專利名稱：鑒別發蟲草的特征性核苷酸序列及其探針和方法
技術領域：
本發明屬于利用分子生物學方法檢測中藥材真偽的技術領域，具體涉及用于鑒別發蟲草(Ophiocordyc印S crinalis)的特征性核苷酸序列以及核酸分子探針和鑒別發蟲草的方法。
背景技術：
發蟲草(Ophiocordyc印s crinalis)是屬于廣義蟲草屬(Cordyceps s. 1.)的一種蟲生真菌，該屬真菌還包括冬蟲夏草(Ophiocordyc印s sinensis)和蛹蟲草(Cordyceps militaris)。野生冬蟲夏草是中國傳統中藥，具有保肺腎、補精髓、化痰止勞咳的作用，能夠調節免疫功能，增強人體抵抗力。目前由于大量的采挖已經造成野生資源不足，價格大幅上張。目前，仍然無法實現冬蟲夏草子實體的人工栽培，而其菌絲體培養也需要低溫長期發酵，成本過高。發蟲草與冬蟲夏草在親緣關系上極為接近，與其具有相似的功能，具有開發為蟲草新產品的價值。因此可以快速而準確的鑒別發蟲草子實體以及相關制品真偽的方法和技術對于發蟲草生產相關企業以及相關檢驗機構將具有重要的意義。DNA是生物儲存遺傳信息的物質，每個生物物種乃至個體均具有獨特的特征性核苷酸序列，可以作為該生物物種或個體區別于其他物種或個體的標志。DNA是細胞生物的基本組成部分，作為遺傳信息的載體，具有一定的穩定性，不會受表型的影響而改變，是用來鑒別物種、個體的可靠依據。通過生物信息學的分析可以找到不同物種或個體的特征性核苷酸序列，利用分子生物學的手段對該序列進行探測即可快速、準確的對物種或個體進行鑒別。發明人已申請并獲授權兩項鑒別尖頭蟲草及蜂頭蟲草的核苷酸特征性序列的專利， 目前未見與發蟲草相關的核苷酸特征性序列的專利。

發明內容
本發明的第一個目的是提供來源于發蟲草(Ophiocordyc印s crinalis)核糖體 rRNA內轉錄間隔區以及5.8S rRNA基因，用于鑒別發蟲草的特征性核苷酸序列，其序列如 SEQ ID NO. 1 所示。本發明提供的利用分子生物學手段鑒別發蟲草的特征性核苷酸序列來源于發蟲草核糖體rRNA內轉錄間隔區以及5. 8S rRNA基因(核糖體rRNA內轉錄間隔區以及5. 8S rRNA基因合并簡稱ITS區)，其序列如SEQ ID NO. 1所示，所在位置以及特征見圖1，該序列包含發蟲草的ITSl、5. 8S rDNA以及ITS2的序列。該序列可通過實施例1所述的方法獲得，亦可通過人工合成的方法在商業化的DNA合成儀器上按照發明人提供的核苷酸序列合成。本發明以上述發蟲草的特征性核苷酸序列(如SEQ ID NO. 1所示)為模板而設計得到全長序列或不少于16個核苷酸組成的寡核苷酸序列，以及在上述全長序列或寡核苷酸序列的基礎上經修飾、加工、變化而獲得核苷酸序列，也包括在上述全長序列或寡核苷酸序列的基礎上在5’端添加或改變10個核苷酸以下或改變原有核苷酸序列數量小于10%以及3’端6個核苷酸改變不足1個核苷酸的核苷酸序列作為發蟲草鑒定的專一性核苷酸分子探針。上述序列可通過DNA自動合成儀等DNA合成裝置按照設計好的順序合成而獲得， 并可以通過酶、同位素、生物素、化學熒光素、熒光劑等方式進行標記。因此本發明的第二個目的是提供一種針對上述ITS區的如SEQ ID NO. 1所示的序列的發蟲草專一性核苷酸分子探針，其特征在于，該發蟲草專一性核苷酸分子探針包括 Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，(序列如 SEQ ID NO. 2 所示)和 Probe II 5‘ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3‘(序列如SEQ ID NO. 3所示)。進一步優選，所述的發蟲草專一性核苷酸分子探針還包括 Probe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，(序列如SEQ ID NO. 4所示)。該序列經熒光標記后可作為Taqman探針用以鑒定發蟲草。Probe I> Probe II, Probe III的具體位置見圖2，這些序列樣適用于上述修飾、加工與變化、添加酶切位點、改變部分核苷酸序列以及標記等操作。本發明提供的上述發蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I和ftx)be II具有極高的專一性，可以與發蟲草發生專一性的反應而不與其他種類的蟲草或其他真菌發生反應。 利用上述探針通過PCR的方法或核酸雜交的方法可以快速的對發蟲草及相關制品進行檢測。本發明的第三個目的是提供一種用于鑒別發蟲草的試劑盒，其特征在于，包括發蟲草專一性核苷酸分子探針Probe 1:5’ -GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe 11 5，-CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3，和 PCR 常規反應試劑。所述的用于鑒別發蟲草的試劑盒，優選還含有蟲草屬核糖體rRNA內轉錄間隔區通用引物 CorF :5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR 5’ -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3’。以此引物對的擴增產物作為陽性對照。所述的用于鑒別發蟲草的試劑盒，優選還含有ftx)be III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3’。ftx)be III經過熒光標記后，可以作為iTaqman探針，利用熒光定量 PCR儀可實時的檢測樣品中是否存在發蟲草。本發明的第四個目的是提供一種用于鑒別發蟲草的方法，其特征在于，是以發蟲草專一性核苷酸分子探針Probe 1:5’ -GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe 11 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’作為引物，利用PCR的方法或者核酸雜交的方法或熒光定量PCR的方法鑒定發蟲草。所述的用熒光定量PCR的方法鑒定發蟲草，優選以ftObe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，標記熒光后，作為 Taqman 探針。所述的PCR的方法鑒定發蟲草，優選以蟲草屬核糖體rRNA內轉錄間隔區通用弓I 物 CorF 5' -CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，(如 SEQ ID N0. 5 所示)禾口 CorR 5，-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，(如SEQ ID N0. 6所示)的擴增產物作為陽性對照。熒光定量PCR法采用前面所述的發蟲草專一性的核酸分子探針ftObe I及ftObe II作為擴增引物，Probe III標記熒光后作為Taqman探針，利用熒光定量PCR儀可實時的檢測樣品中是否存在發蟲草。具體步驟和過程按照常規分子生物學方法進行。核酸分子雜交法采用前面所述的發蟲草專一性的核酸分子探針，通過核酸分子雜交的方式(例如Southern雜交或點雜交)對發蟲草及相關制品進行鑒定。具體步驟和過程按照常規的分子生物學方法進行。其中，發蟲草及相關制品可以直接進行檢測也可以先進行DNA的提取與擴增后再進行檢測。PCR方法采用前面所述的發蟲草專一性的核酸分子探針ftObe I及ftObe II作為一組PCR引物，以如前所述蟲草菌ITS區通用引物CorF及CorR作為陽性對照組的PCR引物，分別利用上述兩組引物按照常規的PCR方法擴增待測樣品，兩者均能擴增到特異性DNA 片段的樣品即為發蟲草，其中利用I及II獲得的DNA片斷長為109bp，利用 CorF及CorR獲得的DNA片斷長為530bp左右。僅蟲草菌ITS通用引物CorF及CorR能夠得到特異性片段而本發明提供的發蟲草專一性的核酸分子探針組成的PCR引物I及 Probe II不能擴增到特異性DNA片段的樣品則不是發蟲草樣品。其中，PCR反應可以利用本發明所述的試劑盒中的試劑或按照常規的分子生物學方法提取的發蟲草樣品總DNA作為模板，也可以直接挑取少量的發蟲草樣品加入PCR反應體系作為模板。本發明的發蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I和ftx)be II具有極高的專一性，可以與發蟲草發生專一性的反應而不與其他種類的蟲草或其他真菌發生反應。利用上述探針通過PCR的方法或核酸雜交或熒光定量PCR的方法可以快速的對發蟲草及相關制品進行檢測。本發明由于有采用DNA序列作為檢測標記，因此可以準確、快速的檢測未知樣品是否為或含有發蟲草，其中樣品可以為子實體、其粉碎加工產品及包含有發蟲草的中成藥制劑、保健品。采用PCR方法檢測時，所需樣品量極少，方法簡單，半天內可完成檢測。


圖1是核糖體rRNA基因結構示意圖，其中標示為ITS區的范圍為本發明涉及的 DNA序列，即核糖體rRNA內轉錄間隔區ITSl和ITS2以及5. 8S rRNA基因；圖2是本發明所述的發蟲草特征性核苷酸序列全序列以及用于鑒定發蟲草的兩個發蟲草專一性核苷酸分子探針ftObe I.Probe II及ftx)be III的位置圖，該圖顯示ITS區正鏈序列，左側為5’端，右側為3’端，其中加粗及下劃線部分分別為ftObe I(77bp-94bp， 位于正鏈上)、ProbeII (163bp_185bp，位于負鏈上)及Probe III (103bp_129bp，位于正鏈上)；圖3是實施例3中的PCR反應結果示意圖，其中1，2為蛹蟲草；3，4為戴氏蟲草； 5，6為冬蟲夏草；7，8為蜂頭蟲草；9，10為球孢白僵菌，11，12為連州蟲草；13，14為發蟲草， M為DNA分子量標準；圖4是實施例4中的PCR反應結果示意圖，其中1，2為蛹蟲草；3，4為戴氏蟲草； 5，6為冬蟲夏草；7，8為蜂頭蟲草；9，10為球孢白僵菌，11，12為連州蟲草；13，14為發蟲草， M為DNA分子量標準。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。實施例1 發蟲草rRNA內轉錄間隔區以及5. 8S rRNA基因(ITS區的序列)的制備取發蟲草樣品0. 1-0. 5g，液氮中研磨成粉，加入300 μ 1尿素提取液(SDS 1.5%, 尿素 7mol/L, Tris-HCl ρΗ8· 00. 05mol/L, NaCl 0. 5mol/L)，移入 1. 5ml 微型離心管中，在液氮中冷卻，迅速移到65°C融化。反復凍融3 5次后，加入等體積的酚氯仿異戊醇05 24 1)，震蕩，13000r/min離心lOmin，上清移入新管中加入等體積氯仿異戊醇04 1)，震蕩，13000r/min離心lOmin，上清移入新管中加入微量foiase A，37°C保溫30min，加入3倍體積無水乙醇，3M NaAc (pH5. 2)，_20°C放置至少30min后，13000rpm 離心15min，回收DNA沉淀，用70%乙醇和無水乙醇洗滌，抽干或風干，每管加入50ul TE (1 OOmmo 1/L Tris-Cl, 10mmol/L EDTA，ρΗ8· 0)回溶，獲得總 DNA。取0.2ml PCR管一支，加入20ul PCR反應液(包括IOxPCR緩沖液2ul，引物CorF、 CorR各40ng，2mmol/L dNTP lul，Taq酶1個單位，加超純水至20ul)，加入0. 5ul發蟲草總 DNA提取液，閉緊管蓋，置于PCR儀上按以下程序進行PCR反應94°C預變性:3min，然后93°C 變性lmin，55°C復性lmin，72°C延伸2min，共30個循環，最后72°C延伸lOmin。反應完成后利用商業化的純化試劑盒進行產物的純化并直接在DNA測序儀上測序。獲得核苷酸序列除去18S rRNA基因以及觀3 rRNA基因序列后所得到的序列即為發蟲草rRNA內轉錄間隔區以及5. 8S rRNA基因的序列，其序列如SEQ ID NO. 1所示。實施例2 發蟲草專一性探針(引物):Probe I，Probe II及ProbeIII的制備將發蟲草的ITS區序列與其他蟲草菌的同源序列進行比較，獲得最適于鑒別發蟲草寡核苷酸片段組成與排列順序，即ftObe I, Probe II及ftx)be III，如圖2所示，Probe I位置為77bp-94bp，位于正鏈上；Probe II位置為163bp_185bp，位于負鏈上；Probe III 位置為103bp-129bp，位于正鏈上。根據ftx)be I,Probe II及ftx)be III的核苷酸排列和組成可以在商業化的DNA合成儀上通過化學合成的方法合成ftObe I (如SEQ ID NO. 2所示)，Probe II (如 SEQ ID NO. 3 所示)及 Probe III (如 SEQ ID NO. 4 所示)，即可用作專一性PCR引物。再此基礎上，可以利用常規的分子生物學方法利用酶、同位素、生物素、化學熒光素、熒光劑等對I^robe I及II進行標記，即可用做雜交用探針。將ftx)be III 根據Taqman探針法進行熒光及淬滅基團的標記即可利用其作為Taqman探針進行熒光定量 PCR。實施例3:鑒定發蟲草的正對照試驗本試驗用以確定DNA樣品符合PCR要求可獲得特異性PCR產物。方法1 總DNA提取參照實施例1進行，對不同的樣品(蛹蟲草，戴氏蟲草，冬蟲夏草，蜂頭蟲草，球孢白僵菌，連州蟲草，發蟲草)分別提取DNA，再進行PCR擴增。各個樣品的PCR反應體系為:20ul PCR反應液(包括IOxPCR緩沖液2ul，引物CorF、CorR各40ng, 2mmol/L dNTP lul, Taq酶1個單位，加超純水至20ul)，加入0. 5ul各個樣品的總DNA提取液，閉緊管蓋，置于PCR儀上按以下程序進行PCR反應94°C預變性3min，然后93°C變性 lmin，55°C復性lmin，72°C延伸2min，共30個循環，最后72°C延伸IOmin0擴增的產物在 2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當的紫外光源下查看以及拍照。方法2 用牙簽直接挑取適量的各個樣品(粉碎子實體、粉碎的相關制品)(蛹蟲草，戴氏蟲草，冬蟲夏草，蜂頭蟲草，球孢白僵菌，連州蟲草，發蟲草)在裝20ul超純水的 0. 2ml PCR管種攪動，并分別稀至0. 1倍以及0.01倍，取2ul上述三個濃度的樣品懸濁液加入含有 20ul PCR 反應液(包括 IOxPCR 緩沖液 2ul，引物 CorF、CorR 各 40ng，2mmol/L dNTP lul，Taq酶1個單位，加超純水至20ul)的0. ^il PCR管中，充分混勻閉緊管蓋，全部PCR管置于PCR儀上進行如下PCR反應94°C預變性:3min，然后93°C變性lmin，6(TC復性lmin， 72°C延伸anin，共30個循環，最后72°C延伸lOmin。擴增的產物在2 %的含有DNA著色劑的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當的紫外光源下查看以及拍照。圖3為按方法1進行的實驗結果，顯示七種蟲草(1，2為蛹蟲草；3，4為戴氏蟲草； 5，6為冬蟲夏草；7，8為蜂頭蟲草；9，10為球孢白僵菌，11，12為連州蟲草；13，14為發蟲草) 均可正常的擴增得到ITS區DNA特異性片段，該結果表明五種待測蟲草提取的總DNA符合 PCR擴增的要求，可以用作專一性檢測的待測樣品。實施例4 發蟲草專一性鑒別用以從符合PCR要求的樣品中專一性的擴增發蟲草，從而鑒別發蟲草。方法1 使用實施例3中符合PCR反應要求的樣品，以這些樣品的總DNA作為模板， 參照實施例1中方法進行PCR擴增，其中引物替換為ftObe I及ftObe II，反應條件為94°C 預變性3min，然后93 °C變性lmin，6(TC復性lmin，72°C延伸2min，共30個循環，最后72 °C 延伸lOmin。擴增的產物在2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當紫外的光源下查看以及拍照。方法2 使用實施例3中符合PCR反應要求的樣品懸濁液如實施例3中方法2所述進行PCR反應，其中引物替換為ftObe I及ftObe II，反應條件為94°C預變性;3min，然后 93°C變性lmin，60°C復性lmin，72°C延伸2min，共30個循環，最后72°C延伸IOmin0擴增的產物在2%的含有DNA染料的瓊脂糖凝膠上進行電泳，在適當的紫外光源下查看以及拍照。圖4為按方法1進行的實驗結果，顯示七種蟲草(1，2為蛹蟲草；3，4為戴氏蟲草； 5,6為冬蟲夏草；7，8為蜂頭蟲草；9，10為球孢白僵菌，11，12為連州蟲草；13，14為發蟲草)，其中只有發蟲草被專一性的擴增獲得109bp左右的特異性DNA片段，而其他蟲草均無特異性DNA片段被擴增，該結果表明，發蟲草專一性探針(引物)Probe I及ftx)be II可以從多種蟲草中準確的鑒別出發蟲草，同時根據實施例3排除了假陰性(不符合PCR擴增條件而造成的陰性結果)的可能。
權利要求
1.一種用于鑒別發蟲草(Ophiocordyc印S crinalis)的特征性核苷酸序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一種用于鑒別發蟲草的發蟲草專一性核苷酸分子探針，其特征在于，該發蟲草專一性核苷酸分子探針包括 Probe 1:5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’。
3.根據權利要求2所述的發蟲草專一性核苷酸分子探針，其特征在于，所述的發蟲草專一性核苷酸分子探針還包括 Probe III :5’ -TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3’。
4.一種用于鑒別發蟲草的試劑盒，其特征在于，包括權利要求2所述的發蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5，-CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3，和 PCR 常規反應試劑。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還含有蟲草屬核糖體 rRNA 內轉錄間隔區通用引物 CorF :5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR 5， -TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，。
6.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還含有III5'-TCAGC GTCCGCAAGCAGAAATGAATCA-3，。
7.一種用于鑒別發蟲草的方法，其特征在于，是以權利要求2所述的發蟲草專一性核苷酸分子探針Probe I :5，-GACCCAGACCCCGCTGTC-3，和 Probe II 5’ -CATTTCGCTGCGTTCTTCATCG-3’作為引物，利用PCR的方法或者核酸雜交的方法或熒光定量PCR的方法鑒定發蟲草。
8.根據權利要求7所述的用于鑒別發蟲草的方法，其特征在于，所述的用熒光定量PCR 的方法鑒定發蟲草，是以Probe III :5，-TCAGCGTCCG CAAGCAGAAATGAATCA-3，標記熒光基團后作為iTaqman探針再進行熒光定量PCR。
9.根據權利要求7所述的用于鑒別發蟲草的方法，其特征在于，所述的用 PCR的方法鑒定發蟲草，還以蟲草屬核糖體rRNA內轉錄間隔區通用引物CorF 5，-CGTTGGTGAACCAGCGGAGGGAT-3，和 CorR :5，-TTGCCGCTTCACTCGCCGTTACT-3，的擴增產物作為陽性對照。
全文摘要
本發明公開了一種鑒別發蟲草的特征性核苷酸序列及其探針和方法。所述的用于鑒定發蟲草(Ophiocordyceps crinalis)的特征性核苷酸序列來自發蟲草核糖體rRNA內轉錄間隔區，其序列如SEQ ID NO.1所示。以此特征性核苷酸序列為基礎上設計的核酸分子探針Probe I(如SEQ ID NO.2所示)和Probe II(如SEQ ID NO.3所示)，以及包含該核酸分子探針的鑒定試劑盒，以及利用該探針通過PCR、核酸雜交或熒光定量PCR鑒別發蟲草的方法。利用本發明，可以方便、快速、準確的進行發蟲草及相關的制品的快速鑒定，本發明使用分子生物學手段排除了鑒定中的人為影響、鑒定結果客觀準確，鑒定時間短，半天即可完成。
文檔編號C12Q1/68GK102337347SQ20111034659
公開日2012年2月1日 申請日期2011年11月4日 優先權日2011年11月4日
發明者李浩華, 潘清靈, 王磊, 章衛民, 陳玉蟬 申請人:廣東省微生物研究所