專利名稱：接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶尺蠖飼養(yǎng)及茶尺蠖核型多角體病毒繁殖領(lǐng)域，尤其涉及接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法，具體適用于通過接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法來實(shí)現(xiàn)全年規(guī)模化繁殖EcobNPV。
背景技術(shù)：
茶尺蠖Ectropis obliqua Warren，屬鱗翅目，尺蛾科，是我國主要茶樹害蟲之一， 分布遍及各主產(chǎn)茶區(qū)，在長江中下游，尤以浙、蘇、皖、鄂地區(qū)危害嚴(yán)重。幼蟲食葉為害，常致茶叢光禿，嚴(yán)重影響茶樹的樹勢和茶葉產(chǎn)量，除危害茶樹外，還取食大豆、向日葵、石榴等植物。在我國茶尺蠖1年發(fā)生5 - 6代，第1代發(fā)生較為整齊，2代后世代重疊，防治難度較大。目前各地針對茶尺蠖的防治措施各有不同，但均以化學(xué)防治為主。化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，在殺死害蟲的同時(shí)，不僅嚴(yán)重污染了茶園生態(tài)環(huán)境，而且也殺傷了大量天敵，并帶來害蟲抗藥性增強(qiáng)、茶葉農(nóng)藥殘留、茶園生態(tài)系統(tǒng)惡化等諸多負(fù)面效應(yīng)，嚴(yán)重威脅茶葉質(zhì)量安全。茶葉作為加工不經(jīng)洗滌、消費(fèi)直接沖泡的飲品，在茶園有害生物防治中要求盡量減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，優(yōu)先考慮運(yùn)用生物、農(nóng)業(yè)、物理手段治蟲保產(chǎn)。茶尺蠖核型多角體病毒 (Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，簡稱 EcobNPV)是茶尺蠖的重要病原微生物, 它對茶尺蠖幼蟲感染力強(qiáng)，致死率高，對人、畜及天敵昆蟲安全，尤其是可通過水平擴(kuò)散和垂直傳播途徑，形成病毒流行鏈，實(shí)現(xiàn)對靶標(biāo)害蟲持續(xù)控制，因此，在茶葉生產(chǎn)中具有非常廣闊的應(yīng)用前景。由于茶尺蠖核型多角體病毒專擇性極強(qiáng)，只能在寄主活體內(nèi)或細(xì)胞中增殖，生產(chǎn)條件要求相對嚴(yán)格，因此，能否解決病毒生產(chǎn)問題，成為該病毒在生產(chǎn)實(shí)際中能否發(fā)揮作用的關(guān)鍵。用離體細(xì)胞增殖病毒，現(xiàn)已有報(bào)道，但其成本甚高，只能供基礎(chǔ)理論研究應(yīng)用，尚不適應(yīng)我國茶葉生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)。目前，生產(chǎn)茶尺蠖病毒主要采用宿主活體增殖的方式，即通過接毒感染宿主幼蟲生產(chǎn)病毒。通常野外接毒和室內(nèi)接毒都可以實(shí)現(xiàn)病毒的增殖，但前者更容易受到環(huán)境因素制約，如溫度、濕度、光照、雨水、肉食性昆蟲等等，都會(huì)對病毒的產(chǎn)量造成影響，甚至導(dǎo)致病毒殺蟲活性降低；相比之下，室內(nèi)接毒方式可控性強(qiáng)，病毒生產(chǎn)量更為穩(wěn)定，因此，也成為當(dāng)前昆蟲病毒活體增殖的最主要途徑。室內(nèi)人工飼養(yǎng)茶尺蠖，為病毒擴(kuò)繁提供齡期和營養(yǎng)狀況一致的宿主昆蟲，是茶尺蠖病毒活體增殖的關(guān)鍵。但由于使用傳統(tǒng)方法，即用茶葉養(yǎng)蟲生產(chǎn)病毒效率低、成本高，不適宜作為飼料養(yǎng)蟲增殖病毒，為此，必須篩選新飼料以有效解決茶尺蠖病毒大量擴(kuò)繁的難題。中國專利專利號為ZL200710068384.0，授權(quán)公告日為2009年9月16日的發(fā)明專利公開了一種茶尺蠖的人工飼料，其制備及茶尺蠖的飼養(yǎng)方法，該發(fā)明中飼料的配方組分與各組分的重量份為瓊脂0. 5 - 6份、山梨酸鉀0. 1 - 0. 8份、精制葡萄糖1 - 8. 5份、可溶性淀粉1. 5 - 10份、脫脂黃豆粉2 - 10份、復(fù)合維生素B 0. 01 - 0. 1份、維生素C 0. 1 - 1. 5份、維生素E 0.02-0. 15份、茶葉粉20 - 40份和純凈水100 - 180份。雖然該發(fā)明用配方飼料替代茶葉克服了以往在冬季與早春因飼料短缺導(dǎo)致茶尺蠖不能全年繼代飼養(yǎng)的難題， 但其仍舊具有以下缺陷
首先，該發(fā)明只提及了配方飼料的養(yǎng)蟲情況，而沒有提及配方飼料養(yǎng)蟲后的產(chǎn)毒效率、 病毒毒力等關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)，該發(fā)明由于缺乏這些數(shù)據(jù)，因而無法確定它是否能替代茶葉滿足規(guī)模化生產(chǎn)EcobNPV的需要。其次，該發(fā)明采取的配方飼料為人工配料，不僅種類繁多，而且配制要求較高，因而成本較大，不適合于大范圍的推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的無法規(guī)模化生產(chǎn)EcobNPV、成本較高的缺陷與問題，提供一種能夠規(guī)模化生產(chǎn)EcobNPV、成本較低的接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁 EcobNPV的方法。為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的技術(shù)解決方案是接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，該方法依次包括以下步驟
第一步先采集健康茶尺蠖(Ectropis obliqua Warren)的蛹，再置于消毒后的養(yǎng)蟲容器內(nèi)，并在室溫下飼養(yǎng)至成蟲羽化；
第二步待上述蟲蛹羽化后，先在養(yǎng)蟲容器內(nèi)放入10%蔗糖溶液供成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)，再用高密紗布覆蓋養(yǎng)蟲容器供交配后的雌蟲在其表面產(chǎn)卵；
第三步始見卵孵出幼蟲后，開始用接骨草(Sambucus chinensis)喂養(yǎng)茶尺蠖幼蟲，先將接骨草置于養(yǎng)蟲容器周圍以供孵出的幼蟲取食，當(dāng)接骨草上的接蟲量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲容器內(nèi)部供孵出的幼蟲取食，在整個(gè)幼蟲飼養(yǎng)過程中，根據(jù)接骨草的新鮮程度和被取食程度，更換和添加接骨草3 - 4次，飼養(yǎng)直至幼蟲化蛹為止。所述第一步中每個(gè)養(yǎng)蟲容器內(nèi)承裝蟲蛹400 - 500頭。所述第三步中，先將接骨草置于養(yǎng)蟲容器周圍以供孵出的幼蟲取食，當(dāng)接骨草上的接蟲量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲容器內(nèi)部供孵出的幼蟲取食的操作步驟為先用細(xì)口瓶水培接骨草，并將細(xì)口瓶置于養(yǎng)蟲容器周圍，以供孵出的幼蟲取食細(xì)口瓶中水培的接骨草，當(dāng)每個(gè)細(xì)口瓶中接骨草的接蟲量達(dá)到80 - 120頭時(shí)，再將細(xì)口瓶及瓶中水培的接骨草一并轉(zhuǎn)入養(yǎng)蟲容器中，每個(gè)養(yǎng)蟲容器承裝4瓶接骨草，共飼養(yǎng)齡期一致的幼蟲300 - 500頭，且在養(yǎng)蟲容器上覆蓋雙層高密紗布以防止幼蟲逃逸。所述細(xì)口瓶中水培的接骨草的原料使用狀態(tài)為當(dāng)接骨草長至60cm以上，先用枝剪剪取該植株頂部25 - 30cm長嫩梢，再選取8 - 10根長度一致嫩梢為一束，然后置于細(xì)口瓶內(nèi)水培。用所述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法；所述EcobNPV是茶尺蠖核型多角體病毒，全稱為Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，簡稱為EcobNPV ；所述擴(kuò)繁EcobNPV的方法依次包括以下步驟
第一步先將感染病毒死亡的茶尺蠖蟲尸加少量無菌水置組織勻漿器皿中勻漿 3min - 5min,再取出漿液按1 :6加無菌水混勻，然后在500r/min的條件下離心5min以去除細(xì)胞組織碎片和沉淀，再取上清液在3500r/min的條件下離心30 min，然后棄去上清液，并用無菌水懸浮沉淀，再重復(fù)上述離心操作2 - 3次以得到最終沉淀，然后將該最終沉淀用無菌水懸浮即可得到茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液；
第二步先將上述得到的茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液用無菌水稀釋至5X IO6PIB/ ml以得到病毒液，再在4°C下保存?zhèn)溆茫?br> 第三步按上述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法飼養(yǎng)茶尺蠖，在飼養(yǎng)過程中，當(dāng)茶尺蠖幼蟲長至3齡時(shí)開始接種病毒，接種病毒采用上述病毒液進(jìn)行，接毒濃度為5X106PIB/ml，接毒方式為在每個(gè)養(yǎng)蟲容器內(nèi)的接骨草上噴灑病毒液50ml，且初次噴毒后的接骨草必須喂養(yǎng)2天以上才能更換；
第四步接種病毒5天后開始逐日收集染毒死蟲，并將收集的蟲尸與50%甘油按1 1的比例混合后置一 20°C下保存?zhèn)溆茫藭r(shí)即可得到所需的EcobNPV。所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲為第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖的3齡幼蟲。所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲為第1代茶尺蠖的3齡幼蟲。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為
1、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中不僅涉及到茶尺蠖的飼養(yǎng)方法，而且提及了用該飼養(yǎng)方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，整個(gè)過程以EcobNPV的規(guī)模化生產(chǎn)為目標(biāo)，應(yīng)用本發(fā)明可以獲得明確的養(yǎng)蟲數(shù)據(jù)與產(chǎn)毒數(shù)據(jù)，根據(jù)試驗(yàn)本發(fā)明在飼養(yǎng)茶尺蠖時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)與對照無顯著差異；本發(fā)明在擴(kuò)繁EcobNPV時(shí)，能使85%以上幼蟲至末齡幼蟲期染毒死亡，降低幼蟲提早死亡或化蛹的比例，按照感病宿主蟲尸生物量與病毒產(chǎn)量正相關(guān)原則，以接骨草為飼料增殖病毒量(平均每頭重量0. 0507g)高于茶葉養(yǎng)蟲的產(chǎn)毒量(平均每頭重量0. 0490g)，產(chǎn)毒效率高，毒力強(qiáng)。因此，本發(fā)明不僅能替代茶葉對茶尺蠖進(jìn)行全年、 繼代的飼養(yǎng)，而且能滿足規(guī)模化生產(chǎn)EcobNPV的需要。2、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中在飼養(yǎng)茶尺蠖時(shí)，用接骨草替代茶葉，接骨草(拉丁學(xué)名=Sambucus chinensis)的優(yōu)點(diǎn)如下首先，不僅養(yǎng)蟲效果較好，而且產(chǎn)毒效率高、病毒毒力強(qiáng)；其次，接骨草不僅獲取方便、成本低廉，而且枯萎期長、減少更換，一般只需更換3 - 4次即可，以3次為多，而現(xiàn)有飼料至少要替換4-6次或更多，大大增加了操作難度。因此本發(fā)明不僅成本低廉，而且操作難度較低。3、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中在飼養(yǎng)茶尺蠖時(shí)，用 10%蔗糖溶液供成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)，其原因在于10%蔗糖溶液不僅能延長成蟲壽命，而且能顯著提高產(chǎn)卵量，有利于提高養(yǎng)蟲效果與產(chǎn)毒效果。因此本發(fā)明的養(yǎng)蟲效果與產(chǎn)毒效果均較好。4、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中在擴(kuò)繁EcobNPV時(shí)，要求初次噴毒后的接骨草必須喂養(yǎng)2天以上才能更換的原因在于如果低于2天，則不能充分接毒，從而影響產(chǎn)毒效果。因此本發(fā)明的接毒效果較好、產(chǎn)毒效果較佳。5、本發(fā)明接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法中在擴(kuò)繁EcobNPV時(shí)，要求接種病毒的茶尺蠖幼蟲為3齡幼蟲的原因在于幼蟲3齡前接毒相對敏感，4 - 5齡幼蟲敏感性較差，為確保獲得較多的幼蟲尸體以提高產(chǎn)毒量，故要求接種病毒的茶尺蠖幼蟲為3 齡幼蟲；同時(shí)，對于3齡幼蟲要求其為第1代、第2代、第3代或第6代，尤以第1代為佳的原因在于在茶尺蠖不同世代中，以第1代、第2代、第3代或第6代發(fā)生期的溫度更適宜繁殖病毒，故其病毒產(chǎn)量較高，尤其以第1代的病毒產(chǎn)量最高。因此本發(fā)明的產(chǎn)毒效果較佳。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，該方法依次包括以下步驟
第一步先采集健康茶尺蠖(Ectropis obliqua Warren)的蛹，再置于消毒后的養(yǎng)蟲容器內(nèi)，并在室溫下飼養(yǎng)至成蟲羽化；
第二步待上述蟲蛹羽化后，先在養(yǎng)蟲容器內(nèi)放入10%蔗糖溶液供成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)，再用高密紗布覆蓋養(yǎng)蟲容器供交配后的雌蟲在其表面產(chǎn)卵；
第三步始見卵孵出幼蟲后，開始用接骨草(Sambucus chinensis)喂養(yǎng)茶尺蠖幼蟲，先將接骨草置于養(yǎng)蟲容器周圍以供孵出的幼蟲取食，當(dāng)接骨草上的接蟲量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲容器內(nèi)部供孵出的幼蟲取食，在整個(gè)幼蟲飼養(yǎng)過程中，根據(jù)接骨草的新鮮程度和被取食程度，更換和添加接骨草3 - 4次，飼養(yǎng)直至幼蟲化蛹為止。所述第一步中每個(gè)養(yǎng)蟲容器內(nèi)承裝蟲蛹400 - 500頭。所述第三步中，先將接骨草置于養(yǎng)蟲容器周圍以供孵出的幼蟲取食，當(dāng)接骨草上的接蟲量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲容器內(nèi)部供孵出的幼蟲取食的操作步驟為先用細(xì)口瓶水培接骨草，并將細(xì)口瓶置于養(yǎng)蟲容器周圍，以供孵出的幼蟲取食細(xì)口瓶中水培的接骨草，當(dāng)每個(gè)細(xì)口瓶中接骨草的接蟲量達(dá)到80 - 120頭時(shí)，再將細(xì)口瓶及瓶中水培的接骨草一并轉(zhuǎn)入養(yǎng)蟲容器中，每個(gè)養(yǎng)蟲容器承裝4瓶接骨草，共飼養(yǎng)齡期一致的幼蟲300 - 500頭，且在養(yǎng)蟲容器上覆蓋雙層高密紗布以防止幼蟲逃逸。所述細(xì)口瓶中水培的接骨草的原料使用狀態(tài)為當(dāng)接骨草長至60cm以上，先用枝剪剪取該植株頂部25 - 30cm長嫩梢，再選取8 - 10根長度一致嫩梢為一束，然后置于細(xì)口瓶內(nèi)水培。用所述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法；所述EcobNPV是茶尺蠖核型多角體病毒，全稱為Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus，簡稱為EcobNPV ；所述擴(kuò)繁EcobNPV的方法依次包括以下步驟
第一步先將感染病毒死亡的茶尺蠖蟲尸加少量無菌水置組織勻漿器皿中勻漿 3min - 5min,再取出漿液按1 :6加無菌水混勻，然后在500r/min的條件下離心5min以去除細(xì)胞組織碎片和沉淀，再取上清液在3500r/min的條件下離心30 min，然后棄去上清液，并用無菌水懸浮沉淀，再重復(fù)上述離心操作2 - 3次以得到最終沉淀，然后將該最終沉淀用無菌水懸浮即可得到茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液；
第二步先將上述得到的茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液用無菌水稀釋至5X IO6PIB/ ml以得到病毒液，再在4°C下保存?zhèn)溆茫?br> 第三步按上述接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法飼養(yǎng)茶尺蠖，在飼養(yǎng)過程中，當(dāng)茶尺蠖幼蟲長至3齡時(shí)開始接種病毒，接種病毒采用上述病毒液進(jìn)行，接毒濃度為5 X 106PIB/ml，接毒方式為在每個(gè)養(yǎng)蟲容器內(nèi)的接骨草上噴灑病毒液50ml，且初次噴毒后的接骨草必須喂養(yǎng)2天以上才能更換；
第四步接種病毒5天后開始逐日收集染毒死蟲，并將收集的蟲尸與50%甘油按1 1的比例混合后置一 20°C下保存?zhèn)溆茫藭r(shí)即可得到所需的EcobNPV。
所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲為第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖的3齡幼蟲。所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲為第1代茶尺蠖的3齡幼蟲。本發(fā)明的原理說明如下
一、接骨草
替代性強(qiáng)接骨草為茶尺蠖野生寄主植物，幼蟲喜食，生長發(fā)育正常。在武漢地區(qū)，以接骨草為飼料飼養(yǎng)茶尺蠖(第4代)，幼蟲發(fā)育歷期14. 5天，存活率85. 7%，蛹?xì)v期8. 25天，羽化率84. 3%，每雌平均產(chǎn)卵量138. 6粒，其各項(xiàng)生物學(xué)特征參數(shù)與茶葉飼養(yǎng)的參數(shù)值無顯著性差異。成本低廉接骨草為多年生草本植物，喜溫濕氣候，分布廣泛，在我國浙江、安徽、 江西、湖南、湖北、福建、廣東、廣西、四川等省區(qū)野生或栽培，其人工栽培可種子繁殖或分株繁殖。通常在茶園附近、林間、溝邊生長，來源廣泛，容易獲得，成本十分低廉。更換次數(shù)少接骨草出現(xiàn)萎蔫一般在5天以上，比茶葉從投料至更換需要的時(shí)間更長，有利于減少換料次數(shù)，一般只需更換3 - 4次即可，以3次為多，而現(xiàn)有飼料至少要替換4-6次或更多。同時(shí)，本發(fā)明對接骨草的原料使用狀態(tài)要求為當(dāng)接骨草長至60cm以上， 先用枝剪剪取該植株頂部25 - 30cm長嫩梢，再選取8 - 10根長度一致嫩梢為一束，然后置于細(xì)口瓶內(nèi)水培。由此可見，不僅要求剪取生命力較強(qiáng)的嫩梢，而且用水培的方法來延長嫩梢的生命力，因此該原料使用狀態(tài)能夠進(jìn)一步減少接骨草在飼養(yǎng)中的更換次數(shù)。試驗(yàn)1 接骨草與茶葉飼養(yǎng)茶尺蠖的效果對比試驗(yàn)
本試驗(yàn)自2010年7月27日至2010年9月10日，采用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖一個(gè)世代， 以茶葉喂養(yǎng)為對照。參見表1，結(jié)果表明，以接骨草飼養(yǎng)的茶尺蠖幼蟲發(fā)育歷期14. 5天，比對照延長了 1 - 2天，幼蟲存活率85. 7%，蛹重89. 78mg,蛹發(fā)育歷期8. 25天，羽化率84. 3%， 每雌平均產(chǎn)卵量138. 6粒，卵孵化率86. 4%，其各項(xiàng)指標(biāo)與對照無顯著差異。通過試驗(yàn)觀察還發(fā)現(xiàn)，水培接骨草存放時(shí)間久，出現(xiàn)萎蔫一般在5天以上，比茶葉投料至更換飼料時(shí)間更長，減少換料次數(shù)，節(jié)省人工。
表1 接骨萆與茶葉餌養(yǎng)茶尺蠖的效果對比試驗(yàn)
權(quán)利要求
1.接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，其特征在于該方法依次包括以下步驟第一步先采集健康茶尺蠖(Ectropis oblique Warren)的蛹，再置于消毒后的養(yǎng)蟲容器內(nèi)，并在室溫下飼養(yǎng)至成蟲羽化；第二步待上述蟲蛹羽化后，先在養(yǎng)蟲容器內(nèi)放入10%蔗糖溶液供成蟲補(bǔ)充營養(yǎng)，再用高密紗布覆蓋養(yǎng)蟲容器供交配后的雌蟲在其表面產(chǎn)卵；第三步始見卵孵出幼蟲后，開始用接骨草(Sambucus chinensis)喂養(yǎng)茶尺蠖幼蟲，先將接骨草置于養(yǎng)蟲容器周圍以供孵出的幼蟲取食，當(dāng)接骨草上的接蟲量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲容器內(nèi)部供孵出的幼蟲取食，在整個(gè)幼蟲飼養(yǎng)過程中，根據(jù)接骨草的新鮮程度和被取食程度，更換和添加接骨草3 - 4次，飼養(yǎng)直至幼蟲化蛹為止。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，其特征在于所述第一步中每個(gè)養(yǎng)蟲容器內(nèi)承裝蟲蛹400 - 500頭。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，其特征在于所述第三步中，先將接骨草置于養(yǎng)蟲容器周圍以供孵出的幼蟲取食，當(dāng)接骨草上的接蟲量達(dá)到一定數(shù)目要求后，再將接骨草置于養(yǎng)蟲容器內(nèi)部供孵出的幼蟲取食的操作步驟為先用細(xì)口瓶水培接骨草，并將細(xì)口瓶置于養(yǎng)蟲容器周圍，以供孵出的幼蟲取食細(xì)口瓶中水培的接骨草，當(dāng)每個(gè)細(xì)口瓶中接骨草的接蟲量達(dá)到80 - 120頭時(shí)，再將細(xì)口瓶及瓶中水培的接骨草一并轉(zhuǎn)入養(yǎng)蟲容器中，每個(gè)養(yǎng)蟲容器承裝4瓶接骨草，共飼養(yǎng)齡期一致的幼蟲300 - 500頭，且在養(yǎng)蟲容器上覆蓋雙層高密紗布以防止幼蟲逃逸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，其特征在于所述細(xì)口瓶中水培的接骨草的原料使用狀態(tài)為當(dāng)接骨草長至60cm以上，先用枝剪剪取該植株頂部25 -30cm長嫩梢，再選取8- 10根長度一致嫩梢為一束，然后置于細(xì)口瓶內(nèi)水培。
5.用權(quán)利要求1所述的接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，其特征在于所述EcobNPV是茶尺蠖核型多角體病毒，全稱為Ectropis grisescens nucleopolyhedrovirus，簡稱為EcobNPV ；所述擴(kuò)繁EcobNPV的方法依次包括以下步驟第一步先將感染病毒死亡的茶尺蠖蟲尸加少量無菌水置組織勻漿器皿中勻漿 3min - 5min，再取出漿液按1 :6加無菌水混勻，然后在500r/min的條件下離心5min以去除細(xì)胞組織碎片和沉淀，再取上清液在3500r/min的條件下離心30 min，然后棄去上清液，并用無菌水懸浮沉淀，再重復(fù)上述離心操作2 - 3次以得到最終沉淀，然后將該最終沉淀用無菌水懸浮即可得到茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液；第二步先將上述得到的茶尺蠖核型多角體病毒的粗提液用無菌水稀釋至5X IO6PIB/ ml以得到病毒液，再在4°C下保存?zhèn)溆茫坏谌桨瓷鲜鼋庸遣蒿曫B(yǎng)茶尺蠖的方法飼養(yǎng)茶尺蠖，在飼養(yǎng)過程中，當(dāng)茶尺蠖幼蟲長至3齡時(shí)開始接種病毒，接種病毒采用上述病毒液進(jìn)行，接毒濃度為5 X 106PIB/ml，接毒方式為在每個(gè)養(yǎng)蟲容器內(nèi)的接骨草上噴灑病毒液50ml，且初次噴毒后的接骨草必須喂養(yǎng)2天以上才能更換；第四步接種病毒5天后開始逐日收集染毒死蟲，并將收集的蟲尸與50%甘油按1 1的比例混合后置一 20°C下保存?zhèn)溆茫藭r(shí)即可得到所需的EcobNPV。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，其特征在于所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲為第1代、第2代、第3代或第6代茶尺蠖的3齡幼蟲。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，其特征在于所述第三步中接種病毒的茶尺蠖3齡幼蟲為第1代茶尺蠖的3齡幼蟲。
全文摘要
接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖，及用其擴(kuò)繁EcobNPV的方法，包括接骨草飼養(yǎng)茶尺蠖的方法，以及用該飼養(yǎng)方法擴(kuò)繁EcobNPV的方法，其核心是用接骨草替代茶葉飼養(yǎng)茶尺蠖，并配合各種飼養(yǎng)操作與擴(kuò)繁操作以提高養(yǎng)蟲效果與產(chǎn)毒效果，不僅能克服傳統(tǒng)飼料無法全年、繼代飼養(yǎng)茶尺蠖的難題，而且能解決EcobNPV大量擴(kuò)繁的難題。本設(shè)計(jì)不僅成本低廉、操作難度較低，而且產(chǎn)毒效率較高、病毒毒力較強(qiáng)，能夠滿足規(guī)模化生產(chǎn)EcobNPV的需要。
文檔編號C12N7/00GK102550490SQ20121000311
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月6日
發(fā)明者劉明炎, 毛迎新, 譚榮榮, 龔自明 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所