專利名稱：干酪乳桿菌n1115、其免疫調(diào)節(jié)作用及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程領(lǐng)域，涉及一種乳酸菌的新菌株，具體地說是一種干酪乳 I^KLactobacΠIus casei)附115、其免疫調(diào)節(jié)作用及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前研究發(fā)現(xiàn)，含有乳酸菌(LAB)的產(chǎn)品具有保健作用。乳酸菌菌株有幾千種，不同的菌株具有不同的保健作用，其中一些菌株具有增強(qiáng)免疫的保健作用。乳酸菌對免疫功能的調(diào)節(jié)作用，與乳酸菌刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(例如 IL-12、IL-6、TNF-a 等)密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌具有抗過敏的作用，當(dāng)它被巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞等擔(dān)任自然免疫的細(xì)胞吞噬時，會誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-12，IL-12能夠促進(jìn)未分化T細(xì)胞向I型的輔助T細(xì)胞 (即Thl細(xì)胞)分化，從而使Thl/Th2平衡向Thl側(cè)偏移。而向II型的輔助T細(xì)胞(即Th2細(xì)胞)側(cè)偏移的Thl/Th2平衡，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性的IgE，是導(dǎo)致過敏反應(yīng)發(fā)病的一個原因， 因此誘導(dǎo)由自然免疫擔(dān)任細(xì)胞產(chǎn)生IL-12、改善Thl/Th2平衡的活性，就成為評價菌株改善過敏反應(yīng)效果的一個重要指標(biāo)。另外，IL-12還是一種T細(xì)胞激活因子，可活化T細(xì)胞及NK 細(xì)胞分泌干擾素-Y (INF- y )和腫瘤壞死因-a (TNF- a )。IL-6是一種具有促炎癥反應(yīng)和抗炎癥反應(yīng)的雙重作用的細(xì)胞因子。通常，IL-6是由T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，以刺激免疫應(yīng)答。IL-6作為抗炎性細(xì)胞因子，通過激活I(lǐng)L-I受體拮抗物和IL-10，介導(dǎo)實現(xiàn)對TNF-α和IL_1的抑制作用。IL-6與許多疾病過程有關(guān)，包括糖尿病、動脈粥樣硬化、抑郁癥、阿耳茨海默氏病(早老性癡呆病)、全身性紅斑狼瘡、前列腺癌等。TNF-α是腫瘤壞死因子(TNF)的一種。TNF主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，也可以由淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等其他細(xì)胞產(chǎn)生。TNF的主要作用是調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞， TNF可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)炎癥，抑制腫瘤發(fā)生和病毒復(fù)制。TNF通常與IL-I和IL-6協(xié)同作用，在不同的組織發(fā)揮不同的功能。TNF產(chǎn)生失調(diào)與許多人類疾病相關(guān)，如阿耳茨海默氏病(早老性癡呆病)、癌癥、成年人抑郁癥、腸炎(IBD)等。干酪乳桿菌O3Ctofe^iBm caM》作為一種益生菌，存在于人類體內(nèi)時能夠耐受有機(jī)體的防御機(jī)制(包括口腔中的酶、胃液中低PH值環(huán)境和小腸的膽汁酸等)。干酪乳桿菌進(jìn)入人體后可以在腸道內(nèi)大量存活，起到調(diào)節(jié)腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)人體消化吸收等作用，同時具有高效降血壓、降膽固醇、促進(jìn)細(xì)胞分裂、產(chǎn)生抗體免疫、增強(qiáng)人體免疫、預(yù)防癌癥和抑制腫瘤生長等功能；還具有緩解乳糖不耐癥、預(yù)防過敏等益生保健作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題，是提供一種新的微生物菌株干酪乳桿菌 (Lactobacillus casei)附115，它是從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品中分離出來的。
本發(fā)明的干酪乳桿菌rtacio力aci/^As casei)m\l^,已于2011年3月17日，在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (國家專利局指定專利微生物保藏中心)進(jìn)行保藏，保藏編號CGMCC No. 4691。本發(fā)明的另外一個目的，是提供了干酪乳桿菌mii5的免疫調(diào)節(jié)作用，通過培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)產(chǎn)生了 IL-12、IL-6，TNF-α。本發(fā)明還有一個目的，即提供了上述干酪乳桿菌Ν1115免疫調(diào)節(jié)作用的應(yīng)用，制備了含有干酪乳桿菌W115的酸牛奶、乳酸菌飲料、菌粉制劑。與已有乳酸菌相比，干酪乳桿菌mil5對低PH值和高膽汁酸鹽具有更強(qiáng)的抗性，具有更好的耐受人消化道不良環(huán)境的能力，可以更好地發(fā)揮其益生作用。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，所采用的技術(shù)方案是
一種干酪乳桿菌(Lactobacillus caseiMl 115，是從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品中分離出的耐酸和耐膽鹽的益生菌；該菌菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏編號=CGMCC No. 4691。上述干酪乳桿菌mil5的分離純化方法，按照如下步驟順序進(jìn)行 步驟1樣品采集
取25mL內(nèi)蒙古傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品，加入到250mL生理鹽水中，充分混勻，得到樣品； 步驟2樣品的富集
取樣品2mL，加入到IOOmL的LC液體培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)72h，得到培養(yǎng)液； 步驟3菌株分離
取培養(yǎng)液lmL，用0. 9% (重量與體積的百分比)無菌的生理鹽水稀釋100000倍，分別為梯度稀釋IO-1UO-2UO-3UO-4UO-5倍，得到菌懸液；
取MRS瓊脂培養(yǎng)基，融化后，倒入培養(yǎng)皿，待其冷卻、完全凝固后，吸取0. ImL菌懸液涂布到培養(yǎng)基上；
置35°C環(huán)境下厭氧培養(yǎng)72h (H2 =CO2 :N2=5 :10 :85)，觀察菌落生長情況； 待平板出現(xiàn)典型菌落后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)干酪乳桿菌的菌落特征以及參考相關(guān)文獻(xiàn)圖片，挑選出相應(yīng)的菌落，進(jìn)行下一步的菌株純化。步驟4 菌株的純化
挑取選中的單菌落，將菌落培養(yǎng)物劃線接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，35°C有氧環(huán)境培養(yǎng) 72h ；然后，再將培養(yǎng)皿上長出的單菌落，繼續(xù)劃線接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，35°C有氧環(huán)境培養(yǎng)72h ；連續(xù)培養(yǎng)三次；
最后，將挑取的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性、短桿、無芽孢的純化菌株，即為獲得的純培養(yǎng)物，然后，將純培養(yǎng)物置于無菌的20%甘油中在-70°C保存，同時接種MRS瓊脂培養(yǎng)基試管斜面用于臨時保存。作為本發(fā)明的一種限定，上述分離純化過程中使用的MRS培養(yǎng)基具有以下組成 酪蛋白胨10g ；牛肉膏10g ；酵母膏5g ；葡萄糖20g ；乙酸鈉5g ；檸檬酸二胺2g ；吐溫-80 =Ig ；K2HPO4 :2g ；MgSO4 · 7H20 :0. 2g ；MnSO4 · 7H20 :0. 05g ；瓊脂:15g ；蒸餾水IOOOmL ； 該培養(yǎng)基調(diào)節(jié)PH6. 8 士 0. 1。作為本發(fā)明的另一種限定，上述分離純化過程中使用的LC培養(yǎng)基具有以下組成 蛋白胨10g ；酵母膏l(xiāng)g ；牛肉膏4g ;K2HP04 :2g ；乙酸鈉3g ；檸檬酸銨lg ；MgSO4 · 7H20 0. 2g ；MnSO4 ·7Η20 :0. 05g ；干酪素酸性水解物=Ig ；吐溫-80 =Ig ；蒸餾水=IOOOmL ；該培養(yǎng)基調(diào)節(jié) pH6. 0 士 0. 1。本發(fā)明的干酪乳桿菌mil5的細(xì)菌學(xué)特征如下 一、基本特征
干酪乳桿菌mil5的基本特性如表1所示。表1. Nl 115基本特性
試驗項目結(jié)果試驗項目結(jié)果試驗項目結(jié)果革蘭氏染色+空氣中生長+10°c發(fā)酵+細(xì)胞形態(tài)短桿6. 5%NaCl 生長+15°C發(fā)酵+形成芽孢—pH9. 6生長—45 "C發(fā)酵—接觸酶—pH4. 5生長+10%牛奶發(fā)酵+氧化酶—發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣—
由表1可見，干酪乳桿菌mii5為革蘭氏陽性、短桿、無芽胞、接觸酶和氧化酶試驗陰性菌株；該菌株可在空氣、6. 5%NaCl、pH9. 6或pH4. 5的條件下生長；該菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣試驗陰性，可在10%牛奶中發(fā)酵，可在10°C和15°C條件下發(fā)酵，但不能45°C條件下發(fā)酵。二、生化特征
本發(fā)明的菌株干酪乳桿菌N1115是一種兼性厭氧菌，在35°C顯示出最佳的生長能力。 在牛乳培養(yǎng)基中(10%的脫脂乳)，顯示出了較好的產(chǎn)酸能力，可在48h內(nèi)凝乳。本發(fā)明應(yīng)用梅里埃公司生產(chǎn)的API 50CH試劑條對所提供的菌株干酪乳桿菌N1115進(jìn)行了糖發(fā)酵特性的檢測，其原理是以基礎(chǔ)培養(yǎng)基做基礎(chǔ)，分別添加不同的碳水化合物，然后接種干酪乳桿菌附115，觀察其發(fā)酵產(chǎn)酸特性；其中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基由以下成分組成硫酸銨2g ；酵母膏 0. 5g ；胰蛋白胨=Ig ；酚紅0. 18g ；無機(jī)鹽基礎(chǔ)=IOmL, ρΗ7· 8的磷酸緩沖液=IOOOmL0結(jié)果顯示干酪乳桿菌Ν1115可以很好地利用核糖、半乳糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、D-塔格糖、.D-松二糖、松三糖、N-乙酰-葡糖胺、葡萄糖酸鹽作為碳源，應(yīng)用柳醇、纖維二糖、蔗糖、攏牛兒糖的能力較弱，不能利用甘油、赤蘚糖、D-阿拉伯糖、.L-阿拉伯糖等。具體檢測結(jié)果如表2所示。表 2. Lactobacillus casei N1115 的 Api50 鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種干酪乳桿菌OactohciBm caseiMUl^,是從內(nèi)蒙古發(fā)酵乳制品中分離出的耐酸和耐膽鹽的益生菌；該菌菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏編號=CGMCC No. 4691。
2.如權(quán)利要求1所述的干酪乳桿菌mi15的分離純化方法，其特征在于它按照如下步驟順序進(jìn)行①樣品采集取25mL內(nèi)蒙古發(fā)酵乳制品，加入到250mL生理鹽水中，充分混勻，得到樣品；②樣品的富集取樣品2mL，加入到IOOmL的LC液體培養(yǎng)基中，35°C培養(yǎng)72h，得到培養(yǎng)液；③菌株分離取培養(yǎng)液lmL，用重量與體積的百分比為0. 9%的無菌生理鹽水稀釋100000倍，分別為梯度稀釋IO-1UO-2UO-3UO-4UO-5倍，得到菌懸液；取MRS瓊脂培養(yǎng)基，融化后，倒入培養(yǎng)皿，待其冷卻、完全凝固后，吸取0. ImL菌懸液涂布到培養(yǎng)基上，置35°C環(huán)境下厭氧培養(yǎng)72h，其中吐=CO2 :N2=5 :10 :85，觀察菌落生長情況； 待平板出現(xiàn)典型菌落后，挑選出相應(yīng)的菌落，進(jìn)行下一步的菌株純化；④菌株的純化挑取選中的單菌落，將菌落培養(yǎng)物劃線接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，35°C有氧環(huán)境培養(yǎng) 72h ；然后，再將培養(yǎng)皿上長出的單菌落，繼續(xù)劃線接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基上，35°C有氧環(huán)境培養(yǎng)72h ；連續(xù)培養(yǎng)三次；最后，將挑取的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察為革蘭氏陽性、短桿、無芽孢的純化菌株，即為獲得的純培養(yǎng)物，然后，將純培養(yǎng)物置于無菌的20%甘油中在-70°C保存，同時接種MRS瓊脂培養(yǎng)基試管斜面用于臨時保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干酪乳桿菌mi15的分離純化方法，其特征在于步驟②中所述LC培養(yǎng)基由以下成分組成蛋白胨10g，酵母膏l(xiāng)g，牛肉膏4g，K2HPO4 :2g,乙酸鈉3g，檸檬酸銨lg，MgSO4 · 7H20 :0. 2g，MnSO4 · 7H20 0. 05g, 干酪素酸性水解物lg，吐溫-80 =Ig,蒸餾水IOOOmL ；該培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH6. 0 士 0. 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的干酪乳桿菌mi15的分離純化方法，其特征在于步驟③中所述MRS培養(yǎng)基由以下成分組成酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸鈉5g，吐溫-80:lg，K2HPO4 :2g,MnSO4 · 7H20 :0. 05g， 瓊脂15g， 該培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH6. 8 士 0. 1。
5.權(quán)利要求1一4中任一項所述的干酪乳桿菌Nl115具有免疫調(diào)節(jié)作用，其特征在于 該干酪乳桿菌具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12、IL-6，TNF-α的能力。
6.權(quán)利要求5所述的干酪乳桿菌mil5免疫調(diào)節(jié)作用的應(yīng)用，其特征在于該干酪乳酵母膏5g，檸檬酸二胺2g， MgSO4 · 7H20 :0. 2g, 蒸餾水IOOOmL ；桿菌應(yīng)用于制備功能性飲品和保健制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)N1115、其免疫調(diào)節(jié)作用及應(yīng)用。該干酪乳桿菌是從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)的發(fā)酵乳制品中分離出的耐酸和耐膽鹽的益生菌；該菌菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏編號CGMCCNo.4691；本發(fā)明還提供了干酪乳桿菌N1115的分離純化方法，分離出的菌株與已有乳酸菌相比，對低pH值和高膽汁酸鹽具有更強(qiáng)的抗性，具有更好的耐受人消化道不良環(huán)境的能力，可以更好地發(fā)揮其益生作用；該菌株能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12、IL-6，TNF-α，具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用，可用于制備功能性飲品和保健制劑。
文檔編號C12N1/02GK102373173SQ201110357058
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者馮麗莉, 盧曉莉, 崔樹勇, 康志遠(yuǎn), 朱宏, 王世杰, 陸淳 申請人:石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司