專利名稱：培養基中含腐植酸鈉飼料用枯草芽孢桿菌生物制劑的生產的制作方法
技術領域：
本發明涉及微生物生物制劑，具體的說是一種培養基中含腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑的生產方法。
背景技術：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),是芽孢桿菌屬的一種，單個細胞0.7 0.8X2 3微米，革蘭氏陽性菌，無莢膜，周生鞭毛，能運動。芽孢大，橢圓到柱狀，0.6
0.9X1.0 1.5微米，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙，污白色或微黃色，在液體培養時，常形成皺醭。枯草芽孢桿菌具有繁殖速度快、耐高溫、耐酸堿、耐擠壓、穩定性能好、應用范圍廣等特點，在現代分子遺傳學的科研探索中常作為模式菌株，在現實的生產實踐中廣泛應用于食品工業、飼料工業、水產養殖、環境保護和保健醫藥等諸多方面；因此，愈來愈受到科技工作者和企業界人士的重視。枯草芽孢桿菌菌體及其分泌物中含有豐富的蛋白質、氨基酸、有機酸、維生素、不飽和脂肪酸、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和肽類抗生素等生物活性物質。因此，在畜禽養殖和水產養殖中均有較高的應用價值 。在以往研究中，科技工作者對枯草芽孢桿菌的分類學地位、生理生化特征、發酵條件及其調控等方面均有深入研究。近年來，對枯草芽孢桿菌應用研究也取得很大的進展。但對飼料用高濃度枯草芽孢桿菌發酵技術報道的并不多，對培養基含腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑的研制與生產未并見報道。本發明采用枯草芽孢桿菌菌株，經一級固體種子培養，液體二級種子發酵培養，采用含有腐植酸鈉的固體培養基進行有氧發酵，再經調整培養條件出芽孢處理，干燥、粉碎，生產出培養基含腐植酸鈉、飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑產品。此工藝設計和生產尚屬國內和國際首創。腐植酸鈉是大分子有機物質，主要是羥基、酚羥基、甲氧基、醌基等。綜合各項報道，腐植酸應用在畜禽飼料中可對腸道炎性物和有毒物質進行吸附，對腸粘膜起保護作用；可抑制和殺滅腸道致病菌，提高飼料的利用率，并有止血止痛作用；可吸附糞便中的氨氣、硫化氫，減輕糞便的臭味；腐植酸鈉資源廣泛、價格低廉、無藥物殘留，沒有任何配伍禁忌，利于環保。但腐植酸的活性基團常被雜質所封閉，幾乎不能發揮作用，通過發酵處理可以大大提高其生物學活性。將腐植酸鈉作為芽孢菌制劑培養基使用，必將提升制劑生物效能。本發明產品功能是:1.利用芽孢菌產酶能力強的特點，提高飼料利用率；2.芽孢菌進入胃腸后，經過復蘇增殖，可消耗腸道氧，有利于乳酸、雙歧等厭氧益生菌發揮作用；
3.腐植酸鈉經微生物發酵后，生物活性增強，對芽孢菌作用具有增效性；4.芽孢菌進入后腸后甚至排除體外后還能發揮作用，可顯著改善養殖環境。培養基中含腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑產品無毒、無害、無任何副作用，是一種綠色的微生物制劑添加劑，具有廣闊的市場前景。目如,在畜禽養殖和水廣養殖中，提聞蛋白質利用率，減少抗生素使用是急需解決的問題。而本發明恰恰非常有助于解決上述兩個問題或難題。產品已在廣東、湖北、江蘇、河北、山東、北京、沈陽、大連等地區廣泛應用，取得了很好的經濟效益和社會效益。

發明內容
本發明目的在于提供一種培養基中含腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑的生產方法。為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:以枯草芽孢桿菌為菌株，經一級固體種子培養，二級液體種子發酵，生產出枯草芽孢桿菌種子液。以葡萄糖、腐植酸鈉、豆柏、玉米、麥麩等為主要培養基，將種子液接種于培養基上進行三級固體有氧發酵，之后調整培養條件進行出芽孢處理，再經干燥，粉碎，生產出含枯草芽孢桿菌(Cfu) ^ 200億個/g，pH值
5.6 6.6，水分< 10%，粒度彡100目，色澤呈現特有的淺灰色或灰黑色、保質期18個月的生物制劑產品。一種培養基中含腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑的生產方法，包括如下步驟:I)單菌落種子純化與優選:將枯草芽孢桿菌斜面菌種，在盛有細菌培養基的培養皿上涂布，經培養，得到枯草芽孢桿菌單菌落種子；2) 一級固體種子培養:將步驟I)中得到的單菌落種子接種到200ml茄形瓶，經培養，得到一級固體種子；3)液體發酵培養二級種子:將步驟2)中得到的茄形瓶種子接種到發酵罐液體培養基中，一個茄形瓶與液體培養基的接種比例為I瓶:200公斤。經培養得到二級液體種子。得到的發酵液體種子標準為:顏色正常，無異味，芽孢占總菌數20%以上，pH 6.0
6.5,菌體大小為0.7 0.8 X 2 3 μ m,芽抱0.6 0.9 X 1.0 1.5 μ m,含枯草芽抱桿菌(cfu) > 200 億個/ml。4)三級固體發酵料有氧發酵:將步驟3)中得到的二級液體種子接種到固體發酵料中，經通風供氧，發酵培養，得到經培養的固體發酵料。5)出芽孢處理:將步驟4)中得到的固體發酵料進行出芽胞處理，即停止通風供氧，將其攤開、翻倒，降低溫度和濕度，促使固體發酵料中含有的枯草芽孢桿菌形成芽孢。6)干燥與粉碎處理:對步驟5)得到的形成了芽胞的固體發酵料進行烘干處理，通過粉碎，生產出含枯草芽孢桿菌(cfu) > 200億個/g的含發酵腐植酸鈉的飼料用高濃度枯早牙抱桿囷生物制劑廣品。上述枯草芽孢桿菌培養過程中，步驟I)和2)所采用的枯草芽孢桿菌固體種子培養基的重量組成為:葡萄糖0.8 1.2%、蛋白胨0.8 1.2%、牛肉膏0.3 0.6%、氯化鈉
0.03 0.07%、硫酸鎂0.03 0.07%、磷酸氫二鉀0.05 0.15%、余量為純凈水、pH6.8
7.2、瓊脂 1.5 2.2% ;滅菌條件:0.08MPa、115°C、18min ； 培養溫度:28 °C 32 °C，時間為48 72h。上述枯草芽孢桿菌培養過程中，步驟3)所采用的枯草芽孢桿菌種子發酵培養基的重量組成為:葡萄糖0.5 1.5 %、蛋白胨0.2 0.8 %、酵母粉0.2 0.8 %、玉米面
1.0 3.0%、豆柏1.0 3.0%、硫酸銨0.1 0.3%、氯化鈉0.03 0.07%、硫酸鎂0.03 0.07%、磷酸氫二鉀0.05 0.15%、余量為純凈水、pH6.8 7.2 ;滅菌條件:0.lMPa、121°C、20min ;發酵培養條件:罐壓0.01 0.1OMpa,通氣量0.5 1.0V/V.min、轉速100-200rpm、溫度 28。。 34°C、時間為 48 72h ；上述步驟4)所述固體發酵料有氧發酵過程中，固體發酵料中各種原料重量比例為:葡萄糖I 3份、腐植酸鈉10 40份、豆柏10 20份、玉米面10 20份、麩皮50 70份；液體二級種子與固體發酵料混合的重量比例分別為:①30: 100、②40: 100、③50: 100;發酵培養條件:通氣量0.5 1.0V/V*min、發酵溫度50°C 60°C、發酵時間48 64h。步驟5)所述出芽孢處理中:需對經培養的固體發酵料，停止通風供氧，將其攤開、翻倒。出芽孢處理條件:溫度20°C 30°C、含水量20 30%、時間24 48h ；步驟6)將步驟5)所述含有芽胞的固體發酵料進行干燥處理與粉碎，干燥處理條件為:采用干燥爐進行干燥，干燥爐內溫度60°C 80°C、干燥爐出口溫度38°C 42°C、時間8 IOmin ；

粉碎處理條件為:在無菌潔凈條件下進行，粉碎后粒度80 120目、含水量8 15%、含枯草芽孢桿菌(cfu) 200 220億個/g。較佳方案如下: 所采用的枯草芽孢桿菌種子培養基的重量組成為:葡萄糖1.0 %、蛋白胨1.0 %、牛肉膏0.5.%、氯化鈉0.05%、硫酸鎂0.05%、磷酸氫二鉀0.1 %、余量為純凈水、pH7.0、瓊月旨2.0%。滅菌條件:0.08MPa> 115°C > 18min ；培養溫度:30°C，時間為48h。所采用的枯草芽孢桿菌二級種子發酵培養基的重量組成為:葡萄糖1.0%、蛋白胨0.5 %、酵母粉0.5%、玉米面2.0 %、豆柏2.0 %、硫酸銨0.2kg %、氯化鈉0.05 %、硫酸鎂0.05%、磷酸氫二鉀0.10%、余量為純凈水、pH7.0。滅菌條件:0.1MPa、121°C、20min ;發酵培養條件:罐壓0.05Mpa、通氣量0.5V/V.min、轉速lOOrpm、培養溫度30°C、時間為48h。所采用的固體發酵料有氧發酵過程中，固體發酵料中各種原料重量比例為:葡萄糖2份、腐植酸鈉30份、豆柏10份、玉米面10、麩皮50份；液體種子與固體發酵料混合的重量比例40: 100。發酵培養條件為:通氣量0.5V/V.min、發酵溫度50°C、發酵時間48。所采用的固體發酵料出芽孢處理中，需對經培養的固體發酵料停止通風供氧，將其攤開、翻倒。出芽孢處理條件為:溫度20°C、含水量20、時間48h ；所述含有芽胞的固體發酵料進行干燥處理與粉碎中，采用干燥爐進行干燥，干燥處理條件為:干燥爐內溫度60°C、干燥爐出口溫度:38°C、時間Smin ；粉碎處理條件為:在無菌潔凈條件下進行，粉碎后粒度100目、含水量10%、含枯草芽孢桿菌(cfu) 200億個/g。
用平板計數法檢查，培養基中含發酵腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑產品，含枯草芽孢桿菌(cfu) ^ 200億個/g。所述的培養基中含腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑產品，可作為水產、畜禽養殖中的優質生物餌料添加劑，也可作為海水、淡水的水質凈化劑應用。本發明具有如下優點:本發明具有菌種選擇適當、工藝新、菌數高、產物多、適應性廣、效果可靠、有益于環境等突出的特點。1.菌種選擇適當、繁殖速度快、產物多。枯草芽孢桿菌株來源非常廣泛，在陸地和海洋均廣泛存在，并具有自身突出的特點，I)繁殖速度快:枯草芽孢桿菌的生長代時為18分鐘，在發酵過程中2個小時就能達到對數生長期，24小時就能到菌數繁殖高峰，48小時發酵達到終點，調整好碳 氮比例，菌數(cfu)可達200億個/ml以上。2)營養豐富，能分泌和代謝大量的蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等酶類產物，富含各種氨基酸、有機酸和抗菌肽。3)抗逆性強:耐高溫，變成芽孢后，可以長時間耐受60°C以上的高溫，忍耐80度20分鐘，甚至是瞬間100°C高溫，仍可存活率90%以上。耐酸堿，可適應pH 2 9的酸堿范圍。在一般詞料生廣擠壓顆粒過程中，存活率保持在90%以上。4)穩定性能好，耐長期儲存，在各種應用現場條件下，存活不受太大影響。在室溫、密封、避光條件下，可以保質18個月以上。2.工藝新、產品質量好。本發明以枯草芽孢桿菌為生產菌株,經一級固體種子培養，二級液體種子發酵，三級固體發酵料有氧發酵，再經調整培養條件出芽孢處理，干燥、粉碎，生產出培養基中含腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑產品，生產工藝尚屬國內和國際首創。通過本項目涉及的技術措施可保證生產出培養基中含發酵腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑，并使產品的芽孢數(cfu)達到200億個/g以上。本發明所采用的生產原材料組成簡單、來源廣泛，價格低廉，而且采用腐植酸鈉為培養基組分，具有特殊外觀特征并可強化功效。3.適應性廣、應用效果可靠。本發明生產的產品可應用于全價料、濃縮料、預混料等各類飼料生產，也可在養殖場直接添加飼喂，在水產養殖和畜禽養殖中應用廣泛。大量的生產實踐證明:在海參養殖中應用，可以增強免疫力和抗病力，降低水體中氨氮含量，凈化水質，延長附著基換倒時間5 7天，提高海參產量10.9%。在蛋禽養殖中應用，可以增強幼禽免疫力，降低死淘率1.8%，提高產蛋率2.02%。在仔豬和育肥豬養殖中應用，可以防治仔豬黃白痢，提高育肥豬增重速度，減少抗生素使用量。4.改善養殖環境、有益于生態。枯草芽孢桿菌能夠廣泛利用碳源和氮源，在海參的養殖中，能利用水體小分子含氮化合物、剩余的含氮餌料和海參糞便等，可促進養殖池底有機物含氮化合物的降解，可使水產養殖池水體中的氨氮、硫化氫下降，使C0D、B0D值和pH值等項指標達到正常，凈化水質，提高溶解氧，改善養殖環境，提高海參產量。在畜禽養殖中應用，能減輕養殖環境中糞便的氨氣味，可以明顯改善養殖環境，有益于生態。5.培養基中含發酵腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑產品,營養成份全、無毒副作用，安全性好。在飼料中使用，可增強免疫力，提高成活率，促進生長發育，提升畜禽水產品品質。
具體實施方式
對枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)單菌落進行純化、并經固體一級種子培養、液體二級發酵培養、三級固體發酵料有氧發酵培養、出芽孢處理，干燥與粉碎等過程，可生產出含培養基中含發酵腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑產品。具體操作步驟如下:實施例1:I)單菌落純化與優選:將枯草芽孢桿菌斜面菌株，在盛有細菌培養基的培養皿上涂布，經培養，得到枯草芽孢桿菌單菌落種子。2) 一級固體種子培養:將步驟I)中得到的單菌落種子，挑出單菌落接種到一級固體種子培養基中，固體種子培養瓶為200ml茄形瓶，裝量為50ml固體培養基，經培養，得到一級固體種子；3)單菌落純化與一級固體種子培養基的優選在實驗室條件下，進行培養因子的優選試驗，試驗設計為6因素3水平，試驗設計和試驗結果如下表1:表1.枯草芽孢桿 菌一級固體種子培養基配方試驗
權利要求
1.一種培養基中含腐植酸鈉飼料用枯草芽孢桿菌生物制劑的生產方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)單菌落種子純化與優選:將枯草芽孢桿菌斜面菌種，在裝有細菌培養基的培養皿上涂布，經培養，得到枯草芽孢桿菌單菌落種子； 2)一級固體種子培養:將步驟I)中得到的單菌落種子，挑出單菌落接種到一級固體種子培養基中，固體種子培養瓶為200ml茄形瓶，裝量為固體培養基50ml，經培養，得到一級固體種子； 3)二級液體種子發酵培養:將步驟2)中得到的一級固體種子(茄形瓶菌種)接種到二級發酵罐液體培養基中，一級固體種子與二級發酵罐液體種子培養液的接種量為:一級固體種子與I噸發酵罐(裝液量70% )接種比例為I瓶:200公斤，經培養，得到二級液體種子； 4)三級固體發酵料有氧發酵:將步驟3)中得到的二級液體種子接種到固體發酵料中，二級液體種子與固體發酵料混合的重量比例為40: 100;經通風供氧，發酵培養，得到經培養的固體發酵料； 5)出芽孢處理:將步驟4)中得到的固體發酵料進行出芽胞處理，即對經培養的固體發酵料，停止通風供氧，將其 攤開、翻倒，溫度降低到20°C 30°C，含水量降低到20% 30%，促使固體發酵料中含有的枯草芽孢桿菌形成芽孢； 6)干燥與粉碎處理:將步驟5)中得到的含有芽胞的固體發酵料進行干燥處理，經干燥爐烘干，微粉機粉碎，生產出培養基中含腐植酸鈉的枯草芽孢桿菌(cfu) > 200億個/g的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑產品。
2.按照權利要求1所述的生產方法，其特征在于:步驟I)和2)所采用的枯草芽孢桿菌固體種子培養基的重量組成為:葡萄糖0.8 1.2%、蛋白胨0.8 1.2%、牛肉膏0.3 0.6%、氯化鈉0.03 0.07%、硫酸鎂0.03 0.07%、磷酸氫二鉀0.05 0.15%、余量為純凈水、pH6.6 7.2、瓊脂1.5 2.2% ; 培養基滅菌條件:0.08MPa、115°C、18min ； 培養溫度:28°C 32°C，時間為48 72h。
3.按照權利要求2所述培養方法，其特征在于:所采用的枯草芽孢桿菌固體種子培養基的重量組成為:葡萄糖1.0%、蛋白胨1.0%、牛肉膏0.5.%、氯化鈉0.05%、硫酸鎂0.05 %、磷酸氫二鉀0.1 %、余量為純凈水、PH7.0、瓊脂2.0% ; 培養基滅菌條件:0.08MPa、115°C、18min ； 培養溫度:30°C，時間為48h。
4.按照權利要求1所述培養方法，其特征在于:步驟3)所采用的枯草芽孢桿菌種子發酵培養基的重量組成為:葡萄糖0.5 1.5%、蛋白胨0.2 0.8%、酵母粉0.2 0.8%、玉米面LO 3.0%、豆柏1.0 3.0%、硫酸銨0.1 0.3%、氯化鈉0.03 0.07%、硫酸鎂0.03 0.07%、磷酸氫二鉀0.05 0.15%、余量為純凈水、pH6.6 7.2 ; 滅菌條件:0.lMPa、121°C、20min ； 發酵培養條件:罐壓0.01 0.lOMpa、通氣量0.5 1.0V/V.π η、轉速100 200rpm、溫度28°C 34°C、時間為48 72h。
5.按照權利要求4所述培養方法，其特征在于:所采用的枯草芽孢桿菌種子發酵培養基的重量組成為:葡萄糖1.0%、蛋白胨0.5 %、酵母粉0.5%、玉米面2.0 %、豆柏2.0 %、硫酸銨0.2kg%、氯化鈉0.05%、硫酸鎂0.05%、磷酸氫二鉀0.10%、余量為純凈水、pH7.0 ； 滅菌條件:0.lMPa、121°C、20min ； 發酵培養條件:罐壓0.05Mpa、通氣量0.5V/V.min、轉速lOOrpm、培養溫度30°C、時間為 48h ； 得到的發酵液體二級種子標準為:顏色正常，無異味，芽孢占總菌數20%以上，pH在6.0 6.5，菌體大小為0.7 0.8X2 3 μ m，芽孢0.6 0.9X1.0 1.5 μ m，含枯草芽孢桿菌(cfu) > 200億個/ml。
6.按照權利要求1所述的培養方法，其特征在于:所述固體發酵料有氧發酵過程中，固體發酵料中各種原料重量比例為:葡萄糖I 3份、腐植酸鈉10 40份、豆柏10 20份、玉米面10 20份、麩皮50 70份； 固體發酵料培養條件:通氣量0.5 1.0V/V.min、發酵溫度50°C 60°C、發酵時間48 64h。
7.按照權利要求6所述的培養方法，其特征在于:所述固體發酵料有氧發酵過程中，固體發酵料中各種原料重量比例為:葡萄糖2份、腐植酸鈉30份、豆柏10份、玉米面10、麩皮50份； 固體發酵料培養條件:通氣量0.5V/V.min、發酵溫度50°C、發酵時間48。
8.按照權利要求6所述的培養方法，其特征在于:步驟5)所述出芽孢處理中:需對經培養的固體發酵料，停止通風供氧，將其攤開、翻倒；出芽孢處理條件為 溫度20°C 30°C、含水量20 30%、時間24 48h ； 步驟6)將步驟5)所述含有芽胞的固體發酵料進行干燥處理與粉碎，干燥處理條件為:采用干燥爐進行干燥，干燥爐內溫度60°C 80°C、干燥爐出口溫度38°C 42°C、時間8 IOmin ； 粉碎處理條件為:在無菌潔凈條件下進行，粉碎后粒度80 120目、含枯草芽孢桿菌(cfu) 200 220億個/g、含水量8 15%。
9.按照權利要求8所述的培養方法，其特征在于:所述出芽孢處理中:需對經培養的固體發酵料，停止通風供氧，將其攤開、翻倒；出芽孢處理條件為:溫度20°C、含水量20、時間48h ； 所述含有芽胞的固體發酵料進行干燥處理與粉碎，干燥處理條件為:采用干燥爐進行干燥，干燥爐內溫度60°C、干燥爐出口溫度38°C、時間8min ； 粉碎處理條件為:在無菌潔凈條件下進行，粉碎后粒度100目、含水量10%、含枯草芽孢桿菌(cfu) 200億個/g。
全文摘要
本發明涉及微生物生物制劑，具體的說是一種培養基中含腐植酸鈉的飼料用高濃度枯草芽孢桿菌生物制劑的生產方法。枯草芽孢桿菌菌株經一級固體種子培養，二級液體種子發酵培養，得菌種液。菌種液接種于葡萄糖、腐植酸鈉、豆粕、玉米、麥麩等為主要原料的培養基中進行三級固體有氧發酵，經調整培養條件出芽孢處理，干燥，粉碎，生產出枯草芽孢桿菌生物制劑。制劑含枯草芽孢菌(cfu)≥200億個/g，pH值5.6～6.6，水分≤10％，粒度≥100目，色澤呈現特有的淺灰色或灰黑色、保質期18個月。本制劑在水產、畜禽養殖中作為添加劑應用，可以提高生產性能，改善養殖環境。
文檔編號C12N1/20GK103184174SQ20111045574
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優先權日2011年12月30日
發明者潘軍, 薛德林, 宋穎, 張偉強 申請人:沈陽博善英勝生物技術有限公司