專利名稱：利用玉米芯木糖渣水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法
技術領域：
本發明涉及一種生產單細胞油的方法，尤其涉及一種利用玉米芯木糖渣水解液 (糖化液)培養隱球酵母(Cryptococcus curvatus)發酵生產單細胞油的方法。
背景技術：
單細胞油脂，又稱微生物油脂，是微生物或藻類以碳水化合物、碳氫化合物和普通油脂為碳源、氮源、輔以無機鹽生產的油脂，其中有些油脂具有高附加值。其脂肪酸組成與植物油脂相似，以C16、C18系脂肪酸為主，如棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸 (C18:l)、亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3)等。微生物油脂可以廣泛應用于食品、醫藥、精細化工等行業。目前，國內外工業用油和食用油脂主要來源于動、植物和化石資源，隨著可耕用土地的日益減少和化石資源的逐漸枯竭以及生物技術的進步，工業用油勢必走向多種渠道開發的途徑。單細胞油脂作為一種新型油脂已經引起人們的廣泛關注。近年來，關于利用蔗糖、糖蜜、乳糖、工業廢液及木質纖維素來生產微生物油脂已經有所報道。劉宏娟等利用兩步水解木質纖維素所得水解液和兩次補料發酵得到單細胞油，趙宗保等也利用玉米秸稈的無機酸或纖維素酶水解液進行單細胞油的生產。但上述實驗所需水解液的獲得需要大量的稀酸等化學試劑，帶來環境問題的同時極大地增加了生產成本。玉米芯經酸水解，利用其中的半纖維素制取木糖醇及低聚木糖等高附加值產品后，廢棄的纖維素殘渣即是木糖渣，脫木素木糖渣為木糖渣經堿處理脫除木素后的殘渣，均為生物煉制過程中產生的廢渣。經檢索，利用木糖渣和脫木素木糖渣水解液培養產油微生物，生產單細胞油的研究還未有報道，因而利用木糖渣及脫木素木糖渣發酵生產單細胞油的方法具有極其重要的實際意義。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種利用玉米芯木糖渣水解液 (糖化液)培養隱球酵母(Cryptococcus curvatus)發酵生產單細胞油的方法。本發明所述利用生物質資源水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法的步驟是(1)糖化液制備取玉米芯木糖渣，以15 35個濾紙酶活單位(FPA)每克干木質纖維素的量添加纖維素酶液，在35 55°C下糖化60 80h ；收集糖化液于75 85°C下水浴30 60min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于7000 IOOOOrpm下離心6 lOmin， 得澄清的糖化液；其中上述玉米芯木糖渣是指脫木素木糖渣或木糖渣；(2)糖化液的脫毒處理將上述糖化液水浴加熱至80°C，再加入其質量百分比為 0. 6 1. 2%的活性炭，攪拌30 50min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；
(3)利用糖化液發酵隱球酵母以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus)以體積百分比為4 10%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30士2°C、200士50rpm，搖床震蕩培養 60 80h，得含單細胞油的發酵液；(4)單細胞油粗提將步驟(3)的發酵液于7000 9000rpm下離心8 15min 收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 4次；以酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HCl，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油。上述步驟(1)所述的纖維素酶酶液是商品纖維素酶或是任何能產生纖維素酶的菌種所產生的纖維素酶。商品纖維素酶可以是液體酶，也可以是固體酶粉。纖維素酶的制備方法是纖維素酶產生菌(例如青霉屬、木霉屬或曲霉屬菌株)按常規量接種于纖維素酶產酶培養基中，在觀 30°C，搖床轉速200 300rpm下，產酶發酵96 120小時，然后將所有發酵物在5000 lOOOOr/min的轉速下離心15 40min，收集上清液即獲得纖維素酶粗酶液。上述步驟(1)所述纖維素酶添加量優選20 30個濾紙酶活單位每克干木質纖維素，糖化溫度優選40 50°C，糖化時間優選70 80h。上述步驟⑵所述活性炭的質量百分比優選為0. 8 1. 0%，攪拌時間優選30 35min。上述步驟( 所述隱球酵母的培養條件優選是30°C、200rpm搖床震蕩培養65 75h。上述步驟(4)所述發酵液優選于8000rpm下離心IOmin收集菌體。本發明提供一種利用玉米芯木糖渣水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法，較現有技術中利用玉米秸稈的無機酸或纖維素酶水解液進行單細胞油生產的方法，具有工藝簡便、成本較低、無污染、油脂產量高的特點。顯著克服了上述實驗所需水解液的獲得需要大量的稀酸等化學試劑帶來的環境污染問題，同時極大地降低了生產成本。本發明方法中利用的生物質資源具有原料豐富、價格低廉、加工方便的優勢，可顯著降低單細胞油的生產成本，更重要的是生物質資源的充分利用，處理了農業廢料，對改善我國能源緊缺狀況，保障我國能源可持續供給，緩解能源危機具有重要的實際意義和重要的經濟價值。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明內容作進一步的說明。實施例1(1)纖維素酶液的制備將斜臥青霉(Penicillium decumbens) JU-AlO以常規量接種于產酶培養基中，300C，250rpm下震蕩培養產酶，6000rpm下離心30min，收集上清液即為纖維素酶粗酶液；上述產酶培養基配方為20g/l木糖渣，30g/l麩皮，6g/l微晶纖維素，5g/l豆餅粉，2g/l硫酸銨，lg/Ι尿素，2g/l硝酸鈉，3g/l磷酸二氫鉀，0. 5g/l硫酸鎂，3ml/l吐溫80 ；(2)糖化液制備取脫木素木糖渣，以25個FPA每克干底物添加纖維素酶液，在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于 8000rpm下離心lOmin，得澄清的糖化液；(3)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(4)利用糖化液發酵隱球酵母以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus)以6%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養72h，得含單細胞油的發酵液；(5)單細胞油粗提發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 次；酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g 濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；實驗結果斜臥青霉粗酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖的濃度達到了 49g/l，在未經脫毒處理的產油糖化液培養基中的隱球酵母的菌體干重達到了 15. OOg/Ι，單細胞油達到了 6. 14g/l，油脂含量為40. 92%。在脫毒后產油糖化液培養基中，隱球酵母菌體干重和單細胞油分別達到了 15. 16g/l和6. 18g/l，油脂含量為40. 73%。實施例2(1)纖維素酶液的制備將斜臥青霉以常規量接種于產酶培養基中，30°C，250rpm 下震蕩培養84h產酶，6000rpm下離心30min，收集上清液即為纖維素酶粗酶液；上述產酶培養基配方為20g/l木糖渣，30g/l麩皮，6g/l微晶纖維素，5g/l豆餅粉，2g/l硫酸銨，lg/Ι尿素，2g/l硝酸鈉，3g/l磷酸二氫鉀，0. 5g/l硫酸鎂，3ml/l吐溫80 ；(2)糖化液制備取脫木素木糖渣，以30個FPA每克干底物添加纖維素酶液，在 45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于 9000rpm下離心8min，得澄清的糖化液；(3)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(4)利用糖化液發酵隱球酵母以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus)以8%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養75h，得含單細胞油的發酵液；(5)單細胞油粗提發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 次；酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g 濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；實驗結果斜臥青霉粗酶液酶解脫木素木糖渣所得的糖化水解液的葡萄糖的濃度達到了 52g/l.經過80h的培養，隱球酵母在產油糖化液培養基中的菌體干重達到了 16. 30g/l，油脂含量為42. 92%，單細胞油產量達到了 7. 00g/l。
實施例3(1)糖化液制備取脫木素木糖渣，以25個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于青島康地恩生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 05M HAC-NaAc緩沖液在45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于8000rpm下離心lOmin，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液發酵隱球酵母以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus 03)以8%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養72h，得含單細胞油的發酵液；(4)單細胞油粗提發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 次。酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g 濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油； 實驗結果在pH4. 8的0. 05M HAC-NaAc緩沖液中，康地恩酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖濃度達到了 Mg/Ι。用于隱球酵母的培養時，隱球酵母的菌體干重達到了 23. 43g/ 1，油脂含量達到了 46. 74 %，單細胞油產量達到了 10. 95g/l。實施例4(1)糖化液制備取脫木素木糖渣，以20個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于青島康地恩生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc緩沖液在45°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于9000rpm下離心8min，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液發酵隱球酵母以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus)以6%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養65h，得含單細胞油的發酵液；(4)單細胞油粗提發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 次。酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HCl，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g 濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；實驗結果在pH4. 8的0. 2M HAC-NaAc緩沖液中，康地恩纖維素酶酶解脫木素木糖渣所得糖化液的葡萄糖的濃度達到了 56g/l。用于隱球酵母的培養時，隱球酵母的菌體干重達到了 17. 36g/l，油脂含量達到了 44. 35%，單細胞油產量達到了 7. 70g/l。實施例5 (1)糖化液制備取脫木素木糖渣，以25個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于杰能科生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 05M HAC-NaAc緩沖液在
645°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于 8000rpm下離心lOmin，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液發酵隱球酵母以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus 03)以6%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養72h，得含單細胞油的發酵液；(4)單細胞油粗提發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 次。酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g 濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；實驗結果在pH4. 8的0. 05M HAC-NaAc緩沖液中，杰能科酶液酶解得到的糖化液的葡萄糖濃度達到了 52g/l。用于隱球酵母的培養時，隱球酵母的菌體干重達到了 15. 31g/ 1，油脂含量達到了 40. 21%，單細胞油產量達到了 6. 16g/l。實施例6(1)糖化液制備取木糖渣，以20個FPA每克干底物添加商品化纖維素酶液(來源于杰能科生物技術有限公司)，緩沖體系為PH4. 8的0. 2M HAC-NaAc緩沖液在50°C下糖化72h ；收集糖化液于80°C下水浴30min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于9000rpm下離心8min，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脫毒處理將糖化液水浴加熱至80°C，加入其質量百分比為1. 0%的活性炭，攪拌30min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液發酵隱球酵母以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus 03)以7%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30°C、200rpm，搖床震蕩培養65h，得含單細胞油的發酵液；(4)單細胞油粗提發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 次。酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g 濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油；實驗結果在pH4. 8的H2O緩沖液中，杰能科酶液酶解脫木素木糖渣所得糖化液的葡萄糖的濃度達到了 51g/l。用于隱球酵母的培養時，隱球酵母的菌體干重達到了 17. 86g/ 1，油脂含量達到T 37. 35 %，單細胞油產量達到T 6. 67g/l。
權利要求
1.一種利用玉米芯木糖渣水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法，步驟是(1)糖化液制備取玉米芯木糖渣，以15 35個濾紙酶活單位(FPA)每克干木質纖維素的量添加纖維素酶液，在35 55°C下糖化60 80h ；收集糖化液于75 85°C下水浴 30 60min使殘余纖維素酶失活，然后將糖化液于7000 IOOOOrpm下離心6 lOmin，得澄清的糖化液；(2)糖化液的脫毒處理將上述糖化液水浴加熱至80°C，再加入其質量百分比為0.6 1. 2%的活性炭，攪拌30 50min，然后真空抽濾去除活性炭，得脫毒的糖化液；(3)利用糖化液發酵隱球酵母以脫毒的糖化液、4g/l酵母粉的配方制備產油糖化液發酵培養基，將活化好的隱球酵母(Cryptococcus curvatus)以體積百分比為4 10%的接種量接種于產油糖化液發酵培養基中，于30士2°C、200士50rpm，搖床震蕩培養60 80h， 得含單細胞油的發酵液；(4)單細胞油粗提將步驟(3)的發酵液于7000 9000rpm下離心8 15min收集菌體，蒸餾水清洗菌體3 4次；以酸熱-有機試劑法提取單細胞油，即以3g濕菌體IOml 的比例加入4M HC1，渦旋混合后，沸水浴60min，再冰水浴30min ；然后按3g濕菌體5ml的比例加入無水乙醇，按3g濕菌體15ml的比例加入乙醚，震蕩后再按3g濕菌體15ml的比例加入石油醚，振蕩放氣，收集有機試劑層，烘干揮發去除有機試劑后得單細胞油。
2.如權利要求1所述利用玉米芯木糖渣水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法，其特征在于步驟(1)所述纖維素酶添加量為20 30個濾紙酶活單位每克干木質纖維素，糖化溫度為40 50°C，糖化時間為70 80h。
3.如權利要求1利用玉米芯木糖渣水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法，其特征在于步驟(2)所述活性炭的質量百分比為0. 8 1. 0%，攪拌時間為30 35min。
4.如權利要求1利用玉米芯木糖渣水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法，其特征在于步驟(3)所述隱球酵母的培養條件是30°C、200rpm搖床震蕩培養65 75h。
5.如權利要求1利用玉米芯木糖渣水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法，其特征在于步驟(4)所述發酵液于SOOOrpm下離心IOmin收集菌體。
全文摘要
本發明公開了一種利用玉米芯木糖渣水解液培養隱球酵母生產單細胞油的方法，較現有技術中利用玉米秸稈的無機酸或纖維素酶水解液進行單細胞油生產的方法，具有工藝簡便、成本較低、無污染、油脂產量高的特點；顯著克服了上述實驗所需水解液的獲得需要大量的稀酸等化學試劑帶來的環境污染問題，同時極大地降低了生產成本。本發明對生物質資源的大量利用，處理了農業廢料，對改善我國能源緊缺狀況，保障我國能源可持續供給，緩解能源危機具有重要的實際意義和重要的經濟價值。
文檔編號C12P7/64GK102392058SQ201110403848
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月7日 優先權日2011年12月7日
發明者宋欣, 馬曉靜 申請人:山東大學