專利名稱：人源凝血因子Ⅺ催化結構域的表達、純化及結晶的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥、生物技術、結構生物學領域。
背景技術：
人凝血因子XI (Human Coagulation factor XI，hFXI)是ー種絲氨酸水解酶原， FXI在肝臟中合成，以兩個相同的多肽鏈組成的ニ聚體形式分泌到血液中去，分子量約為 160KD。FXI每條肽鏈由607個氨基酸組成，包括N端的重鏈和C端的輕鏈，重鏈包含4個 Apple結構域，每個結構域含90-91個氨基酸，輕鏈含有催化結構域，由第370 607位的氨基酸組成。在傳統的內源性凝血途徑中，FXI是個關鍵的成份，當血管壁發生損傷，內皮下組織暴露，帶負電荷的內皮下膠原纖維與FXII結合，在高分子量激肽原和激肽釋放酶的參與下被活化為FXIIa，活化的FXIIa將FXI激活。在鈣離子的存在下，活化的XIa又激活了凝血因子IX。激活的凝血因子IX與凝血因子VIII結合并在Ca2+和磷脂存在的條件下，激活凝血因子X，活化的凝血因子X再激活凝血酶，凝血酶又激活纖維蛋白原，從而最終導致血液凝固。近來研究發現，FXI也能被凝血酶激活，被激活的FXIa反過來又促進凝血酶的大量產生。血液凝血過程出現失調可能導致危及生命的疾病，如急性心肌梗死，肺栓塞和動脈或靜脈形成血栓的造成中風。目前常用的抗凝血藥物，包括肝素、低分子肝素與華法林， 存在著嚴重的局限性，治療時需要嚴格監測。而作為一種參與凝血途徑放大階段的酶，FXIa 的活性調節不影響凝血途徑的起始階段，但能減少血栓形成，而且不會引起嚴重的出血負作用。抑制絲氨酸蛋白酶是ー種技術上可行的方案，例如，通過基于結構的藥物設計已經發現多種凝血因子X以及凝血酶的抑制劑，部分抑制劑已應用于臨床治療，并且有部分抑制劑已經開始應用于臨床治療。因此，結合FXI的重要生理作用，FXI催化結構域可以作為重要的靶標開發新穎的抗凝血劑，用于預防和治療血栓疾病。

發明內容
本發明的目的在于提供了一套完善的人凝血因子XI在巴斯德畢氏酵母體系中表達、純化、活性測定以及體外蛋白結晶的技術方法。本發明表達的重組蛋白具有有活性，成本低，穩定性高，表達量高等特點。本發明采用如下技術方案1、人凝血因子XI催化結構域突變體的表達方法，其特征在于本突變體在巴斯德畢氏酵母體系中表達，并且包含如下步驟(1)以肝庫為模板，用PCR法從肝庫擴增出FXI催化結構域，正向引物S(5‘_3’)=C CGCTCGAGAAAAGMTCGTTGGAGGAACTGC ；反向引物 AS (5 ‘ -3，):ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTT TCTCCA，引物分別含Xho I和Ml I位點(用下劃線標注)，用Xho I和Ml I雙酶切RCI催化結構域片段和載體PPICZaA ；將處理好的片段和載體用T4 DNA連接酶16°C連接過夜，轉化感受態ToplOF'菌，用含有Zeocin抗性的平板篩選陽性克隆，DNA測序鑒定；采用重疊延伸PCR的方法對FXI催化結構域基因的432和473位點進行定點突變，第一輪PCR 以構建好含有FXI催化結構域基因的質粒為模板，分別用正向引物Pl S :ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC 和反向引物Pl AS TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA進行第一輪PCR,PCR產物用DNA膠回收試劑盒回收純化；第二輪PCR 以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物P2 S GGCATTTTACAACAATCTGAAATA 和反向引物 P2 AS :GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT 進行擴增，并回收目的DNA片段；第三輪PCR 以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物P3 S AMCCACAGTGCAATACACAGATTC 和反向引物Pl AS TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA進行擴增，并回收目的DNA片段；第四輪PCR:以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物Pl S :ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和第二輪PCR的產物為反向引物進行擴增，并回收目的DNA片段；第五輪PCR 以第三輪和第四輪PCR回收得到的2個DNA片段為模板，用帶有)(ho I和Ml I的正反引物，擴增出一條完整的帶有突變位點的FXI催化結構域基因， 克隆至PPICZaA載體，轉化感受態ToplOF'菌，用含有Zeocin抗性的平板篩選陽性克隆， DNA測序鑒定；以構建好的pPICZ a A_rhFXI37(1_6Q7 (N432Q/N473Q)質粒為模板，通過定點突變 C482S,正向引物:AACGACCCATATCTCTGCCTTCC ，反向引物GGAAGGCAGAGATATGGGTCGTT 構建重組質粒 pPICZ a A-rhFXI370-607 (N432Q/N473Q/C482S)，克隆測序；(2)目的基因的克隆與表達酶切去磷酸化的PCR回收產物連接到表達載體 pPICZ a A上，重組質粒轉入大腸桿菌進行擴増，抽提質粒，測序；測序正確后，大量抽提重組質粒，重組質粒經Me I酶切后，電轉入新制的感受態細胞X-33，重組的轉化子在甲醇的誘導下表達的蛋白分泌在培養液中，SDS-PAGE電泳檢測培養液中含有與目的蛋白相同分子量的條帶。2、一種由項1所述的方法表達的人凝血因子XI催化結構域突變體。3、項2的人凝血因子XI催化結構域突變體的純化方法，其特征在于甲醇誘導后的培養基首先用陽離子瓊脂糖柱階段性洗脫初步捕獲蛋白，再用凝膠層析柱分離純化，可獲得純度達98%以上蛋白。4、項2的人凝血因子XI催化結構域突變體的活性測定方法，采用S-2366發色底物檢測活性，其特征在于5nM蛋白在20mM Tris pH7. 4,150mM Nacl,l% BSA反應條件下與不同濃度的S2366反應，37°C反應持續10分鐘，每30秒測其A4tl5吸收值，并通過以下公式
計算酶比活力《X如/i = 1.74x —χと式中V為反應體系體積(ml)、v為樣品量(ml)、
ΔΑ為吸光度變化。5、項2的人凝血因子XI催化結構域突變體的晶體的培養方法，為坐滴水蒸氣擴散法,其特征在于緩沖溶液為 30% PEG2000MME,0. IM Tris-Hcl, pH8. 5。6、項2的人凝血因子XI催化結構域突變體的晶體，其特征在于該晶體空間群為 PS1，單胞參數為σ=49.084Α力=49.084A,c= 335.136A, α = β = 90°，γ = 120°。7、項2的人凝血因子XI催化結構域突變體在藥物設計穎抗凝血劑中的應用。本項發明的內容之一是無需激活的人凝血因子XI催化結構域的設計和表達。人凝血因子XI催化結構域為370-607氨基酸肽段，突變點為N432Q/N473Q/C482S。以人肝 cDNA庫為模板，擴增出hFXI的370 607催化結構域片段，并通過重疊延伸PCR獲得突變基因rhFXI37Q_6Q7(N432Q/N473Q/C482S)。擴增出來的突變基因克隆到巴斯德畢氏酵母表達
5載體，經抗生素高拷貝篩選，獲得高效穩定表達人凝血因子XI催化結構域突變體的酵母菌株；利用甲醇誘導可獲得目的蛋白。本項發明的內容之ニ是突變體蛋白的純化及活性測定。用陽離子瓊脂糖柱階段性洗脫初步捕獲蛋白，再用凝膠層析柱分離純化，可獲得純度達98%以上蛋白。使用FXIa專一性發色底物S2366(pyroGlu-Pro-Arg-p-nitroanilide)測定重組蛋白的活性。這些實驗說明，本項申請設計的人凝血因子XI突變體無須任何激活，即具有活性，可用于人凝血因子XI抑制劑的高通量篩選。本項發明的內容之三是人凝血因子XI催化結構域突變體蛋白的結晶，為研發和改進人凝血因子XI抑制劑提供一個嶄新的研究平臺。用水蒸氣擴散法結晶蛋白，用X-ray 射線單晶衍射儀溫度100K衍射晶體，收集分辨率為3.0A數據，確定為P3i空間群，單胞參數為σ=49.084Α力=49.084A,c= 335.136A, α = β = 90°，γ = 120°。


圖 1 1. 0% DNA 凝膠電泳分析 rhFXI37(l_6(l7 (N432Q/N473Q/C482S) PCR 產物圖2 rhFXI370-607 (N432Q/N473Q/C482S)突變位點測序圖譜，紅色下劃線為突變后堿圖3重組蛋白經凝膠層析柱Superdex 75的洗脫以及收集峰處蛋白跑SDS-PAGE 電泳檢驗結果圖；圖4蛋白晶體圖
具體實施例方式實施例一表達目的基因的擴增1、申請人設計并由引物合成公司合成如下PCR引物①起始引物(正向)5，-CCGCTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC-3‘；②末端引物(反向)5，-ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTTCTCCA-3'；③突變點(C279A)引物(正向)5，-GACCATCGCCCTGCCCTC-3’；④突變點(N3O2Q)引物(反向)5，-GTCGGTAGATTGCTCTTTTCCAA-3’；⑤變點(M73Q)引物(反向)5，-GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT-3’；⑥突變點(C482Q引物(正向)5，-AACGACCCATATCTCTGCCTTCC-3’ ；⑦突變點(C482Q引物(反向)5，-GGAAGGCAGAGATATGGGTCGTT-3 ’。注明其中①②引物中的下劃線表示限制性內切酶Bio I和Ml I酶切位點； ③④⑤⑥⑦引物中下劃線表示突變氨基酸的位點。2、重疊延伸PCR方法擴增和定點突變人凝血因子XI催化結構域(N432Q/N473Q/ C482S)以肝庫為模板，用PCR法從肝庫擴增出FXI催化結構域，正向引物S(5 ‘_3’)=CCG CTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC ；反向引物 AS (5 ‘ -3，):ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTT CTCCA，引物帶有XhoI和SalI位點(用下劃線標注)，用XhoI和SalI雙酶切FXI催化結構域片段和載體PPICZaA。將處理好的片段和載體用T4DNA連接酶16°C連接過夜，轉化感受態ToplOF'菌，用含有Zeocin抗性的平板篩選陽性克隆，DNA測序鑒定。采用重疊延伸PCR的方法對FXI催化結構域基因的432和473位點進行定點突變，第一輪PCR:以構建好含有FXI催化結構域基因的質粒為模板，分別用正向引物Pl S ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC 和反向引物 Pl AS TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA 進行第一輪 PCR, PCR產物用DNA膠回收試劑盒回收純化。第二輪PCR:以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物P2 S GGCATTTTACAACAATCTGAAATA 和反向引物 P2 AS GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT 進行擴增， 并回收目的DNA片段。第三輪PCR:以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物P3 S AAACCACAGTGCAATACACAGATTC 和反向引物 P1 AS TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA 進行擴增， 并回收目的DNA片段。第四輪PCR:以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物Pl S ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和第二輪PCR的產物為反向弓丨物進行擴增，并回收目的DNA片段。第五輪PCR 以第三輪和第四輪PCR回收得到的2個DNA片段為模板，用帶有Bio I和Ml I的正反引物，擴增出一條完整的帶有突變位點的FXI催化結構域基因，克隆至 PPICZaA載體，轉化感受態ToplOF'菌，用含有Zeocin抗性的平板篩選陽性克隆，DNA測序鑒定。以構建好的pPICZ a A-rhFXI370^07(N432Q/N473Q)質粒為模板并通過定點突變 C482S，構建重組質粒 pPICZ a A-rhFXI37(1_6Q7 (N432Q/N473Q/C482S)，克隆由 DNA 測序公司測序(圖1)。實施例二目的基因的克隆人凝血因子XI催化結構域突變體的克隆PCR回收產物，用限制性內切酶B10 I酶切過夜，乙醇沉淀回收；同樣限制性內切酶》10 I酶切線性化畢赤酵母表達載體pPICZ a A, 去磷酸化，膠回收試劑盒回收線性化產物。PCR回收產物和去磷酸化的質粒pPICZaA混合，用T4 DNA連接酶，16°C過夜，65°C滅活5分鐘；取1. 5 μ 1連接物與預冷的感受態細胞 T0P10F，混合，2. 5kV放電，電擊，加入1毫升SOC溶液，37°C溫育1小時，取200 μ 1涂LB平板(25 μ g/ml Zeocin)，37°C，培養14小吋，挑選菌落，培養，小量抽提重組質粒，酶切鑒定， 酶切鑒定正確的克隆由DNA測序公司測序。實施例三突變體蛋白的表達、純化重組質粒在巴斯德畢氏酵母X-33中的表達、純化線性化重組質粒電轉化酵母 X-33菌株，涂100 μ g/ml Zeocin YPDS平板，挑菌落，抽提基因組，PCR鑒定。正確的重組子發酵表達，每天加入終濃度1 %甲醇誘導，發酵4天的培養液，離心取上清，15% SDS-PAGE 電泳檢驗分子量。表達量高的菌株擴大培養，甲醇誘導表達的重組蛋白分泌到酵母細胞培養液中，4天后收獲.培養液離心，取清液加4倍體積水稀釋，過陽離子親和層析柱， 200ml 起始緩沖液(50mM Tris-Hcl, 50mMNacl pH7. 4)洗柱，緩沖液(50mM Tris-Hcl, IM Nacl pH7. 4)進行洗脫，收集洗脫峰處蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳檢測蛋白；用凝膠層析柱 Superdex75 HR 10/30檢測蛋白的純度，單一洗脫峰，收集峰尖蛋白，電泳檢測分子量(圖 2)。實施例四突變體蛋白活性實驗通過發色底物測定活性
使用FXIa 專ー性發色底 S2366 (pyroGlu-Pro-Arg-p-nitroanilide)測定重組蛋白的活性。5nM蛋白在20mM Tris pH7. 4,150mM Nacl，1 % BSA反應條件下與不同濃度的 S2366反應，37°C反應持續10分鐘，每30秒測其A4tl5吸收值，并通過公式1計算酶比活力。nKat/mL = l.74x — x——公式 1
ν mm式中V為反應體系體積(ml)、ν為樣品量(ml)、Δ A為吸光度變化。實施例五突變體蛋白結晶實驗純化后的突變體蛋白，經濃縮換液脫鹽，濃縮至蛋白濃度約為12mg/ml，用坐滴汽相擴散法結晶蛋白，結晶使用的緩沖溶液為30%PEG2000 MME,0. IM "Tris-HchpHS. 5。長出的晶體(圖3)，用X-ray射線單晶衍射儀溫度100K衍射，收集數據，分辨率達3.0人，PS1空間群，單胞參數為σ=49.084Α力=49.084A.c= 335.136A, α = β =90°，γ =120°。
權利要求
1.人凝血因子XI催化結構域突變體的表達方法，其特征在于本突變體在巴斯德畢氏酵母體系中表達，并且包含如下步驟(1)以肝庫為模板，用PCR法從肝庫擴增出FXI催化結構域，正向引物S(5‘_3’)=CCG CTCGAGAAAAGAATCGTTGGAGGAACTGC ；反向引物 AS (5 ‘ -3，):ACGCGTCGACTCACACTGCTTGAGTTTT CTCCA，引物分別含Xho I和Sal I位點(用下劃線標注)，用Xho I和Sal I雙酶切FXI催化結構域片段和載體PPICZaA;將處理好的片段和載體用T4DNA連接酶16°C連接過夜，轉化感受態ToplOF'菌，用含有Zeocin抗性的平板篩選陽性克隆，DNA測序鑒定；采用重疊延伸 PCR的方法對FXI催化結構域基因的432和473位點進行定點突變，第一輪PCR 以構建好含有FXI催化結構域基因的質粒為模板，分別用正向引物Pl S :ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC 和反向引物Pl AS :TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA進行第一輪PCR, PCR產物用DNA膠回收試劑盒回收純化；第二輪PCR 以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物P2 S GGCATTTTACAACAATCTGAAATA 和反向引物 P2 AS :GAATCTGTGTATTGCACTGTGGTTT 進行擴增，并回收目的DNA片段；第三輪PCR 以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物P3 S :AAACCACAGTGCAATACACAGATTC 和反向引物 Pl AS :TCACACTGCTTGAGTTTTCTCCAGA 進行擴增，并回收目的DNA片段；第四輪PCR:以第一輪PCR回收得到的DNA片段為模板，用正向引物Pl S :ATCGTTGGAGGAACTGCGTCTGTTC和第二輪PCR的產物為反向引物進行擴增，并回收目的DNA片段；第五輪PCR 以第三輪和第四輪PCR回收得到的2個DNA片段為模板，用帶有)(ho I和Ml I的正反引物，擴增出一條完整的帶有突變位點的FXI催化結構域基因， 克隆至PPICZaA載體，轉化感受態ToplOF'菌，用含有Zeocin抗性的平板篩選陽性克隆， DNA測序鑒定；以構建好的pPICZ a A_rhFXI37(1_6Q7 (N432Q/N473Q)質粒為模板，通過定點突變 C482S,正向引物:AACGACCCATATCTCTGCCTTCC,反向引物GGAAGGCAGAGATATGGGTCGTT 構建重組質粒 pPICZ a A-rhFXI37o-6o7(N432Q/N473Q/C482S)，克隆測序；(2)目的基因的克隆與表達酶切去磷酸化的PCR回收產物連接到表達載體pPICZa A 上，重組質粒轉入大腸桿菌進行擴増，抽提質粒，測序；測序正確后，大量抽提重組質粒，重組質粒經Mc I酶切后，電轉入新制的感受態細胞X-33，重組的轉化子在甲醇的誘導下表達的蛋白分泌在培養液中，SDS-PAGE電泳檢測培養液中含有與目的蛋白相同分子量的條市ο
2.一種由權利要求1所述的方法表達的人凝血因子XI催化結構域突變體。
3.權利要求2的人凝血因子XI催化結構域突變體的純化方法，其特征在干甲醇誘導后的培養基首先用陽離子瓊脂糖柱階段性洗脫初步捕獲蛋白，再用凝膠層析柱分離純化， 可獲得純度達98%以上蛋白。
4.權利要求2的人凝血因子XI催化結構域突變體的活性測定方法，采用S-2366發色底物檢測活性，其特征在于5nM蛋白在20mM Tris pH7. 4,150mM Nacl，1 % BSA反應條件下與不同濃度的S2366反應，37°C反應持續10分鐘，每30秒測其A4tl5吸收值，并通過以下公式計算酶比活力
5.權利要求2的人凝血因子XI催化結構域突變體的晶體的培養方法，為坐滴水蒸氣擴散法，其特征在于緩沖溶液為30% PEG2000MME,0. IM Tris-Hcl, pH8. 5。
6.權利要求2的人凝血因子XI催化結構域突變體的晶體，其特征在于該晶體空間群為P3!，單胞參數為σ=49.084Α力=49.084A,c= 335.136A, α = β = 90°，γ = 120°。
7.權利要求2的人凝血因子XI催化結構域突變體在藥物設計穎抗凝血劑中的應用。
全文摘要
本發明提供了人凝血因子XI催化結構域突變體。本發明提供了一種人凝血因子XI催化結構域突變體(N432Q/N473Q/C482S)在巴斯德畢氏酵母中高效穩定表達、純化以及結晶的技術方法。本發明培養的人凝血因子XI催化結構域突變體晶體空間群為P31，單胞參數為α＝β＝90°，γ＝120°。該蛋白不需要任何激活就有絲氨酸蛋白酶活性，可用于人凝血因子XI抑制劑的高通量篩選；而其所結晶出的高分辨率晶體，則為人凝血因子XI抑制劑的設計、開發提供一個研發平臺。
文檔編號C12N9/64GK102559720SQ201110347809
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月4日 優先權日2010年12月16日
發明者江龍光, 王宇, 袁彩, 趙寶玉, 陳宏煒, 黃明東 申請人:中國科學院福建物質結構研究所