化合物、及蛋白胨、肉萃取物、酵母提取物、谷物浸提液、酪蛋白水解物，大豆餅、大豆餅水解物、各種發酵菌及其消化物等。作為無機鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。在振蕩培養或深部通氣攪拌培養等需氧的條件下進行培養。培養溫度可以為15 50°C，培養時間通常為16小時 5天。培養中pH保持在3.0 9.0。使用無機酸或有機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等對PH進行調整。另外，培養中也可以根據需要向培養基中加入氨芐青霉素或四環素等抗生素。培養由使用誘導性啟動子作為啟動子的表達載體進行轉化得到的微生物時，可以根據需要向培養基中加入誘導物。例如，在培養由使用Iac啟動子的表達載體進行轉化所得的微生物時，可以向培養基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)等，在培養由使用trp啟動子的表達載體進行轉化所得的微生物時，可以向培養基中加入吲哚乙酸(IAA)等。可以采用離心、過濾等手段對含有轉化體的培養液進行分離回收轉化體。轉化體處理物可以以下列形式得到，S卩，為了破壞細胞對轉化體進行機械破壞、超聲波處理、凍結融解處理、干燥處理、加壓或減壓處理、滲透壓處理、自身消化、表面活性劑處理、酶處理而得到的物質、及含有通過上述處理所得的DSA的部分的固定化物、轉化體的固定化物。需要說明的是，本發明中微生物的處理物也指進行與上述轉化體處理物相同處理所得的物質。為了從上述轉化體或轉化體處理物中精制DSA，可以通過組合使用下述方法得到精制酶，即，破碎轉化體細胞使細胞破碎液通過離子交換樹脂或凝膠過濾等色譜進行分餾或通過硫酸銨等進行鹽析等。5、D_絲氨酸的制備方法
在存在上述轉化體或其轉化體處理物的條件下，通過使甘氨酸和甲醛反應能夠制
備D-絲氨酸。D-絲氨酸的制備，優選在pH6. O 9. O、溫度20 60°C、振蕩或攪拌的條件下進行。轉化體或其轉化體處理物的使用量，只要能夠使甲醛和甘氨酸的反應充分進行即可，則沒有特殊的限制，通常添加相對于Ig甘氨酸可以產生至少IOunit、優選50unit以上DSA活性的量。轉化體或其轉化體處理物的添加方法可以在反應開始時一次性添加，也可以在反應過程中分批或連續加入。DSA活性將能夠在I分鐘內合成I μ mo I D-絲氨酸的能力定義為lunit。DSA活性的計算方法如下，在含有IOOmM甘氨酸、O. ImM磷酸吡哆醛、IOmM氯化鎂、5mM甲醛的pH8. O的200mM Tris-HCl (三羥甲基氨基甲烷鹽酸)緩沖液中加入酶液，在30°C下保溫，測定D-絲氨酸的生成量進行計算。反應液中甘氨酸的濃度在IOOmM以上，優選在IM以上5M以下。對于甘氨酸的添加方法，可以在反應開始時一次性添加，也可以伴隨反應的進行分批或連續加入。對于甲醛，可以向反應液中供給其氣體，也可以制成水溶液或醇溶液供給。另外，也可以使用多聚甲醛作為甲醛的供給源，優選使用37%左右的甲醛水溶液。作為甲醛的添加方法，可以采用一次性添加或伴隨反應進行分批或連續地添加的方法，優選將反應液中的甲醛濃度控制在不阻礙DSA活性的濃度。所謂不阻礙DSA活性的濃度，通常在5M以下，優選在2M以下，更優選在500mM以下，特別優選在300mM以下。作為控制反應液中甲醛濃度的方法，可以采用下述方法，SP⑴以一定的速度向反應液中添加的方法；(2)定量甲醛濃度，使其為酶活性不失活的濃度后分批添加的方法；
(3)添加多聚甲醛，通過向反應體系中加入高于多聚甲醛游離成甲醛的速度的酶量，實質地避免由甲醛造成的阻礙的方法；(4)伴隨著反應的進行，反應液中生成物D-絲氨酸累積，原料甘氨酸減少。由于D-絲氨酸和甘氨酸的等電點分別為5. 68和5. 97，因此伴隨反應的進行引起反應液PH降低。也可以采用下述方法添加甲醛，即，向反應液中添加多于糾正反應液PH降低的量的堿，添加能夠糾正上述pH上升部分的量的甲醛的方法。如果甲醛的添加速度在預先設定了反應液中DSA量的堿添加速度、S卩D-絲氨酸的合成速度以上，則即使不采用測定甲醛濃度等繁瑣的操作也能控制反應液中甲醛的濃度。作為向反應液中添加的堿，可以為氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀等堿金屬氫氧化物、以及氫氧化銨、氫氧化鈣、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、焦磷酸鉀、氨等溶解于水中使液體呈堿性的物質。
作為反應液的介質，可以使用水或水性介質、有機溶劑、或、水或水性介質和有機溶劑的混合液。作為水性介質，例如可以使用磷酸緩沖液、HEPES (N-2-羥基乙基哌嗪-N-乙磺酸)緩沖液、Tris[三(羥基甲基)氨基甲烷]鹽酸緩沖液等緩沖液。作為有機溶劑，只要為不阻礙反應的溶劑即可，例如丙酮、乙酸乙酯、二甲基亞砜、二甲苯、甲醇、乙醇、丁醇
坐寸ο在上述反應中，通過添加具有2價金屬離子的化合物、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、亞硫酸氫鈉等還原劑或作為輔酶的磷酸吡哆醛、銨鹽等，可以提高反應收率。作為具有2價金屬離子的化合物，例如可以舉出氯化鎂、氯化錳、乙酸鈷、硫酸亞鐵、氯化鈣等。作為上述化合物在反應液中的濃度，通常為O. ImM至IOOmM,優選O. ImM至10mM。
6、提高反應液中的D-絲氨酸的光學純度的方法通過在加熱處理上述轉化體或其轉化體處理物所得的處理物存在下，或在用有機溶劑處理上述轉化體或其轉化體處理物所得的處理物存在下，使甘氨酸和甲醛反應，可以抑制副反應生成L-絲氨酸。作為加熱處理條件，只要是加熱不使DSA活性大幅度降低、而使生成L-絲氨酸的活性減低或消失的條件即可，可以為任何條件。作為具體的例子，例如可以舉出PH6.0 9. O、溫度40°C 70°C、攪拌10分鐘至6小時的方法。另外，也可以組合有機溶劑處理和加熱處理。作為有機溶劑處理的條件，只要是不使DSA活性大幅度降低、而使生成L-絲氨酸的活性減低或消失的條件即可，則可以為任何條件。作為有機溶劑處理的條件，有機溶劑的濃度通常在20mM以上2M以下，優選在20mM以上IM以下，更優選在50mM IOOOmM,特別優選在50mM 300mM左右。有機溶劑只要是不使DSA活性大幅度降低的物質即可，沒有特殊的限制，優選使用甲醛、乙醛、苯甲醛等醛類、甲醇、乙醇、異丙醇等醇類、丙酮等酮類、二氯乙烷等鹵代烴類等有機溶劑。其中，由于甲醛是酶反應的底物，所以最優選。由于添加D-絲氨酸后通過該酶反應生成甲醛，所以也可以采用代替甲醛添加D-絲氨酸的方法。作為D-絲氨酸的添加濃度優選為IOOmM至5M左右。有機溶劑處理的溫度在10°C 50°C的范圍內，pH優選在6. O 9. O范圍內。有機溶劑處理中優選進行攪拌，使處理液的pH和有機溶劑濃度均勻。另外，也可以在D-絲氨酸制備反應開始時，通過提高甲醛濃度，使L-絲氨酸的生成活性減低或失活。此時，保持反應中的甲醛濃度約為O. 1%至5%，保持約30分鐘至3小時，之后進行通常反應即可。在進行上述處理時，通過添加具有2價金屬離子的化合物、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、亞硫酸氫鈉等還原劑或作為輔酶的磷酸吡哆醛、銨鹽等，進一步使酶活性穩定。作為具有2價金屬離子的化合物，例如可以舉出氯化鎂、氯化錳、乙酸鈷、硫酸亞鐵、氯化鈣等。作為上述化合物在處理液中的濃度，通常為O. ImM至IOOmM,優選O. ImM至10mM。也可以向D-絲氨酸合成反應結束后的反應液中加入L-絲氨酸脫氨酶生成菌，使生成的L-絲氨酸分解，提高最終制品D-絲氨酸的光學純度。作為L-絲氨酸脫氨酶生成菌，優選使用D-絲氨酸脫氨酶缺失的微生物。
7、D-絲氨酸的獲取方法從反應液中收集D-絲氨酸，可以通過在有機合成化學中常用的方法，例如，用有機溶劑萃取、結晶化、薄層色譜、高效液相色譜等進行。本發明與使用公知DTA的D-絲氨酸制備方法相比，可以由甘氨酸和甲醛以良好的收率制備D-絲氨酸。


圖I表示通過SDS-聚丙烯酰胺電泳分析由轉化體得到的破碎液的結果。圖2是精制DSA的SDS-聚丙烯酰胺電泳照片。本說明書中包含作為本申請優先權基礎的日本專利2004-298344說明書及/或附 圖中記載的內容。
具體實施例方式以下，給出本發明的實施例，但本發明并不限定于這些實施例。需要說明的是，D-絲氨酸、L-絲氨酸及甘氨酸通過高效液相色譜法進行定量。上述物質的分析條件及酶(DSA及DTA)活性的測定方法如下所示。(I)D-絲氨酸及L-絲氨酸的分析條件色譜柱TSK-GELΕΝΑΝΤΙΟ L14. 6 X 250 (東曹株式會社)柱溫45°C泵流速0.8ml/min檢測UV254nm;洗脫液0. 25mM 硫酸銅甲醇=9 I (V/V)(2)絲氨酸及甘氨酸的分析條件色譜柱Shodex RSpak NN-8148 X 250 (昭和電工株式會社)柱溫40°C洗脫液IOmM磷酸鉀(ρΗ3· O)泵流速0.8ml/min檢測時采用了使用鄰苯二甲醒(OPA)的柱后衍生化法(post-columnderivatization method)[J. Chromatogr. ,83,353-355(1973)]。(3)酶活性的測定方法將超聲波破碎菌體懸濁液所得的酶液適當地稀釋，將0. ImL稀釋液加入到0. 9mL含有IOOmM甘氨酸、0. ImM磷酸吡哆醛、IOmM氯化鎂、5mM甲醛的pH8. O的200mM Tris-HCl緩沖液中，在30°C下反應15分鐘。用HPLC分析生成的D-絲氨酸，測定其活性。活性單位將在I分鐘內生成I μ mo ID-絲氨酸的活性設為lunit。[實施例I](編碼DSA的基因的獲得)在50ml LB培養基中接種木糖氧化無色桿菌(ATCC9220)、反硝化無色桿菌(NBRC15125)和木糖氧化無色桿菌(NBRC13495)。在30°C下培養一夜后，集菌，用含有Img/ml溶菌酶的溶菌液溶菌。用苯酚處理溶菌液后，采用常用方法通過乙醇沉淀使DNA沉淀。將生成的DNA的沉淀纏繞在玻璃棒上回收后，洗滌，用于PCR。PCR用引物使用寡核苷酸(委托北海道System · Science株式會社進行合成)，該寡核苷酸具有以公知的DTA基因為基礎設計的序列號I及2所示的堿基序列。上述引物在5'末端附近及3'末端附近分別具有KpnI及HindIII的限制酶識別序列。使用O. 025ml含有6ng/ μ I上述微生物的染色體DNA及引物各3 μ M的PCR反應液，在下述條件下進行PCR，所述條件為，變性96°C、1分鐘，退火55°C、30秒，延伸反應68°C、1分15秒，并進行35個由上述步驟組成的反應循環。用KpnI及HindIII消化PCR反應產物及質粒pUC 18 (寶酒造(株))，使用Ligation High (東洋紡(株))連接后,使用所得的重組質粒,轉化大腸桿菌DH5 α。在含有50 μ g/ml氨芐青霉素(Am)及X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷)的LB瓊脂培養基中培養轉化株，得到耐Am且成為白色集落的轉化株。從上述得到的轉化株中萃取質粒。根據通常的堿基序列確定法確認了導入質粒中的DNA片段的堿基序列。 根據所得的編碼DSA的DNA預計的氨基酸序列的分子量都約為40kDa。將所得的具有來自木糖氧化無色桿菌(ATCC9220)的編碼DSA的DNA的質粒命名為 pAcDTAl。將具有來自木糖氧化無色桿菌(NBRC13495)的編碼DSA的DNA的質粒命名為pAcDTA2。將具有來自反硝化無色桿菌(NBRC15125)的編碼DSA的DNA的質粒命名為pAcDTA30(轉化體的制備)使用pAcDTAl、pAcDTA2、pAcDTA3,按照常用的方法轉化大腸桿菌DH5 α，得到的轉化體命名為 ΜΤ-11015、ΜΤ-11016、ΜΤ-11017。將各重組微生物接種在帶有隔板的500mL三角瓶內的IOOmL含有50 μ g/ml Am的LB培養基中，在30°C下培養，直到0D660為O. 6，添加IPTG (異丙基-β -硫代半乳糖吡喃糖苷)使其為ImM，再振蕩培養16小時。將培養液以13000rpm離心10分鐘，使得到的菌體懸濁于IOOmM含有5mL的ImM氯化鎂的Tris-HCl緩沖液(pH8. O)中，于_20°C下凍結保存。[實施例2](DSA的制備方法)使用Bioruptor (OLYMPUS社制)在冰水中破碎O. 5mL實施例I制備的轉化體懸濁液5分鐘。將轉化體的破碎液離心，配制破碎液。通過SDS-聚丙烯酰胺電泳分析破碎液，結果如圖I所示。向沉淀物中加入O. 5mL的IOOmM Tris-HCl緩沖液(pH8. O)，對細胞殘渣進行同樣的分析。在所有轉化體的可溶性部分中都可見在約40kDa位置表達的蛋白質，在不溶性部分中未觀察到。其分子量與根據各基因推測得到的氨基酸序列的分子量幾乎一致。[實施例3](DSA的精制和通過精制DSA進行的D-絲氨酸合成)將IOmL按照與實施例2相同的方法制備的MT-11015的破碎液以IOOOOrpm離心20分鐘,配制除去細胞殘洛的酶液。使陰離子交換樹脂(HiTrap Q-XL、Amersham社制)吸附酶液，并以線性梯度將其從IOOmM含有IOmM氯化鎂及50mM氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(pH8. 0)洗脫至IOOmM含有IOmM氯化鎂及500mM氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(pH8. O)中。使疏水色譜樹脂(HiTrap Phenyl FF、Amersham社制)吸附活性部分，并以線性梯度將其從IOOmM用硫酸銨飽和的含有IOmM氯化鎂的Tris-HCl緩沖液(pH8. O)洗脫至IOOmM含有IOmM氯化鎂的Tris-HCl緩沖液(pH8. O)中。需要說明的是，上述操作在約10°C下進行。用SDS-聚丙烯酰胺電泳對超聲波破碎液、通過離子交換色譜法處理后的活性部分及通過疏水色譜法處理后的活性部分進行分析，結果如圖2所示。精制DSA的單體分子量為 40000 ±5000。在由IOOmM 甲醛、IOOmM 甘氨酸、O. ImM PLP、IOmM 氯化鎂、200mM Tris-HCl 緩沖液(pH8. O) IOOmL組成的底物溶液中加入150unit精制DSA酶液，在30°C下使其反應20小時。
D-絲氨酸的反應收率為95%。
[實施例4](D-絲氨酸合成能力和D-蘇氨酸合成能力的比較)在由作為醛供給源的IOOmM甲醛或乙醛、IOOmM甘氨酸、O. ImMPLP、IOmM氯化鎂、200mM Tris-HCl緩沖液(pH8. O) IOOmL組成的底物溶液中加入150unit實施例I制備的MT-11015株的超聲波破碎酶液，在30°C下使其反應20小時。使用甲醒作為醒供給源時,收率為90%,使用乙醒作為醒供給源時收率為10%。[實施例5](甲醛濃度為IOOmM時的D-絲氨酸合成反應)向底物溶液中，加入150unit實施例I制備的重組微生物的超聲波破碎酶液，在30°C下使其反應20小時，結果如表I所示，其中該底物溶液由IOOmL的pH8. O的200mMTris-HCl緩沖液(pH8. O)構成，所述Tris-HCl緩沖液含有IOOmM甲醛、IOOmM甘氨酸、O. ImMPLPUOmM氯化鎂。表I
宿主__質粒反應收率
PAcDTAl — 90%
DH5a pAcDTA280%
_ pAcDTA372%[實施例6](D-絲氨酸脫氨酶缺失的大腸桿菌的制備)已公知大腸桿菌的基因組DNA的全部堿基序列(GenBank登錄號U00096)，也有報道指出了大腸桿菌的D-絲氨酸脫氨酶的氨基酸序列和基因(以下，有時簡稱dsdA)的堿基序列(GenBank登錄號JO1603)。使用寡核苷酸，將大腸桿菌W3110株(ATCC27325)的基因組DNA作為模板，進行PCR，所用寡核苷酸以大腸桿菌W3110株的基因組DNA的dsdA附近區域的基因信息為基礎而制備得到，具有序列號9及10、序列號11及12所示的堿基序列。所得的DNA片段分別用限制酶PstI和Xbal、XbaI和KpnI進行消化，分別得到約900bp、800bp的片段。將此DNA片段與用PstI、KpnI消化溫度敏感克隆載體pTH18cs I (GenBank登錄號 AB019610) (Hashimoto-Gotoh, T.，Gene，241，185-191 (2000)〕得到的片段混合，使用連接酶結合后，在30°C下轉化至DH5a株中，在含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板中培育，得到轉化體。將所得菌落在含有10 μ g/ml氯霉素的LB液體培養基中在30°C下培養一晚，從所得的菌體中回收質粒。用XbaI消化回收得到的質粒，用T4DNA聚合酶進行平滑末端處理后，與來自pUC4K質粒(Pharmacia)的耐卡那霉素基因連接。將上述得到的質粒在30°C下轉化至大腸桿菌W3110株(ATCC27325)中，在含有10 μ g/ml氯霉素和50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂板中于30°C下培養一晚，得到轉化體。將所得的轉化體接種到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養基中，于30°C下培養一晚。然后，為了得到上述轉化體的培養菌體將其涂覆在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂板上，于42°C下培育得到菌落。將所得的菌落在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB液體培養基中于30°C下培養一晚，再涂覆到含有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂板上，于42°C下培育得到菌落。從出現的菌落中隨機挑取100個菌落，使其分別生長在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂板上和含有10 μ g/ml氯霉素的LB瓊脂板上,選擇只生長在含有卡那霉素的LB瓊脂板上的氯霉素敏感性克隆體。再由上述目標克隆染色體DNA通過PCR使dsdA附近區域的約3. Okb片段擴增，選擇dsdA被取代成耐卡那霉素基因的菌株，將所得菌株命名為W3110dsdA 缺失株(以下簡稱為△ dsdA)。使用實施例I制備的質粒進行轉化，與上述相同地制備凍結保存的菌體，進行同樣的反應時，D-絲氨酸幾乎不分解。[實施例7](使用轉化體MT-11016制備絲氨酸未添加Mg進行制備)向7. 5g甘氨酸和9. 4g的O. 026重量％磷酸吡哆醛中加入53. Ig蒸餾水，用氫氧化鈉調整pH為8. O。加入實施例I中得到的MT-11016菌體懸濁液(活性相當于1500unit)。在反應溫度為30°C的條件下，加入20重量％甲醛20. 8g，通過AHMT法(衛生化學(1976)、Vol. 22、p39)定量反應液中甲醛的濃度，使其從50mM升至300mM。用氫氧化鈉將反應液pH調整為PH8.0。72小時后的反應收率為85%。[實施例8](使用轉化體MT-11017制備D-絲氨酸未添加Mg進行制備)向7. 5g甘氨酸和9. 4g的O. 026重量％磷酸吡哆醛中加入53. Ig蒸餾水，用氫氧化鈉調整pH為8. O。加入實施例I中得到的MT-11017菌體懸濁液(活性相當于1500unit)。在反應溫度為30°C下，通過以O. 8g/15分鐘的速度添加15分鐘、停止45分鐘的循環操作添加甲醛，反復上述循環向反應液中加入20重量％甲醛20. 8g。在反應過程中加入氫氧化鈉將反應液PH調整為pH8. O。24小時后D-絲氨酸的反應收率為95%。另一方面，一次性添加甲醛使其反應時，反應收率為20%。[實施例9](由甲醛處理過的轉化體制備D-絲氨酸未添加Mg進行制備)向實施例I中制備的MT-11015凍結菌體的溶解液中加入甲醛使其為lOOmM，在30°C下緩緩攪拌I小時。攪拌中用氫氧化鈉調節pH為8. O。使用該菌體懸濁液進行與實施例8相同的反應。未進行甲醛處理時生成2摩爾％ L-絲氨酸，進行甲醛處理時未檢測到L-絲氨酸。向上述反應液中加入6N-鹽酸調節pH為4. I。加入0.97g活性炭(含水率50%)，在60°C下攪拌I小時，通過過濾除去活性炭和菌體成分。然后，將濾液濃縮至30g，緩緩地加入13g異丙醇，在冰中緩緩攪拌I小時，邊攪拌邊使D-絲氨酸析出。過濾晶析液，用冷卻的40%異丙醇13mL洗滌結晶，并使其干燥。得到白色D-絲氨酸結晶，回收率為60%，未檢測到原料甘氨酸。結晶的光學純度為99. 8% ee。[實施例10][10-1](黃單胞菌DNA克隆和載體的構建)將從東京大學分子細胞生物學研究所取得的水稻黃單胞菌(IAM1657)接種到50ml的LB培養基中。在30°C下培養一夜后集菌，用含有lmg/ml溶菌酶的溶菌液溶菌。用苯酚處理溶菌液后，采用常用方法通過乙醇沉淀使DNA沉淀。生成的DNA沉淀，纏繞在玻璃棒上回收后洗滌，用于PCR。PCR用的引物使用下述寡核苷酸(委托北海道System · Science株式會社進行合成)，該寡核苷酸具有以公知的水稻黃單胞菌的DTA基因(GenBank登錄號E05055)為基礎設計的序列號13及14所示的堿基序列。上述引物在5'末端附近及3'末端附近分別具 有KpnI及HindIII的限制酶識別序列。使用O. 025ml含有6ng/ μ I上述微生物的染色體DNA及引物各3 μ M的PCR反應液，在下述條件下進行PCR，所述條件為變性96°C、1分鐘，退火55°C、30秒，延伸反應68°C、1分15秒，并進行35次由上述步驟組成的反應循環。用KpnI及HindIII消化PCR反應產物及質粒pUC18 (寶酒造(株))，使用Ligation *High(東洋紡(株))連接后，使用所得的重組質粒，轉化大腸桿菌DH5 α。在含有50 μ g/ml氨芐青霉素(Am)及X-Gal (5-溴-4-氯-3-吲哚基-β -D-半乳糖苷)的LB瓊脂培養基中培養轉化株，得到耐Am且成為白色集落的轉化株。從上述得到的轉化株中萃取質粒。根據常用的堿基序列的確定法確認了導入質粒中的DNA片段的堿基序列為與公知的水稻黃單胞菌的DTA的序列相同的堿基序列。所得的表達質粒命名為pXDTAl。[10-2](表達黃單胞菌屬DTA的大腸桿菌的獲取)使用pXDTAl按照常用的方法轉化大腸桿菌W3110 △ dsdA,將得到的轉化體命名為MT-11028。另外，使用實施例I制備的pACDTAl、pACDTA2、pACDTA3，通過常用的方法轉化大腸桿菌 W3110 Λ dsdA,將得到的轉化體命名為 MT-11015W、MT-11016W、MT-11017W。[10-3](由廣口瓶培養所得菌體的獲取)在500mL帶有隔板的三角瓶內的IOOmL含有50 μ g/ml Am的LB培養基中接種MT-11015W、MT-11016W、MT-11017W、MT-11028 的重組大腸桿菌，在 30°C下培養，直到 0D660為 I. O。然后，在IOL容量的BMSlO (ABLE社制)中進行培養。在培養條件為攪拌700rpm、溫度:30°C、pH(用NH3維持):7. 2、通氣:1雨、容量:5L、培養時間48小時的條件下操作。對培養基沒有特別的限制，所用的培養基的組成為相對于IL水含有7g多聚蛋白胨(大日本制藥)>0. 09g硫酸亞鐵·7水合物、I. 5g硫酸銨、2g硫酸鎂·6水合物、2g磷酸二氫鉀、2g磷酸氫二鉀、O. 6g ADEKANOL LG126 (旭電化工業)。接種前加入葡萄糖使其濃度為20g/L，接種50mL上述帶有隔板的三角瓶中的培養液。在上述條件下使最初加入的葡萄糖完全消耗掉后，在剩余時間內以低于O. lg/L的可變速度供給全量為200g的葡萄糖。經離心從培養液中收集菌體，在_20°C下凍結。[10-4](有機溶劑處理的微生物對生成L-絲氨酸的副反應的抑制)
[副反應生成L-絲氨酸的酶活性的測定方法]向60g MT-11028的凍結菌體(固態成分比例約為10% )中加入I. Og氯化鎂.6水合物，再加入各種有機溶劑至規定濃度，在35°C下攪拌I小時。從上述的處理菌體液中取以干燥菌體計為O. 22g的菌體液，加入9g酶活性測定液，在35°C下攪拌20小時，測定生成的L-絲氨酸和殘留的D-絲氨酸的比率。總結結果示于表2。(L-絲氨酸生成活性測定液)在ρΗ7· O的O. 5Μ磷酸鉀緩沖液中溶解10. 84g D-絲氨酸、6mg PLP，使其為100g。表權利要求
1.一種編碼下述(a)或(b)的蛋白質的DNA， (a)蛋白質，由序列號6、8中任一序列號記載的氨基酸序列構成， (b)蛋白質，由在(a)的氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個氨基酸得到的氨基酸序列構成，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的酶活性。
2.如權利要求I所述的DNA，其中，(b)蛋白質是由(a)氨基酸序列中I 5個氨基酸被取代的氨基酸序列構成的蛋白質，所述I 5個氨基酸選自第6、10、14、17、22、23、24、34、35、51、68、87、95、107、I10、I13、118、121、129、133、134、136、139、140、165、175、179、180、182、194、198、202、205、214、215、216、221、227、236、266、268、270、284、287、288、308、309、310、311、312、315、329、331、333、334、339、340、342、361、362、365、369 及 373 的氨基酸。
3.如權利要求2所述的DNA，在(a)氨基酸序列中，第6個氨基酸為Met或lie，第10個氨基酸為Val或Ala，第14個氨基酸為Pro或Ala，第17個氨基酸為Pro或Ala，第22個氨基酸為Ala或Ser，第23個氨基酸為Arg或Ser，第24個氨基酸為Val或He，第34個氨基酸為Pro、Ala或Thr，第35個氨基酸為Pro或Ala，第51個氨基酸為Glu或Asp，第68個氨基酸為Leu或Arg，第87個氨基酸為Leu或Val，第95個氨基酸為Arg或Thr，第107個氨基酸為Ala或Gln，第110個氨基酸為Ala或Arg，第113個氨基酸為Ala或Gly，第118個氨基酸為Ala或Thr，第121個氨基酸為lie、Met或Leu，第129個氨基酸為Ala、Gln或Glu,第133個氨基酸為Gln或Arg，第134個氨基酸為Ile或Leu，第136個氨基酸為His、Ala或Gln，第139個氨基酸為Ala或Thr，第140個氨基酸為Ala、Gln或Arg，第165個氨基酸為Thr或Leu，第175個氨基酸為Asp或Ala，第179個氨基酸為Leu或Val，第180個氨基酸為Asn或Thr，第182個氨基酸為Val或Ala，第194個氨基酸為Tyr或Leu，第198個氨基酸為Glu或Asp，第202個氨基酸為Ala或Gln，第205個氨基酸為Arg或Lys，第214個氨基酸為Tyr或His，第215個氨基酸為Ala或Gln，第216個氨基酸為Gln或Leu，第221個氨基酸為Ser或Asn，第227個氨基酸為Ile或Thr，第236個氨基酸為Val或Ala，第266個氨基酸為Asp或Asn，第268個氨基酸為Pro或Ala，第270個氨基酸為Thr、Lys或Ala，第284個氨基酸為Thr或Val，第287個氨基酸為Pro或Ala，第288個氨基酸為Asp或Gly，第308個氨基酸為Val或He，第309個氨基酸為Phe、Tyr或His，第310個氨基酸為Asp或Gly，第311個氨基酸為Ala或Glu，第312個氨基酸為GliuPro或Gln，第315個氨基酸為Thr或Gln，第329個氨基酸為Ala或Glu，第331個氨基酸為Asp或Gly，第333個氨基酸為Gln或Thr，第334個氨基酸為Pro或Ala，第339個氨基酸為Asp或Ala，第340個氨基酸為Thr或Val，第342個氨基酸為Arg或Leu，第361個氨基酸為Val或Tyr，第362個氨基酸為Arg或Lys，第365個氨基酸為Val或He，第369個氨基酸為Val或He，第373個氨基酸為Ala或Ser。
4.下述(a)的DNA, (a)DNA,由序列號5、7中任一序列號記載的堿基序列或其互補序列構成。
5.一種重組DNA，是將權利要求I 4中任一項所述的DNA整合到載體中形成的重組DNA。
6.一種轉化體，是使用權利要求5所述的重組DNA轉化宿主細胞得到的轉化體。
7.如權利要求6所述的轉化體，其中，被轉化的宿主細胞為微生物。
8.如權利要求7所述的轉化體，其中，被轉化的微生物為D-絲氨酸脫氨酶缺失的微生物。
9.下述(a)或(b)的蛋白質， (a)蛋白質，由序列號6、8中任一序列號記載的氨基酸序列構成，(b)蛋白質，所述蛋白質由在(a)氨基酸序列中缺失、取代、插入或添加I個或多個氨基酸得到的氨基酸序列構成，并且具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的酶活性。
10.如權利要求9所述的蛋白質，其中，(b)蛋白質是由(a)氨基酸序列中I 5個氨基酸被取代的氨基酸序列構成的蛋白質，所述I 5個氨基酸選自第6、10、14、17、22、23、24、34、35、51、68、87、95、107、110、113、118、121、129、133、134、136、139、140、165、175、179、180、182、194、198、202、205、214、215、216、221、227、236、266、268、270、284、287、288、308、309、310、311、312、315、329、331、333、334、339、340、342、361、362、365、369 及 373 的氨基酸。
11.如權利要求10所述的蛋白質，在(a)氨基酸序列中，第6個氨基酸為Met或lie，第10個氨基酸為Val或Ala，第14個氨基酸為Pro或Ala，第17個氨基酸為Pro或Ala，第22個氨基酸為Ala或Ser，第23個氨基酸為Arg或Ser，第24個氨基酸為Val或He，第34個氨基酸為Pro、Ala或Thr，第35個氨基酸為Pro或Ala，第51個氨基酸為Glu或Asp，第68個氨基酸為Leu或Arg，第87個氨基酸為Leu或Val，第95個氨基酸為Arg或Thr，第107個氨基酸為Ala或Gln，第110個氨基酸為Ala或Arg，第113個氨基酸為Ala或Gly，第118個氨基酸為Ala或Thr，第121個氨基酸為lie、Met或Leu，第129個氨基酸為Ala、Gln或Glu,第133個氨基酸為Gln或Arg，第134個氨基酸為Ile或Leu，第136個氨基酸為His、Ala或Gln，第139個氨基酸為Ala或Thr，第140個氨基酸為Ala、Gln或Arg，第165個氨基酸為Thr或Leu，第175個氨基酸為Asp或Ala，第179個氨基酸為Leu或Val，第180個氨基酸為Asn或Thr，第182個氨基酸為Val或Ala，第194個氨基酸為Tyr或Leu，第198個氨基酸為Glu或Asp，第202個氨基酸為Ala或Gln，第205個氨基酸為Arg或Lys，第214個氨基酸為Tyr或His，第215個氨基酸為Ala或Gln，第216個氨基酸為Gln或Leu，第221個氨基酸為Ser或Asn，第227個氨基酸為Ile或Thr，第236個氨基酸為Val或Ala，第266個氨基酸為Asp或Asn，第268個氨基酸為Pro或Ala，第270個氨基酸為Thr、Lys或Ala，第284個氨基酸為Thr或Val，第287個氨基酸為Pro或Ala，第288個氨基酸為Asp或Gly，第308個氨基酸為Val或He，第309個氨基酸為Phe、Tyr或His，第310個氨基酸為Asp或Gly，第311個氨基酸為Ala或Glu，第312個氨基酸為GliuPro或Gln，第315個氨基酸為Thr或Gln，第329個氨基酸為Ala或Glu，第331個氨基酸為Asp或Gly，第333個氨基酸為Gln或Thr，第334個氨基酸為Pro或Ala，第339個氨基酸為Asp或Ala，第340個氨基酸為Thr或Val，第342個氨基酸為Arg或Leu，第361個氨基酸為Val或Tyr，第362個氨基酸為Arg或Lys，第365個氨基酸為Val或He，第369個氨基酸為Val或He，第373個氨基酸為Ala或Ser。
12.—種制備具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶的方法，其特征在于，培養權利要求6 8中任一項所述的轉化體，從所得的培養物中，獲取具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的酶活性的蛋白質。
13.—種D-絲氨酸的制備方法，其中包含在權利要求6 8中任一項所述的轉化體或其處理物的存在下使甘氨酸和甲醛反應，所述處理物選自對所述轉化體進行機械破壞、超聲波處理、凍結融解處理、干燥處理、加壓或減壓處理、滲透壓處理、自身消化、表面活性劑處理、酶處理而得到的物質、及含有通過上述處理所得的、具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶的部分的固定化物，及所述轉化體的固定化物。
14.一種D-絲氨酸的制備方法，其中包含在權利要求9 11中任一項所述的蛋白質的存在下使甘氨酸和甲醛反應。
15.—種D-絲氨酸的制備方法，所述制備方法在權利要求7或8所述的轉化體或其處理物的存在下，使甘氨酸和甲醛反應合成D-絲氨酸，所述處理物選自對所述轉化體進行機械破壞、超聲波處理、凍結融解處理、干燥處理、加壓或減壓處理、滲透壓處理、自身消化、表面活性劑處理、酶處理而得到的物質、及含有通過上述處理所得的、具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶的部分的固定化物，及所述轉化體的固定化物，其中，采用下述(I) (4)中一種以上的方法將所述反應的反應液中副生的L-絲氨酸抑制在相對于D-絲氨酸為I. 5摩爾％以下， (1)對具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的微生物進行有機溶劑處理及/或加熱處理的方法； (2)將反應液中的甲醛濃度，在a)通過所述(I)的方法進行有機溶劑處理及/或加熱處理時，控制在2M以下；在b)未進行有機溶劑處理及/或加熱處理時，控制在150mM以上2M以下的方法； (3)使用含有具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的酶、且L-絲氨酸合成酶基因缺失的微生物作為催化劑的方法； (4)向反應液中添加含有具有L-絲氨酸脫氨酶活性的酶的微生物的方法。
16.如權利要求15所述的制備方法，其中，所述有機溶劑為選自甲醛、苯甲醛、二氯乙烷及異丙醇中的一種以上有機溶劑。
17.如權利要求15或16所述的制備方法，其中，所述有機溶劑處理及/或加熱處理在2價金屬離子存在下進行。
18.如權利要求17所述的制備方法，其中，2價金屬為選自鎂、錳、鋅、鎳、鈷及鐵中的一種以上金屬。
全文摘要
本發明涉及一種編碼新型的具有D-絲氨酸合成活性的酶的DNA、該酶的制備方法、及利用該酶的D-絲氨酸制備方法。詳細而言，涉及一種編碼具有由甘氨酸和甲醛合成D-絲氨酸的活性的新型酶的DNA、及將所述DNA整合到載體中形成的重組DNA、由所述重組DNA轉化得到的轉化體、及利用所述酶由甲醛和甘氨酸制備D-絲氨酸的方法。
文檔編號B62D65/00GK102925467SQ20121034120
公開日2013年2月13日 申請日期2005年10月7日 優先權日2004年10月13日
發明者安樂城正, 秀崎友則, 渡邊清一, 西田圭太, 長原清輝, 小糸光男 申請人:三井化學株式會社