專利名稱：牙鲆模式識別受體TLR21的cDNA全長序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體是牙鲆模式識別受體TLR21基因全長表達序列和所編碼的一種蛋白，以及該基因的克隆和檢測方法。
背景技術：
隨著世界范圍水產養殖規模的擴大，國內外水產品貿易及水產苗種跨區域交流日益頻繁，大大增加了水產養殖動物病原傳播的機會。同時，由于現代水產養殖的集約化、高密度生產方式及漁業水域環境的惡化，又常會引發養殖動物的應激反應，導致機體的免疫系統受到抑制。正是這些因素相互影響，出現了全球性的水產養殖動物發病率趨于頻繁、流行程度日益廣泛、經濟損失極為巨大的局面。運用現代生物技術作為水產養殖的技術支撐， 掌握病害的免疫防御技術是水產科技急需解決的首要問題，因此，近年來國際上魚類免疫學的研究逐漸受到重視。
在人類免疫學研究的歷史舞臺上，細胞免疫和體液免疫一直是兩個主角。相比之下，固有免疫的研究由于缺乏對其相應受體的系統認識，明顯滯后于獲得性免疫研究的進程。20世紀90年代，Janeway等有關“病原體相關分子模式”以及“模式識別受體”概念的提出，標志著固有免疫研究進入了一個嶄新的階段。魚類雖是低等脊椎動物，但已具備免疫的基本特性，與哺乳動物一樣，其體內也存在兩種免疫應答類型固有免疫應答和獲得性免疫應答。而相對于哺乳動物來說，魚類的固有免疫研究才剛剛起步。
Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)家族是動物識別入侵病原體的主要 “模式識別受體”，可識別幾乎所有病原生物的一些通用結構，是啟動固有免疫應答的關鍵。 一般認為TLR 1、2、4、5和6主要參與細菌成分的識別，而TLR3、TLR7和TLR8主要特異地針對病毒成分，TLR9對這二者均能夠識別。TLR14、21 23在某些魚類中存在，在哺乳動物中還未發現，有研究報道TLR21即可識別細菌成分，也可識別病毒成分。
牙鲆iParalichthys olivaceus)在我國俗稱牙片、偏口、比目魚，是我國北方海水工廠化養殖的主要名貴魚類品種，同時也是重要的海水增養殖魚類之一。牙鲆屬于鰈形目， 鲆科，牙鲆屬。牙鲆屬的魚類在南、北美洲東西岸較多，而亞洲沿岸只有牙鲆一種，主要分布于渤海、黃海、東海、南海以及朝鮮、日本、俄羅斯沿岸海區。近年來，腹水病、病毒性神經壞死癥等各種病害的爆發和流行給生產企業造成了巨大的經濟損失，嚴重阻礙了牙鲆養殖產業的發展。腹水病在牙鲆疾病中危害最為嚴重，該病從苗種到成魚均有發生，死亡率可達 50%-80%。由于目前對牙鲆免疫機理和機制的了解較少，尚無有效的免疫防治技術和治療方法。
TLRs是宿主免疫的必需分子之一，通過感知病原微生物體，識別病原相關分子模式，激活天然免疫系統。TLR21作為TLRs家族的成員，參與魚類免疫調節，在一定程度上反映了魚類的免疫能力，因此可以作為魚類疾病防治中免疫監測的指標。牙鲆模式識別受體TLR21基因結構的闡明，有助于人們更加深入地了解TLR21的功能及其與魚類免疫應答的關系，加深人們對魚類精細而復雜免疫應答過程的全面認識，從而為尋找診斷、預防和治療相關魚病的新策略以及抗病育種設計、抗病性轉基因魚設計、基因疫苗的設計和疫苗的安全使用等提供重要的理論基礎，并在魚類疾病防治，環境監測以及生態系統保護等方面發揮作用。發明內容
本發明的目的是提供一種牙鲆模式識別受體TLR21的cDNA序列及克隆方法。
本發明采用的技術方案是通過以近源物種TLR21基因的⑶S序列保守區設計兼并引物，通過RT-PCR反轉錄及擴增，結合RACE技術獲得牙鲆TLR21基因的全長表達序列。
TLR21基因CDNA全長3687 bp，含有四22 bp的開放閱讀框，編碼973個氨基酸， 其中前23個氨基酸序列為信號肽序列。TLR21基因的起始密碼子上游有五個中止密碼子 TAA,距poly (A)尾16個堿基位置存在加尾信號AATAA。結合這兩方面可以說明所得的cDNA 為TLR21基因的全長cDNA序列。TLR21基因編碼的蛋白質，分子量為112. 7 KDa，等電點為 8. 66。
本發明進一步公開了牙鲆模式識別受體TLR21的基因序列的克隆方法，其特征是包括如下主要步驟(1)健康牙鲆經免疫原免疫刺激后解剖分離頭腎組織由于TLR21基因為免疫相關基因，在病原感染后其表達量通常會有提高，因此在提取總RNA之前對健康牙鲆首先進行免疫刺激。選擇魚類的常見細菌感染源鰻弧菌為免疫原物，腹腔注射牙鲆體內，免疫M h后處死解剖分離頭腎組織。
(2)總RNA的提取和純化采用Trizol法從牙鲆頭腎中提取得到牙鲆頭腎總RNA?？俁NA純化采用DNA酶消化法。
(3)中間片段的克隆測序 (3. DcDNA第一鏈的合成以純化的牙鲆頭腎總RNA作為模板，以Oligo (dT) 16為反轉錄引物，進行cDNA第一鏈合成，得到的cDNA第一鏈，作為下述PCR擴增的cDNA模板。
(3. 2) PCR 擴增由于該基因較長，所以本發明選擇將中間片段分為兩段區域分別進行擴增。以前述所得的cDNA第一鏈作為模板，利用下述兩對引物進行TLR21基因中間片段1和中間片段2的擴增正向引物 1: TLR21-F1 :5，-TATCGTTACAACMGHATYCT-3’ 反向引物 1: TLR21-R1 5'-AAGATTYCCRAAAACMTC -3' 正向引物 2 TLR21-F2 5' -AATBTGTCCTBTAACffACAT-3' 反向引物 2 : TLR21-R2 5' -GTTCCTCAAGCCTTCTCA-3'擴增得到牙鲆TLR21基因cDNA的兩個中間片段，通過克隆測序，得到兩個中間片段序本步驟中，擴增體系可優選如下成分Sfigi模板(反轉錄產物)* 正向引物(20π1) ρ 反向引物βΟπΙ) — MgCl: (25 Λ) 10XPCR Buffer (with Mg Tag DNA Polymerase ( 5U/ML ) dNTPClOni)^
權利要求
1.牙鲆模式識別受體TLR21的基因序列，該TLR21基因cDNA全長3687bp，含有四22 bp的開放閱讀框，具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的基因序列，其中所述的核苷酸序列對應的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示；該序列編碼973個氨基酸，分子量為112. 7 KDa，等電點為8. 66。
3.權利要求1所述牙鲆模式識別受體TLR21基因序列在制備作為實時熒光RT-PCR檢測牙鲆疾病防治方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種牙鲆模式識別受體TLR21的cDNA全長序列及克隆和檢測方法。該序列全長3687bp，含2922bp的開放閱讀框，編碼973個氨基酸。本發明通過以近源物種TLR21的cds序列保守區設計兼并引物，通過反轉錄及PCR擴增，結合RACE技術最終得到牙鲆TLR21的全長cDNA序列。TLRs家族是動物識別入侵病原體的主要“模式識別受體”，通過感知識別病原體的相關分子模式，激活天然免疫系統。本基因的獲得為研究魚類TLR21的基因表達調控機理及免疫學功能奠定基礎，還可為魚類種群遺傳學及進化遺傳學研究提供分子水平材料。
文檔編號C12Q1/68GK102533775SQ20121000392
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者吳戀, 孫金生, 潘寶平, 耿緒云, 高虹 申請人:天津師范大學