專利名稱：一株纖維素酶產生菌株p5的制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一株纖維素酶產生菌株P5的制備和應用，及其菌種鑒定的方法，所篩選到的細菌其分泌型纖維素酶具有適應溫度范圍廣、耐一定酸堿性的特點。
背景技術：
纖維素是自然界中分布廣泛且產量最豐富的一種碳水化合物資源，但是由于降解困難，導致纖維素資源的利用率非常的低。比如秸稈和皮殼等原料大部分都被焚燒掉，這樣做既危害生態(tài)平衡，又加重環(huán)境污染。纖維素分子可被纖維素酶降解。纖維素酶是一個酶系，能降解β-1，4-葡萄糖苷鍵。纖維素酶的研究是纖維素資源綜合利用的基礎。目前用于纖維素生物降解研究的微生物大多屬于真菌，而在細菌中篩選開發(fā)高效纖維素降解菌和纖維素酶的研究相對要少很多。纖維素降解細菌的研究大多集中在芽胞桿菌類，在 ma/^iis中的研究未有報道。隨著分子生物學、基因工程的迅猛發(fā)展，國內外均嘗試應用基因工程技術來篩選、改造和構建高效纖維素降解菌株、開發(fā)新型高效的纖維素酶。因此， 需要通過生物技術方法加大對細菌纖維素酶的研究，以開發(fā)出新型的纖維素酶。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一株新型纖維素酶產生菌，以及通過16S rDNA對菌株鑒定的方法。所篩選到的纖維素酶產生菌株P5具有適應溫度范圍廣、耐一定酸堿性的特點。能被應用于生物能源、洗衣紡織、食品加工、發(fā)酵生產等多個行業(yè)。本發(fā)明的技術方案是一株纖維素酶產生菌，所述菌株在中國普通微生物保藏管理中心的保藏號為CGMCC NO. 5356 ；保藏日期2011年10月17日，分類命名為Paflioea a/K^aiis，菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1所述。該菌株的16S rDNA基因序列已登錄Genbank數據庫，登錄號是FJ796221。上述纖維素酶產生菌的制備方法為
(1)從腐爛植物枝葉表面及附近的土壤中分離樣品，樣品加入50mLLB培養(yǎng)基中，在250 mL錐形瓶中，以160 rpm轉速于37° C培養(yǎng)M h涂布于LB固體平板上，獲得菌株；所述 LB液體培養(yǎng)基組分為每IL蒸餾水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg ；所述LB固體平板組分為每IL蒸餾水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg瓊脂粉12g ；
(2)將菌落接種到產纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基，于培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)2-4d，篩選纖維素酶的產生菌，所用的培養(yǎng)基為每IL培養(yǎng)基中含有羧甲基纖維素鈉10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g, KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g, NaCl 10 g，葡萄糖2 g，瓊脂粉12 g，以蒸餾水補足體積至IL ；
(3)將0.5%的剛果紅倒入接種培養(yǎng)后的產纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基中染色5 min，倒掉剛果紅后，使用5%的NaCl溶液浸泡脫色lh，篩選獲得產纖維素酶菌株。(4)對菌株16S rDNA基因克隆和序列分析；用于克隆細菌16S rDNA基因的通用
3上游引物序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,通用下游引物序列為GGTTACCTTGTTA CGACTT 本發(fā)明的有益效果是用含有羧甲基纖維素鈉的產纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基和基因工程技術手段，從土壤中篩選并鑒定本發(fā)明的纖維素酶產生菌株P5，經菌株分泌型纖維素酶特性分析表明，該菌分泌的纖維素酶具有適應溫度范圍廣、耐一定酸堿性的特點。本發(fā)明采用的篩選和鑒定方法易操作，結果準確性高。該菌及其分泌的纖維素酶將在生物能源、洗衣紡織、食品加工、發(fā)酵生產等多個行業(yè)中具有應用潛力。


圖1是纖維素酶產生菌株P5的基因組DNA和16S rDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖(1 基因組 DNA ；2 =Marker,從上到下一次大小為 2000bp, IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp ； 3 :16S rDNA)ο圖2是培養(yǎng)時間對菌株P5產纖維素酶的影響數據圖。圖3是培養(yǎng)溫度對菌株P5產纖維素酶的影響數據圖。圖4是pH對菌株P5纖維素酶酶活的影響數據圖。圖5是溫度對菌株P5纖維素酶酶活的影響數據圖。
具體實施例方式一、主要材料
(1)培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基組分為每L培養(yǎng)基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg ； LB固體平板組分為每L培養(yǎng)基中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg瓊脂粉12g ； 篩選培養(yǎng)基組分為每IL培養(yǎng)基中含有羧甲基纖維素鈉10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g， KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g, NaCl 10 g，葡萄糖 2 g，瓊脂粉 12 g ；
發(fā)酵培養(yǎng)基組分為每L培養(yǎng)基中含有羧甲基纖維素鈉10g，蛋白胨10g，酵母粉10g， KH2PO4 1 g, (NH4)2SO4 2 g，NaCl 5g。(2)實驗儀器設備
FA2004電子天平——上海越平科學儀器有限公司
電子電爐——上海樹立儀器儀表有限公司
DNP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱——上海精宏實驗設備有限公司
DYY-12型電泳儀——北京市六一儀器廠
YXJ-2高速離心機——常州國華電器有限公司
低速離心機——常州國華電器有限公司
數顯式電熱恒溫水浴鍋——上海躍進醫(yī)療器械廠
D-I型高壓蒸汽滅菌鍋——北京發(fā)恩科貿有限公司
7230G可見分光光度計——上海精密科學儀器有限公司
THZ-C恒溫振蕩器——太倉市實驗設備廠
XS-213光學顯微鏡——南京江南永新光學有限公司
HYG型搖床——上海欣蕊自動化設備有限公司
Haier冰箱——青島海爾集團
4移液器——大龍醫(yī)療設備(上海)有限公司三洋超低溫冰箱——日本三洋電子有限公司 WD-9413A凝膠成像分析儀——北京六一儀器廠
二、一株纖維素酶產生菌株P5的篩選
(1)從腐爛植物枝葉表面及附近的土壤中分離樣品，樣品加入50mLLB培養(yǎng)基中，在250 mL錐形瓶中，以160 rpm轉速于37° C培養(yǎng)M h涂布于LB固體平板上，獲得菌株；
(2)將菌落接種到產纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基，于培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)2-4d，篩選纖維素酶的產生菌，所用的培養(yǎng)基為每IL培養(yǎng)基中含有羧甲基纖維素鈉10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g, KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g, NaCl 10 g，葡萄糖2 g，瓊脂粉12 g，以蒸餾水補足體積至IL ；
(3)將0.5%的剛果紅倒入接種培養(yǎng)后的產纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基中染色5 min，倒掉剛果紅后，使用5%的NaCl溶液浸泡脫色lh，篩選獲得產纖維素酶菌株。三、菌株鑒定分析 (1)革蘭氏染色
接菌于載玻片上；初染滴加結晶紫(以剛好將菌膜覆蓋為宜)染色1-2 min，水洗；媒染用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋約1 min，水洗；脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時，立即水洗 (脫色時間一般為20-30 s)；復染用番紅液復染約2 min，水洗；鏡檢干燥后，用油鏡來觀察。菌體被染成藍紫色的是革蘭氏陽性菌，被染成紅色的是革蘭氏陰性菌。(2)菌株DNA的提取
按1%的接種量接種細菌到裝有5 mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，30 °C 150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜，使其生長至對數期，次日取1 mL菌液于1.5 mL離心管，1.0\104171^11離心1 min 沉淀菌液；棄上清，加450 PL蒸餾水，再加50 μ L 20%SDS，輕輕的上下顛倒離心管使之混勻，75 °C水浴5 min (直至菌液裂解變?yōu)槌吻?;500 μ L3 1的酚氯仿抽提蛋白質，輕輕上下顛倒使之混勻，IOOOOXg離心5 min ；輕輕吸取上清于一新的1.5 mL離心管(注意不要吸到中間的蛋白質)并補足體積到500 μ L，加500 yL3 1的酚氯仿，1. 0X IO4 r/min離心5 min，吸取上清，如此反復，直至看不到中間的蛋白質層為止(注意盡量防止DNA在抽提中發(fā)生斷裂降解)；吸取上清于一新的1.5 mL離心管并補足體積到500 yL，加500 yL氯仿，輕輕混勻，1.0X104 r/min離心5 min ；吸取上清于一新的1. 5 mL離心管，加50 μ L 3Μ NaAc，然后加500 μ L的異丙醇，上下顛倒幾次，此時應看到絮狀沉淀產生，1.0Χ104 r/min 離心5 min ；將上清吸出，加1 mL70%乙醇清洗沉淀，1.0X104 r/min離心5 min，去上清，室溫干燥；加20 PL無菌水溶解沉淀，取適量體積電泳檢測DNA質量及濃度。提取的基因組 DNA見圖1。(3)菌株16S rDNA序列分析
對菌株16S rDNA基因克隆和序列分析；用于克隆細菌16S rDNA基因的通用上游引物序列為AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,通用下游引物序列為GGTTACCTTGTTA CGACTT。PCR 反應條件是95 °C預變性5 min ；94 °C變性30 s ；57 °C退火60 s ；72 °C延伸90 s ；重復步驟2 4，反應22個循環(huán)；72 °C延伸10 min。將菌株16S rDNA連接到T載體上，篩選陽性克隆，送“上海生工生物工程技術服務有限公司”測序。將獲得的16S rDNA序列提交NCBI網
5站，獲得登錄號。使用BLAST程序在GeneBank中進行序列比對，分析各產酶菌株的分類學地位，并分析篩選菌株與序列相近菌株的演化關系。PCR獲得16S rDNA的電泳結果見圖1。四、菌株纖維素酶活測定 (1)葡萄糖標準曲線制作
取6支洗凈烘干的具塞刻度試管，編號后按0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0 mL加入標準葡萄糖溶液，并分別使用蒸餾水定容至lmL，配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后， 向各試管中加入2 mLDNS溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，充分混勻。在MO nm波長下，以0號試管中的溶液作為空白對照，調零點，測定其它各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，以對應的吸光度值為縱坐標繪制出葡萄糖標準曲線。(2)粗酶液的制備
種子培養(yǎng)在試管中加入約1/3體積的LB液體培養(yǎng)基，接入菌種后置于觀120 r/ min的搖床培養(yǎng)作為種子液。發(fā)酵培養(yǎng)種子培養(yǎng)12 h后，將所得種子液按洲接種量轉接至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37 120 r/min的搖床中培養(yǎng)。發(fā)酵液離心發(fā)酵培養(yǎng)至所需時間后，倒出適量發(fā)酵液，4000 r/min離心10 min, 取上清備用。(3)濾紙酶活測定
吸光度測定取4支具塞試管按0到3編號，0號管作為空白對照。向各試管加入2 mL 緩沖液，1、2、3號試管中加入1 mL粗酶液，4支試管同時在42 °C水浴中預熱。5 min后將 6片事先剪成1 cmXl cm小片的新華1號濾紙放入試管內，42 °C保溫。10 min后取出，迅速向各試管加入2 mLDNS顯色液，并向0號試管中補加1 mL粗酶液。將各試管充分搖勻后在沸水浴中加熱5 min,取出后迅速以流水冷卻。冷卻后用蒸餾水定容至25 mL,以0號試管中的溶液為空白對照，在MO nm波長下測定吸光度。酶活計算
將在42 ！條件下單位時間(1 min)內水解底物產生1 μ mol還原糖所需粗酶液量定義為一個酶活單位(U/mL)。酶活力計算公式見下式
酶活力(編)二二二_
180'/(J Xfr
式中k——表示葡萄糖標準曲線的斜率；
η——表示稀釋倍數；
1000——表示mg轉換成μ g ；
180——表示葡萄糖標準分子量；
t——表示反應時間(min)；
V——表示參與反應的粗酶液體積(mL)。(4)發(fā)酵條件優(yōu)化
培養(yǎng)時間對產酶的影響發(fā)酵液在37 120 r/min的搖床中培養(yǎng)。每隔1 測定一
6次酶活。取產酶活性最高的培養(yǎng)時間作為最適培養(yǎng)時間。結果見圖2。培養(yǎng)基初始pH對產酶的影響設定發(fā)酵液初始pH為2、4、6、8、10，在37 °C，120 r/min的搖床中培養(yǎng)。在最適培養(yǎng)時間于溫度為42 °C，pH為4的條件下測定酶活。取產酶活性最高的初始PH作為最適初始pH。培養(yǎng)溫度對產酶的影響設定發(fā)酵液初始pH為最適初始pH，分別于27 °C、32 V、 37 °C>42 °C>47 °C下，在120 r/min的搖床中培養(yǎng)。在最適培養(yǎng)時間于溫度為42 °C，pH 為4的條件下測定酶活。取產酶活性最高的培養(yǎng)溫度為最適培養(yǎng)溫度。結果見圖3。(5)酶學性質研究
以最適產酶條件下制備的粗酶液為原料。反應pH對酶活的影響分別使用pH為2、4、6、8、10的緩沖液，在42 ！反應條件下測定酶活。取測得酶活最高的PH為最適反應pH。結果見圖4。反應溫度對酶活的影響使用pH為最適反應pH的緩沖液，分別在27 °C、32 V、 37 °C、42 °C、47 ！反應條件下測定酶活。取測得酶活最高的溫度為反應最適溫度。結果見圖5。上述實驗的結果表明，本發(fā)明所述纖維素酶產生菌株P5分泌的纖維素酶具有適應溫度范圍廣、耐一定酸堿性的特點。
權利要求
1.一株纖維素酶產生菌株P5，其特征在于所述菌株在中國普通微生物保藏管理中心的保藏號為CGMCC NO. 5356 ；分類命名為Pa/Jioea a/K^aiis，菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO. 1 所述。
2.如權利要求1所述的一株纖維素酶產生菌株P5的制備方法是，其特征在于(1)從腐爛植物枝葉表面及附近的土壤中分離樣品，樣品加入50mLLB培養(yǎng)基中，在250 mL錐形瓶中，以160 rpm轉速于37° C培養(yǎng)M h涂布于LB固體平板上，獲得菌株；所述 LB液體培養(yǎng)基組分為每IL蒸餾水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg ；所述LB固體平板組分為每IL蒸餾水中含有蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl IOg瓊脂粉12g ；(2)將菌落接種到產纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基，于培養(yǎng)溫箱中培養(yǎng)2-4d，篩選纖維素酶的產生菌，所用的培養(yǎng)基為每IL培養(yǎng)基中含有羧甲基纖維素鈉10 g，蛋白胨10g，酵母粉5 g, KH2PO4 1 g，MgSO4 0.2 g, NaCl 10 g，葡萄糖2 g，瓊脂粉12 g，以蒸餾水補足體積至IL ；(3)將0.5%的剛果紅倒入接種培養(yǎng)后的產纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基中染色5 min，倒掉剛果紅后，使用5%的NaCl溶液浸泡脫色lh，篩選獲得產纖維素酶菌株。
3.如權利要求1所述一株纖維素酶產生菌株P5的16SrDNA序列獲得方法是對菌株16S rDNA基因克隆和序列分析；用于克隆細菌16S rDNA基因的通用上游引物序列為 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,通用下游引物序列為GGTTACCTTGTTACGAC TT。
4.如權利要求1所述纖維素酶產生菌株P5的應用，其特征在于所述纖維素酶產生菌株P5應用于生產纖維素酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新型維素酶產生菌株P5。該菌株在中國普通微生物保藏管理中心的保藏號為CGMCCNO.5356;菌株的16SrDNA序列如 SEQIDNO.1所述。用含有羧甲基纖維素鈉的產纖維素酶菌株篩選培養(yǎng)基和基因工程技術手段，從土壤中篩選并鑒定本發(fā)明的纖維素酶產生菌株P5，經菌株分泌型纖維素酶特性分析表明，該菌分泌的纖維素酶具有適應溫度范圍廣、耐一定酸堿性的特點，該菌及其分泌的纖維素酶將在生物能源、洗衣紡織、食品加工、發(fā)酵生產等多個行業(yè)中具有應用潛力。
文檔編號C12N9/42GK102433271SQ20111034807
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月7日 優(yōu)先權日2011年11月7日
發(fā)明者侯進慧, 劉全德, 蔡侃, 陳宏偉, 高兆建, 高明俠 申請人:徐州工程學院