專利名稱：適用于三個轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于三個轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
基因工程技術(shù)的出現(xiàn)和應(yīng)用為農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域開辟了一個全新的發(fā)展時代。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品越來越進入人們的生活，據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用署(ISAAA)的最新資料表明， 自1996年到2010年，全球的轉(zhuǎn)基因作物種植總面積增加了 87倍，達(dá)到了 I. 48億公頃。目前，世界各國進行田間試驗的轉(zhuǎn)基因作物超過5000種，批準(zhǔn)商品化的轉(zhuǎn)基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、棉花、番茄、馬鈴薯、甜椒、西葫蘆、木瓜等，其中轉(zhuǎn)基因大豆種植面積居第二位，達(dá)到了 9000萬英畝。隨著遺傳改良作物的廣泛種植，轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)風(fēng)險，可能帶來的環(huán)境問題、轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品作為食品、飼料對人類及動物的可能帶來健康問題、 國際貿(mào)易問題、知識產(chǎn)權(quán)問題等已引起世界性的廣泛關(guān)注，國際組織和國家紛紛制定相應(yīng)的安全管理法規(guī)，加強遺傳改良作物的規(guī)范管理，并對遺傳改良作物及其產(chǎn)品實施標(biāo)識制度。我國于2001年5月9日公布并實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，并在2002年I 月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、標(biāo)示和進口安全管理三個配套管理辦法。為了應(yīng)對遺傳改良作物管理相關(guān)的法律法規(guī)和制度，建立高效、快速、特異的檢測技術(shù)十分必要，它是各國際組織和國家管理遺傳改良作物的有力技術(shù)支撐。目前已經(jīng)發(fā)展并廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測方法有兩類一類是基于核酸水平的檢測，另一類是基于蛋白質(zhì)水平的免疫學(xué)檢測。基于核酸的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測技術(shù)因具有高靈敏度和特異性強的優(yōu)點，已成為目前最重要、應(yīng)用最廣泛的遺傳改良作物及其產(chǎn)品檢測技術(shù)。目前基于核酸的檢測技術(shù)中，最常用的檢測方法之一是定性PCR技術(shù)。通過對樣品中可能含有的外源基因進行擴增，再利用瓊脂糖電泳進行鑒定，如果電泳結(jié)果含有特異的條帶，說明樣品中含有轉(zhuǎn)基因成分；反之則沒有。轉(zhuǎn)基因PCR檢測方法建立時，應(yīng)設(shè)置陰性對照、陽性對照和空白對照，以確保檢測過程的有效和檢測結(jié)果的可靠性。陽性對照是指由陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)即特定的轉(zhuǎn)基因作物中提取的DNA作為PCR反應(yīng)體系的模板得到的結(jié)果。由于轉(zhuǎn)基因作物存在生物安全性的問題，所以有些轉(zhuǎn)基因作物的陽性樣品很難獲得。目前，用于轉(zhuǎn)基因檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要是用純合的轉(zhuǎn)基因植物材料配置的，位于比利時的歐盟聯(lián)合研究中心下屬的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與測量研究所(Institute for Reference Materials and Measurements, IRMM)專業(yè)配制和提供用于轉(zhuǎn)基因定量PCR檢測的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。到目前為止在市場上銷售打的遺傳改良作物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)僅有十幾種。但這類來源于農(nóng)產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其必須有專門的研究機構(gòu)來制備，貯存和測定過程受很多因素影響，很難維持恒定的量，而且，這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的轉(zhuǎn)基因含量范圍一般是從O. 1%到5%，而實際檢測的樣品中的轉(zhuǎn)基因含量可能會超出這個范圍。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏已成為檢測方法建立和應(yīng)用的瓶頸，阻礙了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識制度的順利實施。為了解決這個問題，國內(nèi)外科研機構(gòu)做了大量的研究工作。目前，以質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在國際轉(zhuǎn)基因檢測中得到了公認(rèn)。質(zhì)粒分子的優(yōu)點主要是可以通過微生物進行大量培養(yǎng)，純度較高；且操作容易，穩(wěn)定性高，同一個標(biāo)準(zhǔn)分子可以同時包含多個外源目的基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，經(jīng)濟高效。近年來，越來越受到各國轉(zhuǎn)基因檢測專家和學(xué)者們的重視，并逐漸取代傳統(tǒng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品用于轉(zhuǎn)基因品系及其加工產(chǎn)品的PCR檢測。目前全世界有10多個轉(zhuǎn)基因大豆品系進入商品化種植，其中包括孟山都公司開發(fā)的GTS40-3-2，先鋒公司開發(fā)的DP-356043和DP-305423。我國雖然不種植轉(zhuǎn)基因大豆， 但每年都進口幾千萬噸轉(zhuǎn)基因大豆用于食品或飼料的加工原料。迄今為止，還沒有同時適用于以上三種轉(zhuǎn)基因大豆檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的報道。為了給中國轉(zhuǎn)基因大豆品系監(jiān)管提供必要的技術(shù)支撐，有必要開發(fā)適用于以上三種轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的、穩(wěn)定可靠的通用型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種適用于三個轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子；本發(fā)明的目的在于提供可同時適用于轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-356043、 DP-305423、GTS40-3-2品系特異性檢測的通用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其包含以下序列片段DP-356043品系特異性片段、DP-305423品系特異性片段、GTS40-3-2品系特異性序列和大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin 的特異序列片段。所述的DP-356043的品系特異性序列，指的是轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-356043的外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的DNA序列如SEQ ID NO: I所示。所述的DP-305423的品系特異性序列，指的是轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-305423的外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的DNA序列如SEQ ID N0:2所示。所述的GTS40-3-2的品系特異性序列，指的是轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2的外源插入載體與大豆基因組鄰接區(qū)的DNA序列如SEQ ID N0:3所示。所述大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性片段，指的是大豆凝集素基因片段，其DNA 序列如SEQ ID N0:4所示。所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的骨架質(zhì)粒是pMD18-T。所述的用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其中用于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的引物序列如下(表I)
表I構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的PCR引物
權(quán)利要求
1.一種適用于三個轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其特征在于其序列如 SEQ ID No: 19 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的一種適用于三個轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟①以轉(zhuǎn)基因大豆品系DP-356043、DP-305423、GTS40-3-2基因組DNA為模板進行PCR 擴增；反應(yīng)體系為總體積為50 μ 1，其中10倍的PCR反應(yīng)液5 μ 1，dNTPs 4μ I,上下游引物 20 μ M 各 I μ 1，模板 5 μ 1，Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ I，用 ddH20 補足至 50 μ I ；反應(yīng)程序為94°C 5分鐘；然后進入以下循環(huán)94°C 50秒，60_55°C 50秒，72°C 60 秒，共30個循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘；產(chǎn)物記為=Pdp356043 SEQ ID No: 13、Pdp305423 SEQ ID No: 14、Pgts4q SEQ ID No: 15、PLectin SEQ ID No: 16;②利用重疊延伸PCR將Ρ Ρ356043 與 Ρ Ρ305423 相連接，分兩步進行擴增第一步取 Pdp356043 與 Pdp3q5423 各 5 μ 1，10 倍的 PCR 反應(yīng)液 5 μ 1，dNTPs 4 μ I, Taq DNA 聚合酶0.5 μ 1，用ddH20補足至50μ I ;反應(yīng)程序為94°C 5分鐘，然后進入以下循環(huán)94°C I分鐘，60°C 4分鐘，共7個循環(huán)； 第二步取10倍的PCR反應(yīng)液5 μ 1，dNTPs 4 μ 1，Taq DNA聚合酶O. 5 μ 1，第一步的反應(yīng)產(chǎn)物 50 μ I，引物 DP356-F I μ I，引物 DP305-R I μ I，用 ddH20 補足至 100 μ I ；反應(yīng)程序為94°C 5分鐘；然后進入以下循環(huán)94°C I分鐘，55°C 2分鐘72°C 2分鐘廿O0個循環(huán)；最后72°C延伸5分鐘；產(chǎn)物記為PDP356043+DP305423 SEQ ID N0 17 ； 利用重疊延伸PCR將Ρ Ρ356043+ Ρ305423 與 P GTS40 相連接，分兩步進行擴增第一步'Μ PDP356043+DP305423 與 P GTS40 各 5 P 1，10 倍的 PCR 反應(yīng)液 5μ I, dNTPs 4 U I, TaQ DNA聚合酶O. 5 μ I，用ddH20補足至50 μ I ;反應(yīng)程序為94°C 5分鐘，然后進入以下循環(huán)94°C I分鐘，60°C 4分鐘，共7個循環(huán)； 第二步取10倍的PCR反應(yīng)液5 μ 1，dNTPs 4 μ 1，Taq DNA聚合酶O. 5 μ 1，第一步的反應(yīng)產(chǎn)物 50 μ I，引物 DP356-F I μ I，引物 GTS40-R I μ I，用 ddH20 補足至 100 μ I ；反應(yīng)程序為94°C 5分鐘；然后進入以下循環(huán)94°C I分鐘，55°C 2分鐘72°C 2分鐘，共 30 個循環(huán)；最后 72°C 延伸 5 分鐘；產(chǎn)物記為PDP356043+DP305423+GTS40 SEQ ID N0: 18 ;④將PDP356043+DP305423+GTS40和Pectin克隆進pMD18_T載體，分兩步進行第一步用限制性內(nèi)切酶 B— I 和 I 將 PDP356Q43+DP3Q5423+(；TS4Q SEQ ID No: 18 和 PMD18-T載體分別進行雙酶切；然后用T4連接酶將二者連接，獲得含有PDP356Q43+DP3Q5423+CTS4。片段的pMD18-T重組質(zhì)粒；第二步用限制性內(nèi)切酶I和I將P^tin片段SEQ ID No: 16和含有PDP356043+DP305423+GTS40 片段的PMD18-T重組質(zhì)粒分別進行雙酶切；然后用T4連接酶將二者連接；獲得將轉(zhuǎn)基因大豆品系GTS40-3-2、DP-356043、DP-305423品系特異性序列片段及大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin特異性片段融合在pMD18-T上的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，將其命名為pGDP，其序列如SEQ ID No: 19所示，將p⑶P轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109即可長期保存使用。
3.如權(quán)利要求2所述的一種適用于三個轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建方法，其特征在于所述的引物序列如下DP356-F CGGGATCCAACGGATTTGGACCATTGCGTC SEQ ID NO:5DP356-R GTAATTGTTAATGCTTCGGAAGSEQ ID NO:6DP305-F CGAAGCATTAACAATTACACATAATTTTGAAAGATGATTAATG SEQ ID NO:7 DP305-R CAATAAGTTATTTCTAGTACAAAGCTTATATATGCCTTCCGSEQ ID NO:8GTS40-F TACTAGAAATAACTTATTGCATTTCATTC GTS40-R CGGAATTCCTGCTAGAGTCAGCTTGTCAGSEQ ID NO:9 SEQ ID NO:10LN-F AACTGCAGAAGGCAAACTCAGCGGAAAC LN-R CGGGATCC AGTGTCAAACTCAACAGCGACSEQ ID NO:11 SEQ ID NO:12t
4.如權(quán)利要求I所述的一種適用于三個轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在檢測轉(zhuǎn)基因大豆DP-356043品系、DP-305423品系和GTS40-3-2品系中作為陽性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于三個轉(zhuǎn)基因大豆品系特異性檢測的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，具體構(gòu)建了同時適用于轉(zhuǎn)基因大豆DP-356043、DP-305423、GTS40-3-2的品系特異性檢測的通用型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其包含轉(zhuǎn)基因大豆DP-356043、DP-305423、GTS40-3-2的品系特異性序列和大豆內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因Lectin的特異性片段，對所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子在轉(zhuǎn)基因大豆PCR檢測中的適用性進行了驗證表明，所述的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子高度特異于上述三個轉(zhuǎn)基因大豆品系的檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102586309SQ20121005990
公開日2012年7月18日 申請日期2012年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月8日
發(fā)明者李文華, 楊正友, 田園, 趙鳳春 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)