專利名稱：全人源的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體及其應(yīng)用的制作方法
全人源的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種新的可與人表皮生長(zhǎng)因子受體特異結(jié)合的高親和力全人源單鏈抗體，能抑制表皮生長(zhǎng)因子受體的活化，從而抑制高表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體腫瘤細(xì)胞A431的生長(zhǎng)，是一種具有抗腫瘤活性的基因工程抗體。
背景技術(shù)：
正常細(xì)胞的增殖是通過(guò)各自的配體嚴(yán)格激活其生長(zhǎng)因子受體來(lái)控制的，比如生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶。癌細(xì)胞也是在生長(zhǎng)因子受體的激活下增殖的，但失去了正常增殖的嚴(yán)格控制。這種失控可能是由很多因素引起，比如生長(zhǎng)因子的過(guò)度表達(dá)或生長(zhǎng)因子受體的過(guò)度表達(dá)，以及由生長(zhǎng)因子調(diào)控的生化途徑的自發(fā)性激活。參與致癌的受體包括表皮生長(zhǎng)因子受體，來(lái)源于血小板的生長(zhǎng)因子受體，類胰島素生長(zhǎng)因子受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體和成纖維生長(zhǎng)因子受體等。
人表皮生長(zhǎng)因子受體(印idermal growth factor rec印tor，也稱為HER-1或 Erb-Bl，本文稱作“EGFR”)是170kDa的跨膜糖蛋白，是表皮生長(zhǎng)因子受體家族中的四成員之一，其由c-erbB原癌基因編碼，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)及胞內(nèi)區(qū)3部分組成。胞內(nèi)區(qū)顯示固有的酪氨酸激酶活性，跨膜區(qū)由一個(gè)親脂性多肽螺旋構(gòu)成；胞外區(qū)分成4個(gè)亞區(qū)，是EGFR 與配體(生長(zhǎng)因子等)結(jié)合的部位。在非活性狀態(tài)下EGFR受體與其配體結(jié)合后可形成同源或異源二聚體，受體胞內(nèi)區(qū)發(fā)生磷酸化可以啟動(dòng)一系列胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)。EGFR結(jié)合包括以下各項(xiàng)的配體表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α (TGF-α)，雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合 EGFQib-EGF)，β動(dòng)物纖維素和印iregulin。EGFR及其配體是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的一部分， EGFR經(jīng)由酪氨酸激酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)許多細(xì)胞過(guò)程，包括但不限于激活控制細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞存活、程序性細(xì)胞死亡、血管發(fā)生、有絲分裂發(fā)生和轉(zhuǎn)移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 研究表明，EGFR基因拷貝數(shù)增加或者過(guò)度表達(dá)，均能促進(jìn)正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，EGFR的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)在腫瘤的形成和發(fā)展過(guò)程中占了重要的地位。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它的表達(dá)在許多人類腫瘤，包括頭和頸、乳腺、結(jié)腸、前列腺、肺和卵巢的癌中上調(diào)，過(guò)量表達(dá)的程度與不佳的臨床預(yù)后相關(guān)。EGFR高表達(dá)的腫瘤預(yù)后差，容易轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間短。EGFR由于涉及到腫瘤形成，已經(jīng)成為抗腫瘤治療的特異性靶目標(biāo)。
靶向EGFR藥物主要由兩類一類是直接作用于受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)段以防止信號(hào)傳導(dǎo)的合成的酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，主要包括吉非替尼、erlotinib等等；另一類是阻斷配體結(jié)合到受體胞外功能域的單克隆抗體(MAb)，包括西妥昔單抗(cetuximab)等。
西妥昔單抗(Cetuximab，商品名Erbitux)是抗人EGFR的嵌合型IgGl單克隆抗體，它于2006年被美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)與依立替康聯(lián)合或單獨(dú)用藥以治療表達(dá)表皮生長(zhǎng)因子受體的、對(duì)依立替康的化療無(wú)效或耐受的轉(zhuǎn)移結(jié)腸直腸癌患者。但Cetuximab是一個(gè)嵌合型抗體，仍未能達(dá)到人源化。因此，靶向EGFR胞外區(qū)的全人源抗體能降低免疫原性，另外分子量只有全長(zhǎng)抗體的1/6的抗EGFR單鏈抗體可以通過(guò)E. coli發(fā)酵降低生產(chǎn)成本。發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明提供一種具有潛在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值的全人源抗人EGFR的單鏈抗體。本發(fā)明單鏈抗體的特征為特異性結(jié)合人EGFR胞外區(qū)，在體外能夠抑制表皮癌細(xì)胞A431的生長(zhǎng)。
技術(shù)方案
一種全人源的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，其特征在于
抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體包括重鏈可變區(qū)域和輕鏈可變區(qū)域，并且重鏈可變域和輕鏈可變區(qū)域通過(guò)柔性肽連接，重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列為SEQ ID N0:1;輕鏈可變區(qū)域?yàn)镾EQ ID NO 2的氨基酸序列，柔性肽的氨基酸序列為SSGGGGSGGGGSGGSA，SEQ IDNO :9。
所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，具有重鏈⑶R3域，該域包含SEQ ID NO 5的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO :8的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有重鏈⑶R2域，該域包含SEQ ID NO 4的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO :7的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有重鏈⑶Rl域，該域包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
一種分離的核酸，其特征在于該核酸編碼上述的抗體。
一種表達(dá)載體，含有上述的核酸。
一種重組宿主細(xì)胞，含上述的表達(dá)載體。
上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的應(yīng)用，選擇性地與EGFR結(jié)合或抑制EGFR與EGFR 配體的結(jié)合或中和EGFR。
上述任一項(xiàng)的抗體片段，選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。
上述任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的偶聯(lián)物。
所述的偶聯(lián)物，含有抗腫瘤藥物、靶組成部分或報(bào)告組成部分。
ElO-VH
1 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTC
1QVQLVQSGAEVKKPGSSVKV
VH-CDRl
61 TCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCC
21 S C K A S G G T F S S Y A ISffVRQA
VH-CDR2
121 CCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGGTACAGCAAACTAC4
41PGQGLEffMGG I I P I F G T A N Y
181GCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTAC
61AQKFQGRVTITADESTSTAY
VH-CDR3
241ATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCAAGAACTCGG
81MELSSLRSEDTAVYYC ARTR
301CTTAAGCATCAGTGGGGCCAAGGTACCCTGGTCACCGTC
101LKHQ WGQGTLVTV
ElO-VL
1 CTTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCCTGCTGTGTCTGTGGCCTTGGGACAGACAGTCAGG
1LSSELTQDPAVSVALGQTVR
VL-CDRl
61 ATCACATGCCAAGGAGACAGCCTCAGAAGCTATTATGCAAGCTGGTACCAGCAGAAGCCA
21 I T C Q G D SLRSYY ASffYQQKP
VL-CDR2
121 GGACAGGCCCCTGTACTTGTCATCTATGGTAAAAACAACCGGCCCTCAGGGATCCCAGAC
41 GQAPVLVIY GKNN R P S G I P D
181 CGATTCTCTGGCTCCAGCTCAGGAAACACAGCTTCCTTGACCATCACTGGGGCTCAGGCG
61 RFSGSSSGNTASLTITGAQA
VL-CDR3
241 GAAGATGAGGCTGACTATTACTGTAACTCCCGGGACAGCAGTGGTCCGGTATTCGGCGGA
81 EDEADYYC NSRDSSGPV FGG
301 GGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT
101GTKLTVLG
發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明
本發(fā)明中全人源抗EGFR單鏈抗體基因序列全長(zhǎng)711個(gè)核苷酸，預(yù)期有237個(gè)氨基酸。具有113個(gè)氨基酸的重鏈可變區(qū)(SEQ ID NO 1)和108個(gè)氨基酸的輕鏈可變區(qū)(SEQ ID NO :2)，通過(guò)16個(gè)氨基酸的柔性肽連接(SEQ ID NO 9)。
含有本發(fā)明表皮生長(zhǎng)因子受體單鏈抗體基因的表達(dá)載體和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明單鏈抗體基因的任意片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可以表達(dá)和純化上述抗表皮生長(zhǎng)因子受體抗體的方法。
本發(fā)明通過(guò)噬菌體展示抗體庫(kù)技術(shù)，以人EGFR胞外區(qū)蛋白為靶抗原，篩選得到一個(gè)能特異性結(jié)合EGFR的全人源單鏈抗體ElO ；用ImM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；利用滲透休克提取細(xì)菌周質(zhì)蛋白，低溫離心去除細(xì)胞碎片，將上清過(guò)鎳親和層析柱進(jìn)行分離純化；Western Blot 鑒定分離純化得到的ElO ；細(xì)胞ELISA分析抗體和表皮癌細(xì)胞A431表面EGFR的結(jié)合作用； 檢測(cè)單鏈抗體ElO對(duì)表皮癌細(xì)胞A431的生長(zhǎng)抑制作用。
本發(fā)明得到的抗表皮生長(zhǎng)因子單鏈抗體與表皮癌細(xì)胞A431表面表皮生長(zhǎng)因子受體具有高特異性結(jié)合，體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明得到的單鏈抗體可以明顯抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。本發(fā)明為治療和診斷以表皮生長(zhǎng)因子受體抗原的表達(dá)，特別是過(guò)量表達(dá)為特征的疾病提供了基于抗體的療法，相關(guān)疾病包括但不限于自身免疫病和癌癥。


圖1是單鏈抗體ElO的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是ElO重組載體的酶切圖譜。ElODNA由箭頭標(biāo)出，DNA大小以1Λ為單位。
圖3顯示SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳圖，描述發(fā)酵表達(dá)的ElO通過(guò)鎳柱進(jìn)行分離純化的結(jié)果，泳道1為菌體周質(zhì)提取物上清，泳道2 4為含50mM咪唑緩沖液洗滌鎳柱結(jié)果，泳道 5 7為含IOOmM咪唑緩沖液洗脫鎳柱獲得的目的蛋白。
圖4展示利用Wfestern Blot鑒定分離到的ElO。
圖5展示ElO與表皮癌細(xì)胞A431表面EGFR的ELISA結(jié)合活性，以及空白 (A431+MPBS)、陰性(MPBS+E10)和抗體對(duì)照(A431+control scFv)。
圖6是一曲線圖，描述全人源抗EGFR單鏈抗體ElO對(duì)A431細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。
以下借助非限制性實(shí)施例舉詳細(xì)描述本發(fā)明。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明精神的前提下對(duì)它所做的任何顯而易見(jiàn)的改動(dòng)，特別是對(duì)若干部件的等同替換，都構(gòu)成對(duì)本發(fā)明專利權(quán)的侵犯，將承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例中涉及的百分比，其中固定試劑為重量體積百分比，液體試劑為體積百分比。
實(shí)施例1全人源抗EGFR單鏈抗體的篩選
以包被緩沖液(IOOmM Tris, NaCl 150mM, pH9. 0)稀釋EGFR胞外區(qū)蛋白(購(gòu)自北京義翹神州生物技術(shù)公司)至100μ g/ml ；取4ml加入到免疫管中，4°C包被過(guò)夜；次日，棄上清，PBS迅速洗管3次；2% MPBS (含有2%脫脂牛奶的PBS)，37°C封閉池；棄封閉液，用 PBS迅速洗管3次；將噬菌體抗體庫(kù)(1012 IO13p. f. u) (Dana library,哈佛醫(yī)學(xué)院捐贈(zèng)) 懸浮于2%10^5并加入到免疫管中，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)301^11后，于室溫靜置901^11以上； 以含有0. 1% Tween-20的PBS洗管10次，再以PBS洗管10次去除去污劑；加入Iml IOOmM 三乙胺(700 μ 1 7. 18mol/L三乙胺加入到50ml水中)，室溫反復(fù)倒轉(zhuǎn)孵育lOmin，進(jìn)行特異性洗脫；0.5ml IM Tris (pH7. 4)用于迅速中和洗脫下來(lái)的噬菌體；中和后的噬菌體用于感染對(duì)數(shù)期的大腸桿菌TG1，進(jìn)行擴(kuò)增和制備，用于下一輪篩選。
實(shí)施例2抗EGFR單鏈抗體的可溶性表達(dá)及分離純化
挑選測(cè)序正確的TGl菌株，收集噬菌粒，按常規(guī)操作(參照抗體藥物工程，P51)感染表達(dá)菌株大腸桿菌HB2151，培養(yǎng)至0D600nm = 0. 8，加入終濃度ImM的IPTG，30°C誘導(dǎo)過(guò)夜，15% SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的結(jié)果。
6000rpm，4°C離心15min，收集菌體；PBS重懸洗滌菌體一次，采用滲透休克法破碎菌體，即高滲溶液(50mM Tris-HCl，20 %蔗糖，ImM EDTA, pH8. 0)重懸菌體，緩慢攪拌IOmin， 4°C，9000g離心lOmin，倒出上清，用冰冷的5mM MgSO4重懸沉淀，緩慢攪拌10min，4°C， IOOOOg離心20min，將上清與上一步上清合并用于鎳親和層析(購(gòu)自GE)，用不同濃度的咪唑洗滌雜蛋白，洗脫目的蛋白；15% SDS-PAGE檢測(cè)收集的樣品，_20°C保存目的蛋白，命名為E10，其氨基酸序列為SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2，由SEQ ID NO 9相連。
實(shí)施例3抗EGFR單鏈抗體的^festern Blot鑒定
純化得到的ElO進(jìn)行變性SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為15% ;4°C，IOOmA恒流轉(zhuǎn)印 2h，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜(購(gòu)自Millipore)；轉(zhuǎn)印結(jié)束，將膜在5% MTBS (含有5%脫脂牛奶的TBS)中室溫封閉Ih ；用5% MTBS按1 2000稀釋anti-His鼠抗體(購(gòu)自Millipore)， 室溫孵育 lh，TBS 洗滌 3 遍，每次 IOmin ；用 5% MTBS 按 1 5000 稀釋 HRP-anti_Mouse 二抗(購(gòu)自聯(lián)科生物)，室溫孵育lh，TBS洗滌3遍，每次IOmin ；用DAB顯色，結(jié)果如圖7所7J\ ο
實(shí)施例4可溶性單鏈抗體ElO的細(xì)胞ELISA
將表皮癌細(xì)胞A431 (購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))消化，離心后重懸，1 X IO5包被酶標(biāo)板過(guò)夜讓細(xì)胞貼壁12h，分為4組，每組3個(gè)孔。次日，棄培養(yǎng)基，溫PBS洗2次，充分干燥后，每孔加入50 μ 1 PBS配制的0. 25%戊二醛作用10 12min，棄固定液，PBS洗3次，每孔加入300μ1 5%脫脂奶粉(MPBS)4°C過(guò)夜封閉。次日PBS洗3次，按分組要求加入不同濃度抗體或者對(duì)照100 μ 1，37°C孵育2h，以含有0. 05% Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS 洗滌3次。每孔加入100μ 1用5%MPBS 1 2000稀釋的鼠抗His抗體，37°C孵育lh，以含有0.05% Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。加入100 μ 1用5% MPBSl 5000 稀釋的HRP-偶聯(lián)羊抗鼠IgG多克隆抗體，37°C孵育lh，以含有0. 05% Tween20的PBS洗滌3次，再以PBS洗滌3次。每孔加入100 μ 1底物液(100 μ g/mLTMB, IOOmmo 1/L乙酸鈉， pH6. 0，每50mL緩沖液加入10 μ 1 30%過(guò)氧化氫)，室溫孵育IOmin。每孔加入50 μ 1 5% (ν/ν)稀硫酸終止反應(yīng)。測(cè)定OD65t^nOD45tl，以O(shè)D45tl值減去OD65tl值作為最后檢測(cè)結(jié)果。Ρ/Ν =(陽(yáng)性細(xì)胞孔A值-空白孔A值)/(陰性細(xì)胞孔A值-空白孔A值)> 2為陽(yáng)性。
實(shí)施例5抗EGFR單鏈抗體對(duì)表皮癌細(xì)胞Α431的生長(zhǎng)抑制作用
將Α431 細(xì)胞 IXlO4- 2X IO4 接種 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μ 1/ 孔，在 37°C 5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后用0. 5%小牛血清培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。將培養(yǎng)的A431細(xì)胞分為6組， 按照分組要求加入2倍梯度稀釋的E10，繼續(xù)培養(yǎng)48h，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況后每孔加入Ilyl 的MTT，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心傾去上清，每孔加入150 μ 1 DMSO,在酶標(biāo)儀570nm/630nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值(0D值)，計(jì)算細(xì)胞增殖。ElO的生物活性由細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率評(píng)價(jià)。抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)X 100%。權(quán)利要求
1.一種全人源的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，其特征在于抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體包括重鏈可變區(qū)域和輕鏈可變區(qū)域，并且重鏈可變域和輕鏈可變區(qū)域通過(guò)柔性肽連接，重鏈可變區(qū)域的氨基酸序列為SEQ ID NO 1 ；輕鏈可變區(qū)域?yàn)镾EQ ID NO 2的氨基酸序列，柔性肽的氨基酸序列為SSGGGGSGGGGSGGSA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全人源的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，具有重鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO 5 的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，具有輕鏈CDR3域，該域包含SEQ ID NO 8的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種全人源的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有重鏈CDR2域，該域包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDR2域，該域包含SEQ ID NO 7的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的一種全人源的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體，其特征在于所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有重鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO :3的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列；所述的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體具有輕鏈CDRl域，該域包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列，或通過(guò)氨基酸置換或者修飾得到的氨基酸序列。
5.一種分離的核酸，其特征在于，該核酸編碼權(quán)利要求1的一種全人源的抗人表皮生長(zhǎng)因子受體的單鏈抗體。
6.一種表達(dá)載體，含有權(quán)利要求5所述的核酸。
7.—種重組宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的應(yīng)用，其特征在于選擇性地與EGFR 結(jié)合或抑制EGFR與EGFR配體的結(jié)合或中和EGFR。
9.權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)的抗體片段，選自單鏈抗體、Fab、單鏈Fv、雙抗體和三抗體。
10.權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)的抗體或抗體片段的偶聯(lián)物。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程抗體技術(shù)領(lǐng)域，具體地公開(kāi)了一種全人源抗EGFR單鏈抗體E10、其制備方法及用途。本發(fā)明還公開(kāi)了E10的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白分子的氨基酸序列，以及包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)免疫球蛋白分子的氨基酸序列，包括對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)決定區(qū)CDR1、CDR2和CDR3的序列。本發(fā)明還提供產(chǎn)生和表達(dá)E10的方法，從天然人源噬菌體抗體庫(kù)中篩選獲得了一株全人源抗EGFR單鏈抗體E10，后通過(guò)原核細(xì)胞分泌表達(dá)、親和層析純化獲得單鏈抗體。本發(fā)明的單鏈抗體可特異性結(jié)合于人表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)，可以抑制表皮癌細(xì)胞A431的生長(zhǎng)，可應(yīng)用于制備診斷劑和治療劑。
文檔編號(hào)C12N15/13GK102504026SQ201110369620
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者周雅瓊, 張娟, 王旻 申請(qǐng)人:中國(guó)藥科大學(xué)