專利名稱：一種提高植物抗病性及促進其生長的微生物菌劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物菌劑，更確切地說是一種枯草芽孢桿菌{Bacillus )EBC7活菌或發酵菌液的微生物菌劑以及該菌劑在促進黃瓜生長和提高其抗病性上的應用。
背景技術：
黃瓜在我國已有2000多年的栽培歷史，富含維生素A、C以及多種有益礦物質，是我國的主栽蔬菜作物之一，并且，我國保護地黃瓜種植面積呈上升趨勢。但保護地是一個高濕、弱光的生態環境，因此黃瓜抗病性降低，病害頻繁發生，包括立枯猝倒病、枯萎病等土傳真菌病害；灰霉病、白粉病等氣傳真菌病害；以及其它細菌和病毒引起的病害。目前生產上主要采用化學防治的方法控制這些病害的發生發展，但由于土傳病害病原菌的生物學特性及土壤的屏障作用增加了防治難度，導致化學防治劑用量雖大卻難以正常發揮作用，同時， 土壤微生物區系受到干擾，病原菌的抗藥性增強，對土壤及黃瓜污染嚴重。隨著全社會對食品安全的重視和可持續農業的發展，利用安全、高效、無環境污染的微生物菌劑防治植物病害已普遍為人們所接受。生防微生物的作用機制主要包括以下幾個方面有些微生物可以產生一些抗生素對病原菌有拮抗作用；有些微生物能產生殺菌蛋白，起到殺滅病原菌的作用；有些微生物能產生幾丁質酶，可以裂解真菌性病原菌的細胞壁從而起到生防作用；有些微生物能夠誘導植物產生抗病性。由于拮抗作用和誘導抗性作用具有抗菌譜廣、對植物病害防效顯著等優點，因此在植物病害防治應用方面備受青睞。芽孢桿菌是土壤和植物微生態系統中的優勢種群之一，是植物病害生防微生物的重要組成成分，在植物病害的生物防治方面發揮了重要作用，人們已在很多植物上檢測過芽孢桿菌某些種的生防作用，如Guo等研究表明，從番茄根際分離的A/s sp. BBll對 Ralstonia引起的番爺細菌性枯萎病有一定的防治作用。目前對有害生物的防治策略已經從有害生物綜合治理轉向有害生物可持續控制。并且人們已越來越認識到殺菌劑的大量重復使用對環境造成的惡劣影響以及病原菌產生的抗藥性所帶來的嚴重后果， 因此利用有益微生物對病原進行防治是一種頗具潛力的方法。這種防治方法對人畜和非靶標生物安全，對環境友好，不易產生抗藥性，易于保護生物多樣性等優點。針對我國土壤、農作物與水體中農藥殘留量超標，病原菌抗藥性嚴重等問題，利用有益防治蔬菜病害有利于環境保護和綠色蔬菜的生產，具有良好的市場前景，會產生巨大的生態效益和社會效益。

發明內容
本發明的一個目的是公開了一種枯草芽孢桿菌EBC7,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏號為=CGMCC No. 5586。本發明的另一個目的是公開了 CGMCC No. 5586菌株的制備方法。本發明的再一個目的是公開了采用CGMCC No. 5586制備微生物菌劑的方法。本發明的再一個目的是提供該微生物菌劑在促進黃瓜生長，提高黃瓜抗病性方面的應用。為實現上述目的，本發明提供如下的技術方案
本發明公開的枯草芽孢桿菌于2011年12月13日；保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌株保藏號為CGMCC No. 5586。枯草芽孢桿菌Uaci77心subti I is) CGMCC No. 5586所具有的形態、生理生化特征如下
(1)菌落及形態特征在NA培養基上菌落圓形、白色、表面色暗、不透明，細胞桿狀、革蘭氏染色陽性。顯微鏡觀察菌株形態。(2)生理生化特性接觸酶陽性，氧化酶陽性，V-P測定陽性，V-P培養物終pH〈6， D-葡萄糖、D-棉子糖、D-山梨糖醇和D-甘露醇產酸，葡萄糖不產氣，水解酪朊、明膠和淀粉，利用檸檬酸鹽、不利用丙酸鹽，不水解酪氨酸，不產生苯丙氨酸脫氨酶和賴氨酸脫羧酶， 產生精氨酸雙水解酶，將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，不形成吲哚，不需要NaCl、KC1、尿囊素和尿酸鹽，在PH5. 7和6. 8的營養肉湯中生長，在2、5和7%的NaCl中生長，在0. 001%的溶菌酶存在時生長。本發明所述枯草芽孢桿菌subtiIisXGmc No. 5586的制備方法，其特征在于按如下步驟進行
(X) Bacillus subti I is EBC7的分離從天津市西青區溫室采集健康的、“津優10號” 黃瓜根系；流水沖洗1-2 h后，在70%的乙醇中浸泡I min后，在2. 5%的NaClO中消毒6-8 min,無菌水沖洗干凈備用；
(2)將步驟(I)得到的滅菌組織轉移到無菌研缽中加入PBS緩沖液(pH7.0)研磨，取研磨汁液系列稀釋后，各取100 W涂布于NA平板上，并置于28°C條件下黑暗培養，每處理3 次重復；
(3)挑取NA平板上的單菌落，劃線純化培養，得到枯草芽孢桿菌菌株；然后將枯草芽孢桿菌接種于NB培養液中，150 rpm/min振蕩培養24 h后，將得到的枯草芽孢桿菌菌液在 15%的甘油中-80°C保存備用；其中的NA培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml，pH7. 0-7. 2;NB培養基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。本發明制備的枯草芽孢桿菌心subti I is) EBC7的特點
檢驗項目小鼠急性經口毒性試驗
檢測結果動物染毒后，未見明顯中毒表現，觀察期內無死亡，尸檢中各主要臟器未見明顯異常。檢測結論本品的小鼠急性經口毒性LD5tl > 20. 0 / g / kg. BW。按《食品安全性毒理學評價療程和方法》(GB15193. 3-2003)，本品屬于無毒。本發明進一步公開了采用含量I.SUXIOki的枯草芽胞桿菌(也《77心
的發酵液制備微生物菌劑的方法，其特征在于枯草芽孢桿菌菌液在15%的甘油中_80°C保存，使用時接種到固體NA培養基上活化培養；之后取一環NA培養基上的菌苔接種于含有NB培養液基的三角瓶中進行種子培養，150 rpm/min振蕩培養24 h后，以1_3%的接種量接種于發酵瓶中發酵培養48 h，得到含量I. 5-4. 5 X 101°發酵液；
其中的NA培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml，pH7. 0-7. 2 ；
NB培養基(種子培養基)蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至IOOOml， pH7. 0-7. 2 ；
發酵培養基黃豆粉lO.OOg，玉米淀粉5.00g，酵母粉0. 50g，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。本發明進一步公開了微生物菌劑在制備作為促進黃瓜植株生長、防治黃瓜抗病性菌劑方面的應用。其中所述的黃瓜抗病性包括對黃瓜枯萎病或黃瓜白粉病的抗性。其中黃瓜種子與微生物菌劑的重量份數比為20 :1。本發明的微生物菌劑，對黃瓜白粉病和枯萎病有明顯的防治效果，并且能夠顯著促進黃瓜植株生長。經微生物菌劑處理后，黃瓜植株對白粉病的抗性明顯增強，病葉率明顯低于空白對照，相對免疫效果達到了 80.4%。經微生物菌劑處理后，黃瓜植株對枯萎病的抗性明顯提高，出苗率明顯高于空白對照，相對防治效果達到了 78. 5%。經微生物菌劑處理后， 黃瓜植株的生長明顯增強，株高、地上部鮮重和干重均顯著高于空白對照。本發明公開的微生物菌劑所具有的有益效果在于
有益生防細菌具有對人畜和非靶標生物安全，對環境友好，不易產生抗藥性，易于保護生物多樣性，來源廣泛等優點。針對我國土壤、農作物與水體中農藥殘留量超標，病原菌抗藥性嚴重等問題，利用益微菌防治蔬菜病害有利于環境保護和綠色蔬菜的生產，具有良好的市場前景，會產生巨大的生態效益和社會效益。
具體實施例方式
下面結合實施例說明本發明，這里所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的范圍內，本發明的范圍和實質由權利要求來限定。下面通過實例來進一步闡明本發明微生物菌劑的制備方法。本發明所用到的試劑除特別指出外均有市售。津研4號黃瓜種子、 津優10號黃瓜種子均有市售。實施例I
細菌(枯草芽孢桿菌)的制備
(X) Bacillus subti I is EBC7的分離從天津市西青區溫室采集健康的、“津優10號” 黃瓜根系；流水沖洗I h后，在70%的乙醇中浸泡I min后，在2. 5%的NaClO中消毒6 min, 無菌水沖洗干凈備用；
(2)將步驟(I)得到的滅菌組織轉移到無菌研缽中加入PBS緩沖液研磨，取研磨汁液系列稀釋后，各取100W涂布于NA平板上，并置于28°C條件下黑暗培養，每處理3次重復；
(3)挑取NA平板上的單菌落，劃線純化培養，得到枯草芽胞桿菌菌株；然后將枯草芽孢桿菌接種于NB培養液中，150 rpm/min振蕩培養24 h后，將得到的枯草芽孢桿菌菌液在 15%的甘油中-80°C保存備用；其中的NA培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml，pH7. 0-7. 2 ;NB培養基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。實施例2
細菌(枯草芽孢桿菌)在15%的甘油中_80°C保存，使用時接種到NA固體培養基上活化培養；活化后取一環菌苔接種于含有NB培養基的三角瓶中進行種子培養，150 rpm/min振蕩培養24 h后，以3%的接種量接種于發酵瓶中發酵培養48 h，得到含量I. 5 X IO10發酵液含有芽孢桿菌的營養體和/或芽孢以及抗菌代謝產物。其中的NA培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至 1000ml, pH7. 0 ；
NB培養基(種子菌培養基):蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至1000ml，pH7. 0 ; 發酵用培養基黃豆粉10.008，玉米淀粉5.008，酵母粉0.5(^，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，補水至 1000ml, pH7. O。實施例3
細菌(枯草芽孢桿菌)在15%的甘油中_80°C保存，使用時接種到NA固體培養基上活化培養；活化后取一環菌苔接種于含有NB培養基的三角瓶中進行種子培養，150 rpm/min振蕩培養24 h后，以3%的接種量接種于發酵瓶中發酵培養48 h，得到含量4. 5 X 101°發酵液 (含有芽孢桿菌的營養體和/或芽孢以及抗菌代謝產物)。其中的NA培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至 1000ml, pH7. 0 ；
NB培養基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至1000ml，7. 2 ;
發酵用培養基黃豆粉10.008，玉米淀粉5.008，酵母粉0.5(^，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，補水至 1000ml, pH7. 2。實施例4
細菌在15%的甘油中-80°C保存，使用時接種到固體NA培養基上活化培養；之后取一環NA培養基上的菌苔接種于含有NB培養液基的三角瓶中進行種子培養，150 rpm/min振蕩培養24 h后，以1%的接種量接種于發酵瓶中發酵培養48 h，得到含量3. 5X 101°發酵液 (含有芽孢桿菌的營養體和/或芽孢以及抗菌代謝產物);
其中的NA培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml， pH7. 0-7. 2 ；
NB培養基(種子菌培養基)蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至1000ml， pH7. 0-7. 2 ；
發酵培養基黃豆粉lO.OOg，玉米淀粉5.00g，酵母粉0. 50g，KH2PO4 0. 35g, CaCl2 0. 20g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。實施例5
該微生物菌劑在促進黃瓜生長，提高黃瓜抗病性方面的試驗應用實例。[試驗實例I]
該微生物菌劑對黃瓜枯萎病的防治作用
將在沙-玉米粉培養基上培養的黃瓜枯萎病菌(黃瓜研究所提供)與消毒土按I :50(w/ w)混勻，裝缽備用。津研4號黃瓜種子與該微生物菌劑的500倍水稀釋液(見實施例2)按 20 I (W/W)拌種，播于缽中，每缽6粒種子，每處理6缽，重復3次。以清水拌種為對照，播種后7d調查種子出苗率，15d時調查發病情況，并計算病情指數及相對防治效果。病級如下 0 :未發病；1 :病斑面積占葉片的0-25% ；2:病斑面積占葉片的25-50% ；3 :病斑面積占葉片的50-75% ；4 :病斑面積站葉片的75-100%。采用單因素方差分析，并進行F檢驗。表I微生物菌劑對黃瓜枯萎病的防治作用
權利要求
1.一種枯草芽孢桿菌仰況YJrY1S) EBC7,其在中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中心的保藏號為CGMCC No. 5586。
2.權利要求I所述枯草芽孢桿菌(ifeciパsubtilis) CGMCC No. 5586的制備方法， 其特征在于按如下步驟進行(X) Bacillus subtil is EBC7的分離從天津市西青區溫室采集健康的、“津優10號” 黃瓜根系；流水沖洗1-2 h后，在70%的こ醇中浸泡I min后，在2. 5%的NaClO中消毒6_8 min,無菌水沖洗干凈備用；(2)將步驟(I)得到的滅菌組織轉移到無菌研缽中加入PBS緩沖液(pH7.0)研磨，取研 磨汁液系列稀釋后，各取100 W涂布于NA平板上，并置于28°C條件下黑暗培養，每處理3 次重復；(3)挑取NA平板上的單菌落，劃線純化培養，得到枯草芽孢桿菌菌株；然后將枯草芽 孢桿菌接種于NB培養液中，150 rpm/min振蕩培養24 h后，將得到的枯草芽孢桿菌菌液在 15%的甘油中-80°C保存備用；其中的NA培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂 粉12g，補水至1000ml，pH7. 0-7. 2;NB培養基蛋白胨10g, NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。
3.一種提高黃瓜抗病性及促進其生長的微生物菌劑，其特征在于主要活性成分為權利 要求I所述的含量I. 5-4. 5 X 101°的枯草芽孢桿菌UaciBy1S subtil is EBC7)的發酵液。
4.權利要求I所述的微生物菌劑，其中所述的枯草芽孢桿菌發酵液是指含有芽孢桿 菌的營養體和/或芽孢以及抗菌活性代謝產物的ー個整體。
5.權利要求I所述微生物菌劑的制備方法，其特征在于枯草芽孢桿菌菌液在15%的 甘油中-80°C保存，使用時接種到固體NA培養基上活化培養；之后取ー環NA培養基上的 菌苔接種于含有NB培養液基的三角瓶中進行種子培養，150 rpm/min振蕩培養24 h后，以 1-3%的接種量接種于發酵瓶中發酵培養48 h，得到發酵液；其中的NA培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，瓊脂粉12g，補水至1000ml， pH7. 0-7. 2 ；NB培養基蛋白胨10g，NaCl 5g,牛肉膏3g，補水至1000ml，pH7. 0_7. 2 ;發酵培 養基黃豆粉10. OOg,玉米淀粉5. OOg,酵母粉0. 50g, KH2PO4 0. 35g，CaCl2 0. 20g,補水至 1000ml, pH7. 0-7. 2。
6.權利要求3中所述的微生物菌劑在制備作為促進黃瓜植株生長菌劑方面的應用。
7.權利要求3所述的微生物菌劑在制備作為防治黃瓜抗病性菌劑方面的應用。
8.權利要求7所述的應用，其中所述的黃瓜抗病性包括對黃瓜枯萎病或黃瓜白粉病的 抗性。
9.權利要求6-8任ー項所述的應用，其中黃瓜種子與微生物菌劑的重量份數比為201。
全文摘要
一種提高植物抗病性及促進其生長的微生物菌劑。本發明公開了一種提高黃瓜抗病性及促進其生長的微生物菌劑，主要活性成分為含量1.5-4.5×1010的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)EBC7發酵菌液。本發明進一步公開了微生物菌劑在提高黃瓜抗病性和促進其生長方面的應用。其中對黃瓜枯萎病的相對防治效果達到78.5%；對黃瓜白粉病的相對防治效果達到80.4%；并且顯著增加黃瓜的株高以及地上部鮮重、干重。本發明的枯草芽孢桿菌制劑可廣泛應用于農業生產，安全無污染，并且能夠恢復和保持土壤環境的生態平衡。
文檔編號C12R1/125GK102586136SQ201210003920
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者于海濤, 岳東霞, 張要武 申請人:天津市農業生物技術研究中心