專利名稱：來自大麗輪枝菌的分泌型激發(fā)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分泌型激發(fā)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉及一種來源于大麗輪枝菌的分泌型激發(fā)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
由土壤絲狀真菌大麗輪枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.)所引起的棉花黃萎病是威脅棉花生產(chǎn)的主要病害，多年來一直嚴(yán)重影響著我國(guó)棉花的品質(zhì)和產(chǎn)量。棉花黃萎病1914年始見于美國(guó)的費(fèi)吉尼亞州，隨后在其它州和世界各植棉國(guó)先后發(fā)現(xiàn)，1935年隨引進(jìn)美棉品種傳入我國(guó)，但危害不重。到二十世紀(jì)50年代以后，黃萎病在我國(guó)南北局部棉區(qū)陸續(xù)發(fā)生，擴(kuò)散蔓延速度加快。80年代末，黃萎病已遍及全國(guó)478個(gè)植棉縣(市)。進(jìn)入90年代以來，我國(guó)棉花黃萎病擴(kuò)展蔓延迅猛，尤其是1993、1995、1996、2002年在全國(guó)范圍內(nèi)連續(xù)大發(fā)生，損失嚴(yán)重。至今，我國(guó)大部分主產(chǎn)棉區(qū)已成為黃萎病重病區(qū)。黃萎病致病菌為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.),屬半知菌亞門，叢梗抱目，淡色孢科，輪枝菌屬。大麗輪枝菌的寄主范圍很廣，涉及十字花科、薔薇科、豆科、茄科、唇形花科、菊科等，目前已達(dá)660多種植物，并且還在逐年擴(kuò)大。由于棉花黃萎病危害的嚴(yán)重性和寄主的廣泛性，世界上不少國(guó)家的科技工作者對(duì)其進(jìn)行了深入研究。關(guān)于棉花黃萎病的致病機(jī)制有多種解釋，其中以導(dǎo)管堵塞和毒素致萎兩種觀點(diǎn)為主。60年代人們對(duì)該病菌致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)是由于菌體在導(dǎo)管內(nèi)定殖，并大量繁殖，同時(shí)刺激鄰近的薄壁細(xì)胞產(chǎn)生膠狀物質(zhì)及侵填體而堵塞導(dǎo)管，阻礙水分的運(yùn)轉(zhuǎn)，從而導(dǎo)致棉株萎焉。馬遠(yuǎn)莉等(馬遠(yuǎn)莉；甘莉；呂金殿；棉花各部位黃萎病菌在導(dǎo)管中的分布[J];陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)；1990年05期)對(duì)棉花各部位黃萎病菌在導(dǎo)管中的分布情況研究后認(rèn)為，正常的次生木質(zhì)部導(dǎo)管的潛在輸水能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過植物的總需水量，而且被堵塞的導(dǎo)管數(shù)占整個(gè)維管束的比例不大(最大的有17.7% )，因此導(dǎo)管堵塞不是導(dǎo)致棉花萎焉的主要原因。Keen等(Keen NT, Long M, Erwin DC(1972)Possible involvement of pathogen-producedprotein-1ipopoIysaccharide complex in Verticillium wilt of cotton.Physiol PlantPathol 2:317-331.)認(rèn)為，黃萎病菌在代謝過程中產(chǎn)生的毒素為有毒的蛋白質(zhì)，是一種酸性蛋白質(zhì)——脂多糖的復(fù)合體。該復(fù)合物對(duì)感病棉花品種的葉片與根組織的細(xì)胞膜具有破壞作用，使細(xì)胞內(nèi)K+和Na+大量滲漏。而抗病品種的細(xì)胞膜不具備毒素作用的受體位點(diǎn)而不受毒素破壞。越來越多的研究結(jié)果表明，大麗輪枝菌分泌的毒素是導(dǎo)致棉株萎焉，產(chǎn)生病癥的主要因素。在植物與病原物的識(shí)別過程中，激發(fā)子起著非常重要的作用。激發(fā)子可能是來源于病原菌的物質(zhì)分子，也可能是在病原菌的作用下植物釋放的化合物。激發(fā)子可以分為兩大類，非特異性的激發(fā)子和小種特異性的激發(fā)子。非特異性的激發(fā)子能夠在寄主和非寄主植物上引起防衛(wèi)反應(yīng)，而小種特異性激發(fā)子只能在特異品種的植物上引起防衛(wèi)反應(yīng)。在大麗輪枝菌與植物的互做過程中， 大麗輪枝菌分泌酸性蛋白質(zhì)——脂多糖復(fù)合體形式的毒素蛋白，其中可能含有大量的激發(fā)子蛋白。大麗輪枝菌新的分泌激發(fā)子基因的克隆將為我們深入研究棉花黃萎病病原大麗輪枝菌與寄主植物互作的分子機(jī)理，控制黃萎病的發(fā)生奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分泌型激發(fā)子蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供的分泌型激發(fā)子蛋白，名稱為VdNLP2 (Verticilliu dahliaeNepl-1ike protein 2),來自大_輪枝菌(Verticilliu dahliae Kleb.),為下述 I)或 2)或3)的蛋白質(zhì):I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列2的第20-239位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；3)將I)或2)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與分泌型激發(fā)子相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。序列表中序列2由239個(gè)氨基酸組成，其中前19個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽。所述VdNLP2蛋白在提高植物抗病基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。編碼上述VdNLP2蛋白的基因VdNLP2也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述VdNLP2蛋白的基因VdNLP2為如下a) _d)中任一所述的基因:a)其編碼序列是序列表中序列I的自5'末端第1-720位；

b)其核苷酸序列是序列表中的序列I ;c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)的基因雜交，且編碼所述VdNLP2蛋白的基因；d)與a)或b)所限定的基因具有90%以上的同源性，且編碼所述VdNLP2蛋白的基因。上述嚴(yán)格條件可為用0.1 X SSPE (或0.1 X SSC), 0.1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實(shí)驗(yàn)中65°C下雜交并洗膜。序列表中的序列I由720個(gè)核苷酸組成，為所述VdNLP2蛋白的的編碼序列，其中前57個(gè)核苷酸為VdNLP2蛋白信號(hào)肽的編碼序列。所述VdNLP2基因在提高植物抗病基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有所述VdNLP2基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組表達(dá)載體為在質(zhì)粒pBI121或pET_28a(+)的多克隆位點(diǎn)處插入所述VdNLP2基因，得到表達(dá)所述VdNLP2基因的重組質(zhì)粒。所述表達(dá)盒由能夠啟動(dòng)所述VdNLP2基因表達(dá)的啟動(dòng)子，VdNLP2基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列組成。所述重組菌具體可為攜帶有所述VdNLP2基因的農(nóng)桿菌，如EHA105。含有所述VdNLP2基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在提高植物抗病基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述提高植物抗病基因表達(dá)是按照如下步驟進(jìn)行的:1)提供攜帶含有所述VdNLP2基因的重組表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，或所述VdNLP2蛋白。2)將步驟I)的農(nóng)桿菌或VdNLP2蛋白注射植物葉片，誘發(fā)植物抗病基因的表達(dá)。所述VdNLP2蛋白，或所述VdNLP2基因，或上述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在如下al)或a2)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:al)引起植物(葉片)形成壞死斑；a2)引起植物(葉片)產(chǎn)生活性氧(H2O2)。上述al)中所述的形成壞死斑和a2)中所述的產(chǎn)生活性氧(H2O2)均是植物過敏性反應(yīng)的體現(xiàn)。植物過敏性反應(yīng)是細(xì)胞程序性死亡的重要表現(xiàn)形式之一，表現(xiàn)為植物在不親和病原菌侵染下受侵細(xì)胞及鄰近細(xì)胞的快速死亡，從而導(dǎo)致病原菌生長(zhǎng)受抑制，植物過敏性反應(yīng)過程對(duì)于植物抗病性有重要意義。在植物-病原菌(真菌、細(xì)菌、病毒)相互作用過程中，由不親和病原菌所導(dǎo)致的植物主動(dòng)防衛(wèi)反應(yīng)一一過敏反應(yīng)的早期，發(fā)現(xiàn)有大量活性氧產(chǎn)生(氧化突發(fā))，包括超氧陰離子、羥自由基、單線態(tài)氧和過氧化氫。這些活性氧被認(rèn)為有可能通過啟動(dòng)或參與植物細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞壁木質(zhì)化和蛋白質(zhì)聚合；直接殺死病原菌；作為信號(hào)介導(dǎo)植保素合成等而直接介入或啟動(dòng)植物過敏性反應(yīng)。現(xiàn)初步認(rèn)為“氧化突發(fā)”可能是細(xì)胞水平上植物對(duì)付病原菌侵染的第一步。上述植物為煙草(如Ncotiana benthamiana)、擬南芥(如 Arabidopsisthaliana col)或棉花(如新陸早16號(hào))。上述抗病基因具體如下:煙草的病程相關(guān)基因NbPR-5(X03913.1)和NbPR-1a (X06361.1);擬南芥的病程相關(guān)基因AtPRl (NM_127025.2)，乙烯途徑的關(guān)鍵基因AtACS6 (NM_117199.1)以及茉莉酸途徑的關(guān)鍵基因AtPDFl.2 (NM_123809.3);棉花的病程相關(guān)基因osmotin (AF304007.1)和棉酚合成途徑中的關(guān)鍵基因CADl-Cl (AF174294.1)。擴(kuò)增所述VdNLP2基因的全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。如 CGGATCCATGTCGCCGTCTCTCATCAGC 和 CGAGCTCCTACAGCGCCGCCTTCTGCAGG ；或者CGGATCCGCGCCGCTGCTCGAGTCGCGCG 和 CGAGCTCCTACAGCGCCGCCTTCTGCAG。
實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的分泌型激發(fā)子蛋白及其編碼基因在提高植物抗病基因表達(dá)、引起植物(葉片)形成壞死斑，以及引起植物(葉片)產(chǎn)生活性氧(H2O2)中具有重要作用。


圖1為EHA105/pBI121_VdNLP2注射煙草葉片后誘發(fā)了煙草葉片的過敏性壞死結(jié)果。其中，葉片的左側(cè)(A)為對(duì)照組；葉片的右側(cè)⑶為實(shí)驗(yàn)組。圖2為VdNLP2原核表達(dá)蛋白的純化結(jié)果。其中，泳道I為蛋白Marker ;泳道2為未經(jīng)純化的總蛋白；泳道3為純化后的VdNLP2蛋白。圖3為VdNLP2原核表達(dá)蛋白在煙草、擬南芥和棉花葉片上引起的過敏性壞死斑形成及活性氧產(chǎn)生的結(jié)果。其中，A為擬南芥葉片；B為煙草葉片；C為棉花葉片。A、B和C中均左側(cè)(I)為對(duì)照組，右側(cè)(2)為實(shí)驗(yàn)組；A、B和C中均上數(shù)第一排為壞死斑形成結(jié)果，第
二排為活性氧產(chǎn)生結(jié)果。圖4為VdNLP2原核表達(dá)蛋白在注射煙草、擬南芥以及棉花葉片后，誘發(fā)抗病相關(guān)基因高表達(dá)的結(jié)果。其中，A為擬南芥；B為煙草；C為棉花。具體的，A中a為以AtPRl基因?yàn)樘结樀膎orthern雜交結(jié)果；b為以AtACS6基因?yàn)樘结樀膎orthern雜交結(jié)果；c為以AtPDFl.2基因?yàn)樘结樀膎orthern雜交結(jié)果；d為轉(zhuǎn)膜后，用亞甲基藍(lán)染色液對(duì)膜染色后的擬南芥18S rRNA的定量結(jié)果。B中a為以NbPR-5基因?yàn)樘结樀膎orthern雜交結(jié)果；b為以NbPR-1a基因?yàn)樘结樀膎orthern雜交結(jié)果；c為轉(zhuǎn)膜后，用亞甲基藍(lán)染色液對(duì)膜染色后的煙草18S rRNA的定量結(jié)果。C中a為以O(shè)smotin基因?yàn)樘结樀膎orthern雜交結(jié)果；b為以CADl-Cl基因?yàn)樘结樀膎orthern雜交結(jié)果；c為轉(zhuǎn)膜后，用亞甲基藍(lán)染色液對(duì)膜染色后的棉花18S rRNA的定量結(jié)果。A、B和C中的泳道I均為對(duì)照組注射后12h ;泳道2均為對(duì)照組注射后48h ;泳道3均為實(shí)驗(yàn)組注射后12h ;泳道4均為實(shí)驗(yàn)組注射后48h。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、分泌型激發(fā)子基因VdNLP2的獲得本發(fā)明的發(fā)明人首先構(gòu)建了大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫(kù)，然后應(yīng)用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR (TAIL-PCR)查找部分轉(zhuǎn)化子T-DNA插入位點(diǎn)的序列。在對(duì)一個(gè)位點(diǎn)的序列分析中，獲得了基因VdNLP2的部分序列信息。然后應(yīng)用RACE技術(shù)獲得了序列表中序列I的分泌型激發(fā)子基因VdNLP2的ORF序列。具體操作如下:1、突變體庫(kù)的構(gòu)建大麗輪枝菌菌株V592 (菌株V592是采自新疆棉花田，現(xiàn)保存于本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室，可以通過與發(fā)明人所在研究所簽定材料移轉(zhuǎn)合約購(gòu)得)在PDA平板上25°C培養(yǎng)后將孢子接種于查氏液體培養(yǎng)基(1L查氏液體培養(yǎng)基中含有:2g NaNO3, Ig KH2P04，IgMgSO4 7H20，Ig KCL, 2mg FeSO4 7H20和30g蔗糖)中振蕩培養(yǎng)5-8天直至孢子濃度為1.0X 107/mL，孢子培養(yǎng)液用4層無菌紗布過濾以除去菌絲。4000rpm離心IOmin得到孢子并用含有終濃度為200mM的乙酞丁香酮(AS)的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(配方參見Gao, F.，Zhou，B.J.，Li，G.Y.，Jia,P.S., Li, H., Zhao, Y.L., Zhao, P., Xia, G.X., and Guo, H.S.2010.Aglutamic acid-richprotein identified in Verticillium dahliae from an insertional mutagenesisaffects microsclerotial formation and pathogenicity.PloS one 5:el5319.)將抱子濃度調(diào)節(jié)到(1.0X IO6-L OX IO7)/mL，得到分生孢子懸浮液。將農(nóng)桿菌EHA105(Gao，F(xiàn).，Zhou, B.J., Li, G.Y.，Jia, P.S.，Li，H.，Zhao, Y.L.，Zhao,P., Xia, G.X., and Guo, H.S.2010.A glutamic acid-rich protein identified inVerticillium dahliae from an insertional mutagenesis affects microsclerotialformation and pathogenicity.PloS one 5:el5319.)在 30ml 基本培養(yǎng)基(MM)(含有 Kan50mg/L，Rif 25mg/L)中28°C培養(yǎng)48h，4000rpm，離心lOmin。沉淀用誘導(dǎo)培養(yǎng)基(頂)洗兩次，重懸農(nóng)桿菌至OD值為0.2-0.3，并加200mM乙酞丁香酮(AS)、40mM MES以及Kan(50mg/0，281:，200印111振蕩培養(yǎng)611。然后吸取IOOii L上述培養(yǎng)物與IOOyl的前述步驟制備的分生孢子懸浮液混合，潑于放在共培養(yǎng)基上的孔徑為45 y m的47mm直徑的纖維素膜上，在28°C培養(yǎng)36h。用2mL基本培養(yǎng)基洗膜，收獲真菌和細(xì)菌培養(yǎng)物，然后取200 ii L兩涂于含100 ii g/mL氯B密磺隆(Cholorimuron)的選擇培養(yǎng)基平板上,抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng),挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)至選擇培養(yǎng)基平板進(jìn)行二次篩選并保存轉(zhuǎn)化子。獲得轉(zhuǎn)化子后，提取轉(zhuǎn)化子基因組 DNA。2、TAIL-PCR及RACE技術(shù)獲得突變基因序列本發(fā)明的發(fā)明人利用熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(TAIL-PCR)來獲得插入位點(diǎn)側(cè)翼序列。根據(jù)載體的已知序列在左右分別設(shè)計(jì)3個(gè)與其邊界距離不等的嵌套的特異性引物L(fēng)B1、LB2、LB3以及RB1，RB2、RB3，特異性引物的長(zhǎng)度約20bp，退火溫度(Tm) —般為58 68°C:LBl:gggttcctatagggtttcgctcatgLB2:catgtgttgagcatataagaaaccctLB3:gaattaattcggcgttaattcagtRBl:ggcactggccgtcgttttacaacRB2:aacgtcgtgactgggaaaaccctRB3:cccttcccaacagttgcacag再按照物種普遍存在的蛋白質(zhì)的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)一系列簡(jiǎn)并引物AD，簡(jiǎn)并引物相對(duì)較短，長(zhǎng)度為14bp，退火溫度(Tm)為30 48°C:ADI: (AGCT) TCGA (GC) T (AT) T (GC) G (AT) GTTAD2: (AGCT) GTCGA (GC) (AT) GA (AGCT) A (AT) GAAAD3: (AT) GTG (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (AGCT) AGAAD4: TG (AT) G (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (GC) AGAAD5:AG (AT) G (AGCT) AG (AT) A (AGCT) CA (AT) CA (AT) AGGAD6:CA (AT) CGIC (AGCT) GAIA (GC) GAAAD7:TC (GC) TICG (AGCT) ACIT (AT) GGAAD8: (GC) TTG (AGCT) TA (GC) T (AGCT) CT (AGCT) TGCAD9: (AT) CAG (AGCT) TG (AT) T (AGCT) GT (AGCT) CTGADlO:TCTTICG(AGCT)ACIT(AGCT)GGAADl1:TTGIAG(AGCT)ACIA(AGCT)AGG通過三輪的PCR反應(yīng)獲得側(cè)翼序列。其中第一輪的模板為步驟I得到的基因組基因組DNA，第二、三輪的模板分別為第一、二輪 的PCR產(chǎn)物。反應(yīng)程序如下:
權(quán)利要求
1.蛋白質(zhì)，為下述I)或2)或3): 1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 2)由序列表中序列2的第20-239位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； 3)將I)或2)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與分泌型激發(fā)子相關(guān)的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)在提高植物抗病基因表達(dá)中的應(yīng)用。
3.編碼權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于:所述基因?yàn)槿缦耡)-d)中任一所述的基因: a)其編碼序列是序列表中序列I的自5'末端第1-720位； b)其核苷酸序列是序列表中的序列I; c)在嚴(yán)格條件下與a)或b)的基因雜交，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因； d)與a)或b)所限定的基因具有90%以上的同源性，且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
5.權(quán)利要求3或4所述基 因在提高植物抗病基因表達(dá)中的應(yīng)用。
6.含有權(quán)利要求3或4所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于:所述重組表達(dá)載體為在質(zhì)粒PBI121或pET-28a(+)的多克隆位點(diǎn)處插入權(quán)利要求3或4所述基因，得到表達(dá)所述基因的重組質(zhì)粒。
8.權(quán)利要求6或7所述的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在提高植物抗病基因表達(dá)中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述蛋白，或權(quán)利要求3或4所述基因，或權(quán)利要求6或7所述的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒或重組菌在如下al)或a2)中的應(yīng)用: al)引起植物形成壞死斑； a2)引起植物產(chǎn)生活性氧。
10.根據(jù)權(quán)利要求2、5、8或9所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為煙草、擬南芥或棉花。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種來自大麗輪枝菌的分泌型激發(fā)子蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的分泌型激發(fā)子蛋白為下述1)或2)或3)1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列2的第20-239位氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；3)將1)或2)所限定的蛋白質(zhì)的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加，且與分泌型激發(fā)子相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的分泌型激發(fā)子蛋白及其編碼基因在提高植物抗病基因表達(dá)、引起植物(葉片)形成壞死斑，以及引起植物(葉片)產(chǎn)生活性氧(H2O2)中具有重要作用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103193874SQ201210006128
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者郭惠珊, 周邦軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所