專利名稱：降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內生細菌的獲得方法和在防治植物黃萎病上的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及植物內生細菌通過降解大麗輪枝菌毒素的方法來有效防治植物黃萎病的危害。
背景技術：
大麗輪枝菌可引起植物黃萎病，該病是一種危害性極大的維管束系統病害，該病特征感病植物葉片變黃，久旱遇雨，葉片驟然萎蔫，故稱“黃萎病”。大麗輪枝菌寄主范圍廣泛，其寄主植物多達660種。其中農作物184種，觀賞植物323種，雜草153種。在農作物中對棉花、馬鈴薯、茄子、番茄、辣椒等都具有侵染性，且能夠相互轉染。而禾木科作物比如水稻、麥類、玉米等以及某些雜草則侵害很少。近年來，黃萎病在我國主產農作物區相繼造成嚴重危害，黃萎病已成為嚴重影響我國農作物高產穩產的主要障礙，尤以落葉型黃萎病為嚴重。大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)歸屬于淡色菌科叢梗孢輪枝菌屬，具有獨特的形態學特征。通過顯微鏡觀察，該菌分生孢子梗細，數量少且透明，分生孢子較小，一般為3-6X1. 5-2. Oym,富含黑色微菌核。大麗輪枝菌以微菌核和孢子形態存在土壤中，條件適宜微菌核和孢子萌發產生侵染器官，從植物根部侵入進入植物體內，部分菌體形成單細胞形態在植物根莖葉的篩管中傳導和增殖，并分泌毒素，刺激植物細胞增生，堵塞篩管，引起植物萎蔫。大麗輪枝菌屬土傳性非專性寄生菌，在溫度25_28°C，相對濕度在80%以上，此病容易發生流行。棉花定植后I個月左右開始，地上部位出現病癥，一直到收獲結束時持續發病。最初，下部葉片局部萎蔫，葉邊上卷。之后，病部由黃白色轉為黃色，葉片邊緣變色較多，以小葉脈為中心呈楔形。接下來，變色部位逐漸擴大，整片小葉變黃，慢慢褐變枯死。病害加重時,上部葉片也依次發病枯死,并導致下部葉片慢性枯萎,剖檢病株葉柄和整,可見導管部有黃褐變。生物防治被認為是最具有發展潛力的重要防治方法，而獲得高效拮抗菌是生物防治的基礎。吳獻忠(植物病理學報，1996,26(3) :281-282)采用等電點聚焦技術分析棉花黃萎病菌纖維素酶同工酶，分析表明電泳譜帶為8條的均為落葉型菌系。將我國棉花黃萎病菌劃分為3個生理型，即落葉型黃萎菌株致病力最強，占15. 7% ;葉枯型菌株為中等致病力，占54. 2%;黃斑型菌株屬弱致病力，占30.1%。王慧萍等(南京師范大學報，2005, 28(2) :83-85)篩選了一株抗茄子黃萎病的芽孢桿菌F53，改良后的該菌株發酵條件對黃萎病菌具有很好的抑菌活性。雷白時(安徽農業科學，2009, 37(2) :672-674)從各地的土樣中分離到84株拮抗細菌菌株，復篩得到強抑菌活性的拮抗細菌7-30菌株。李術娜(中國農學通報，2009, 25(15) :26-30)考察了拮抗細菌2_70在棉花體內的定殖試驗，結果表明該菌不僅能在滅菌土和非滅菌土中定殖，而且五個月后仍能保持較高的抑菌活性。關于黃萎病菌的致病機制，病原菌在植株體內產生毒素作用的結果。在病原菌侵染寄主，即由粘附接觸一入侵一繁殖擴展一顯癥，在這個病理學過程中，病原菌毒素所扮演的主導作用受到越來越多的研究支持。章元壽(真菌學報，1991，10(3) :169-181)等越來越多的研究表明，大麗輪枝菌分泌的毒素是導致黃萎病的關鍵因素，其致萎作用可能是能夠凝固植物細胞原生質體，破壞原生質膜的半透性，擾亂棉株的水分平衡，導致植株體內脫落酸含量增加，使棉株體內膨壓改變，從而引起萎蔫癥狀。在液體培養基中，黃萎病菌分泌毒素，這種毒素可誘發與黃萎病菌類似的致病癥狀Pegg et al(Nature, 1965，208:1228-1229)。經研究表明，大麗輪枝菌產生的毒素是一種糖蛋白復合體(protein-1 ipopoly-saccharide complex, PLPC),其中的蛋白質成分是致萎的活性部分。Nachmias (Physiol. Plant Pathology, 1985，26:43-55)在感病的馬鈴薯中用PLPC的抗血清檢測到了致病抗原毒蛋白的存在，而健康的馬鈴薯中未能檢出。這充分證明PLPC具有內源致病作用，直接參與了病原菌的致病過程。Chu et al (The PlantJournal, 1999，9(41) :972-976)報道得到一個26kDa的糖蛋白，它能誘導產生植保素并能使植物萎蔫。由于研究者的研究方法和手段不同，分離到的許多種毒素蛋白。章元壽等(植物病理學報，1991，21 (I) :49-52)通過纖維素柱層析和瓊脂糖凝膠層析，得到一個具有致萎活性的峰蛋白，并發現致病力強的菌株毒素所含的蛋白質和多糖的量高于致病力弱 的菌株毒素。呂金殿等(中國農業科學，1995，28(2) :58-65)用親和層析法分離純化毒蛋白，分析顯示，它是一種糖蛋白，其蛋白質和糖的含量分別是8. 53%和14.7%。。陳旭升等(江蘇農業學報，2000, 16:10-14)對3個典型黃萎病菌分泌毒蛋白進行層析分離，皆得到兩個致萎蛋白峰，分子量平均值的范圍分別在20kDa和96kDa。傅正擎等(江蘇農業學報，1999，15(4) :211 215)將從棉株體內分離獲得的內生菌Ala、73a接入棉花黃萎病菌菌株JClB (落葉型)、BP2(非落葉型)的Czapek培養液中，培養不同時間后提取粗毒素，結果表明對BP2產毒素抑制最強的為Ala菌體，抑制率達51. 97%;對JClB產毒素能力抑制最強的是73a菌體，抑制率為72. 60% ;液體培養的黃萎病菌加入內生菌或代謝物后，其黃萎病菌毒素粗提液對棉苗致萎度下降。查閱國內和國外發表的文章，僅查到關于大麗輪枝菌毒素的研究，未查到對毒素降解的研究報道；對于植物內生細菌與大麗輪枝菌的研究，僅查到內生細菌加入離體培養的大麗輪枝菌中能夠抑制毒素蛋白的產生，未查到內生細菌與毒素蛋白共同作用，把毒素蛋白降解或者轉化成其他蛋白的研究報道。關于應用微生物的功能防治植物黃萎病的公開專利資料201210021045. 8公開了一株棉花內生真菌在棉花黃萎病防治中的應用；201210099459. 2公開了大麗輪枝菌弱毒株的應用；這兩個專利是關于真菌的應用。200810183075. 2和20081083072. 9公開了地衣芽孢桿菌的應用；200810183071.4是枯草芽孢桿菌的應用；200910192921. I是銅綠芽孢桿菌的應用；201110197653.x是固氮菌的應用；這五個專利的細菌分離自植物根際，即根際細菌的應用。有關植物內生細菌的專利僅查到200510020328. O中的內生細菌誘導馬鈴薯抗病；201110082094. 8中的內生細菌防治松樹枯梢病；201210049875. I中的內生細菌防治水稻稻瘟病；201110377736. 7分離的內生細菌作為土壤修復劑；201110352670. 6的內生細菌生產防治小麥紋枯病的農藥。公開的資料中未查詢通過離體篩選降解毒蛋白的植物內生細菌的方法和應用植物內生細菌在植物體內通過降解黃萎病菌毒素的方法來防治黃萎病的應用。

發明內容
本發明的目的是提供一種降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內生細菌的獲得方法和在防治植物黃萎病上的應用。本發明的研究人員通過對大麗輪枝菌毒素蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳測定證明大麗輪枝菌的發酵液經100°c水浴lh，6層濾紙布氏漏斗真空抽濾，棄菌絲體，濾液8000r/min離心lOmin，取上 清液依次經O. 45μπι和O. 22 μ m微孔濾膜真空抽濾得到的毒素液中含有8個蛋白條帶，分子量分別為40kD、38kD、35kD、33kD、30kD、26kD、24kD和16kD。毒素與減毒細菌混合培養后，發現失去致萎活性的培養體系中均缺少了一個26KD的蛋白條帶。應用此方法進一步篩選新分離的菌株，進一步證實能降解毒素蛋白條帶的菌株均能有效預防大麗輪枝菌毒素對棉苗的致萎作用。本發明所述的降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內生細菌的獲得方法，是把從植物體內分離得到的植物內生細菌的菌體與大麗輪枝菌毒素混合培養，應用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定混合培養后的蛋白條帶與原毒素的蛋白條帶進行比較，混合培養體系缺少了 26KD蛋白條帶的為目的菌株。所述植物內生細菌是分離自各種植株體內，分離方法是常規的表面消毒法，植物內生性的測定是采用無菌苗接種再分離的方法。所述大麗輪枝菌毒素是將大麗輪枝菌發酵液100°C水浴lh，6層濾紙布氏漏斗真空抽濾，棄菌絲體，濾液8000r/min離心IOmin,取上清液依次經O. 45 μ m和O. 22 μ m微孔濾膜真空抽濾，此濾液為毒素液。本發明還公開了由上述所獲得的降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內生細菌菌株的應用，是將所述獲得的目的菌株接種到植物體內能在植物體內傳導和繁殖；在植物體內與侵入的大麗輪枝菌菌體密切接觸，能有效的降解大麗輪枝菌侵染植物后產生的毒素蛋白，使植物不表現致萎癥狀，確保植物正常生長，減輕和阻止黃萎病菌對各種植物的危害。本發明具體的實現方式如下I.大麗輪枝菌發酵培養將斜面保存的大麗輪枝菌病菌接種于IOOmL Czapek培養基(g/L =NaNO3 3. O，MgSO4 ·7Η20 O. 5, KCl O. 5，K2HPO4L O，FeSO4 · 7Η20 O. Olg，蔗糖 30，pH 7. 2)，在 25°C黑暗條件下120r/min振蕩培養25d。3.大麗輪枝菌毒素液制備將上述培養的發酵液100°C水浴lh，6層濾紙布氏漏斗真空抽濾，棄菌絲體，濾液8000r/min離心lOmin，取上清液依次經O. 45 μ m和O. 22 μ m微孔濾膜真空抽濾，此濾液為粗毒素液即VD液。4.毒素液蛋白含量的測定蛋白質標準曲線制作:分別吸取標準蛋白溶液(mL) 0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0，分別加pH 7. O的O. 2mol/L PB溶液至ImL,然后加入G-250試劑5mL,充分振蕩，在5_20min內用分光光度計測定595nm處吸光度。以蛋白質含量為橫坐標，A595的值為縱坐標繪制標準曲線。蛋白含量的測定取毒素溶液O. 5mL加pH 7. O的O. 2mol/L PB溶液至lmL，然后加G-250試劑5mL，充分振蕩，在5-20min內于595nm處測定光密度A，與標準曲線對照，得出粗蛋白含量達到25-35 μ g/ml的濃度時為合格毒素溶液。5.植物內生細菌的分離和菌懸液的制備從不同種植地采集棉花植株，其根、莖、葉分別用自來水沖洗晾干后，各稱取l_2g，1%次NaClO浸泡5min，無菌水沖洗5次，再用O. 1%升汞表面消毒，葉片lmin，根、莖3min，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干。將葉片放入無菌組織勻漿器內，根和莖部放入無菌研缽中，每樣品加5-10mL無菌水碾碎，依次用無菌水稀釋至10_4，靜止15min后，各取200 μ I涂平板，每處理重復3次。取最后一次沖洗的無菌水200yL涂平板，驗證消毒是否徹底。28 0C黑暗培養3-7d，根據菌落形態、顏色等挑取單菌落，按常規方法純化后保存。用接種針在平板上蘸取一環篩選到的內生細菌，接種到裝有30mL NB (牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml)培養液的250mL三角瓶中，在28°C搖床上150r/min振蕩 培養48h。發酵液8000r/min離心5min，留菌體，用無菌水沖洗3遍以出去NB培養基中成分，無菌水稀釋菌體至108cfu/mL，即稀釋液0D_ = O. 5±0. 02時為制備的菌懸液。6.分離的細菌內生性的測定棉花種子經清水浸泡30min,用O. I %升萊處理15min,用無菌蒸懼水洗5次,再于I %的NaClO中浸泡5min后，再于無菌蒸餾水洗5次，用無菌鑷子將種子插入土壤浸液培養基中，25+1 °C暗培養48h，再置光照培養箱中培養，直到小苗長出新葉。將菌懸液以傷根法穿刺接種無菌苗，O. 5ml/株，每菌處理15-20株。7_10d后用上述方法分離內生細菌，內生性優良的菌株植物體內含有菌體105cfu/g以上。7.毒素和菌體混合培養體系中蛋白硫酸銨沉淀和透析( I)毒素蛋白的硫酸銨沉淀將菌懸液和毒素按照I :I 2 :1的體積比例混合建立培養體系和毒素溶液100°C水浴Ih以殺死菌體和雜蛋白，取上清8000r/min離心5min，再取上清經O. 22 μ m細菌濾膜真空抽濾。以90%的硫酸銨沉淀毒素蛋白。將固體硫酸銨放入60°C烘箱除潮，稱取66. 2g/100mL的硫酸銨并將其磨成粉末。把含毒素液的燒杯放在磁力攪拌器上，緩慢均勻的向毒素液加入硫酸銨粉末，完全溶解后，該燒放杯4°C冰箱中靜置過夜。(2)毒素蛋白透析透析袋前處理將透析袋剪成10cm-20cm長的小段，放在2% (w/v) NaHC03和ImMEDTA溶液中煮沸lOmin，用蒸餾水徹底清洗透析袋，然后再在ImM EDTA溶液中煮沸IOmin,冷卻后，存放于4°C，確保透析袋始終浸在溶液中，使用前用蒸餾水裝滿透析袋再排出以清洗內壁，取出時帶手套。將(I)靜置的蛋白4°C 12000r/min離心20min，棄上清液，向沉淀中加入適量的5mMpH 7. O的磷酸鈉鹽緩沖液，振蕩搖勻，轉移到3. 5kD透析袋中，封口。在5mM pH 7. O的磷酸鈉鹽緩沖液中透析，每隔6h更換一次磷酸鈉鹽緩沖液，每次800mL，共更換5_6次以透析完全。透析后的蛋白液以5mL/管的量裝入50mL的離心管中，放置_80°C冰箱過夜，次日經MAXI dry Iyo真空濃縮凍干系統濃縮成蛋白干粉，備用。8.聚丙烯酰胺凝膠電泳測定樣品前處理取O. Ig干粉溶于500 μ L雙蒸水中，12000r/min離心Imin去雜質，上清為SDS-PAGE電泳的蛋白樣品。制備5%的濃縮膠和13%的分離膠的不連續聚丙烯酰胺凝膠，取IOyL樣品與10 μ L樣品處理液混合，100°C金屬浴水處理2min, 12000r/min離心30s,棄沉淀混勻后點樣10 μ L到膠孔中，Marker分子量為10kD_200kD。跑膠濃縮膠電壓為75V，待樣品進入分離膠后升高電壓至140V，待溴酚藍指示劑離凝膠底端約Icm處停止電泳儀，剝下凝膠，在染色液中染色lh，再在脫色液中脫色2-3h，觀察條帶位置。制膠方法及電泳注意事項等參考(陳鈞輝等.生物化學實驗[M].北京科學出版社，2003，110-114)。9.蛋白膠電泳條帶的分析毒素溶液中含有的蛋白分子量分別為40kD、38kD、35kD、33kD、30kD、26kD、24kD和16kD。混合培養體系中如果缺少26kD的蛋白條帶，說明該菌株具有減毒活性。10.盆栽棉苗的驗證將供試棉籽浸入75%的乙醇溶液2min除去表面的雜菌，用無菌水沖洗5次，置25°C培養箱內催芽。棉籽冒白尖后播種在裝有無菌土的花盆中，溫室中培育，待其長至3-4 葉期時接種內生細菌，接種第2d開始澆灌VD毒素10mL，連續澆灌至40d ;調查植株生長狀況，拔出小苗測其干重、鮮重和株高，根據株高和干重的數值確定內生細菌的減毒效果。


圖I植物內生細菌DPlO的16S rDNA系統發育樹。圖2是SDS-PAGE檢測共培養后三株內生細菌對大麗輪枝菌毒素蛋白的減毒作用。
具體實施例方式以下是本發明的實施例，但本發明的內容并不局限于此。實施例一植物內生細菌的分離和內生性測定(I)菌種的分離從不同種植地采集棉花、番茄、草莓、黃瓜等植株，其根、莖、葉分別用自來水沖洗晾干后，各稱取l_2g, 1%次NaClO浸泡5min,無菌水沖洗5次,再用O. 1%升汞表面消毒，葉片lmin，根、莖3min，無菌水沖洗5次，用無菌濾紙吸干。將葉片放入無菌組織勻漿器內，根和莖部稱重放入無菌研缽中碾碎，取Ig樣品加9mL無菌水為10—1，依次用無菌水稀釋至10_5，靜止15min后，各取200 μ I涂平板，每處理重復3次。取最后一次沖洗的無菌水200 μ L涂平板，驗證消毒是否徹底。28°C黑暗培養3-7d，根據菌落形態、顏色等挑取單菌落，按常規方法純化后保存。(2)內生性的測定棉花種子經清水浸泡30min,用O. I %升萊處理15min,用無菌蒸餾水洗5次，再于I %的NaClO中浸泡5min后，再于無菌蒸餾水洗5次，用無菌鑷子將種子插入土壤浸液培養基中，25+1 °C暗培養48h，再置光照培養箱中培養，直到小苗長出新葉。將菌懸液以傷根法穿刺接種無菌苗，O. 5ml/株，每菌處理15-20株。7_10d后用(I)分離內生細菌的方法分離植株體內的內生細菌，記錄每個稀釋溶液平板中的細菌的菌落數量，按照公式計算出每克新鮮植株體積內分離出的細菌菌落數量。計算公式是每克植物組織內含的菌落數=同一稀釋度重復的菌落平均數X稀釋倍數X5。判斷內生性優良的菌株是該菌株在植物體內含有菌體105cfu/g以上。經(I)和(2)共分離了 56株內生細菌，經(2)測定有17株內生細菌在棉花體內定殖數量達到105cfu/g以上，這些菌株分別命名為XJL12、XJL12、XJL15、W1、Y11、CCM3、CCM7、CCM9、DPI、DP8、DP10、DP12、DP14、HI、SZ2、SZ5、XG32，用于下述實驗。
實施例二植物內生細菌的鑒定實施例一分離的植物內生細菌菌株以DPlO為例DP10劃線接種于NA培養基上，在28°C條件下培養24h，先在I. 5mL離心管中加入30 μ L無菌水，用接種針挑取少量菌體于水中制成懸液，煮沸lOmin，迅速冰浴5min，4°C 12000r/min離心5min，上清液作為PCR模板。反應體系(50μ L) : IOXPCR buffer (5 μ L) > dNTP mixture (lOmmol/L) I μ L>MgC12(25mmol/L)4y L,引物 PO (5 μ mol/L) I μ L、引物 P5 (5 μ mol/L) I μ L、Taq DNApolymerase (5U/L) 0. 5 μ L>5 μ L 上清液作為 Template 模板、加入 ddH20 32. 5 μ L 至終體積50 μ L0設計16SrDNA 引物正向引物5’ -GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO. I)反向引物5’ -CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’ (SEQ ID NO. 2)
均由上海生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應程序95° C預變性5min;94° C變性40s ;46 °C退火40s，72 °C延伸I. 5min, 30個循環，72°C冷卻lOmin, 4°C至恒定。PCR結束后，取3_4μ L跑瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶的大小及純度。制備50mL濃度為1%的瓊脂糖凝膠，用100V電壓跑膠，結束后在割膠儀上割取目的熒光條帶，按照SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒上的方法回收PCR產物，并用瓊脂糖凝膠電泳法檢測回收條帶的純度。擴增后PCR產物由上海生工生物技術有限公司測序。從GenBank中調取待測菌所在種、屬、科、目各幾株菌株的16SrDNA序列用于系統發育學分析，所有菌株的16SrDNA的全序列用ClustalX (1.8)軟件包排序，選擇大腸桿菌(Escherichia coli)為外群，用MEGA version5軟件包中的Kimura2_Parameter Distance模型計算進化距離，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，1000次隨機取樣，計算自引導值(Bootstrap)以評估系統發生樹的置信度。植物內生細菌DPlO的16SrDNA序列如SEQ ID NO. 3所示。上海生工生物工程有限公司測得DPlO的16S rDNA部分序列，長度為I. 5kb左右，將序列檢測后提交GenBank，登錄號分別為HQ718411。在NCBI數據庫上進行Blast比對，發現DPlO與B. subtilis的尋找序列同源性達到99%以上的菌株。，隨機調取數據庫中已鑒定的芽孢桿菌種屬及其上行科目菌株的16SrDNA序列構建系統發育樹，如圖I。根據測定結果DPlO鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。實施例三大麗輪枝菌毒素VD液和植物內生細菌菌懸液的制備所使用的大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)可以是公開的標準菌株如中國農業微生物保藏中心ACCC36120、ACCC36129、ACCC36217、ACCC36211，也可以如實施例四分離得到。將大麗輪枝菌發酵液100°C水浴lh，6層濾紙布氏漏斗真空抽濾，棄菌絲體，濾液8000r/min離心lOmin，取上清液依次經0. 45 μ m和0. 22 μ m微孔濾膜真空抽濾，此濾液為粗毒素液即VD液。用接種針蘸取一環活化的內生細菌菌株(SZ5、CCM9和DPlO菌株)，接種到裝有30mLNB培養液的250mL三角瓶中，在28°C搖床上150r/min振蕩培養48h。發酵液8000r/min離心5min，留菌體，用無菌水沖洗3遍以出去NB培養基中成分，無菌水稀釋菌體至IO8Cfu/mL，即稀釋液OD600 = 0 . 5 ±0. 02。該菌懸液備用。
實施例四大麗輪枝菌的分離和產毒素測定采集田間發生黃萎病的病株,取5-10cm的莖，在實驗室內用自來水沖凈，再用無菌水反復沖洗數遍，用滅菌的刀剖開后用無菌水洗下莖部篩管中的孢子配制成孢子懸浮液，用移液槍吸取O. 5mL注入PDA平板培養基涂布均勻。于28°C倒置培養24_72h，期間用倒置顯微鏡檢測孢子萌發情況，當大部分孢子已萌發，但芽管尚未分枝時，挑單孢移至TOA固體培養基上，28 °C培養5-10d，獲得單孢菌株。致病力鑒定采用無底營養缽培育棉苗，經單孢分離的黃萎菌接入察氏液體培養基，于28°C恒溫培養10d，培養好的發酵液經紗布過濾后孢子濃度為2. O X IO7個/mL，注射法接種到中棉所45棉花小苗上。接種一片真葉平展期的棉花苗，于接種3周后植株普遍發病時調查致病型，選取與對照相比使棉苗植株萎蔫快，落葉多的菌株，保存備用。產毒素測定將供試棉籽(中棉所45)浸入75%的乙醇溶液2min除去表面的雜菌，用無菌水沖洗5次，置25°C培養箱內催芽，每天沖洗種子和容器，待棉種露白時備用。分別 取分離的棉花黃萎病菌的發酵液，選擇發芽一致的棉種放于鋪有無菌濾紙的培養皿中，每皿加入發酵液4ml，以清水處理棉花種芽為參照，每處理3個重復，25°C黑暗培養，每天觀察1-2次，記錄下胚軸的長度及根的變化情況。與清水對照相比使棉芽的根變褐最快的菌株是產毒素最快的菌株。實施例五毒素和菌體混合培養體系的建立( I)混合培養比例的確定將實施例三制備大麗輪枝菌毒素液與分離的植物內生細菌菌懸液以3:1，2:1，1:1，1:2，1:3的比例混合，總體積為IOOmL,于28°C、150r/min搖床上培養48h。發酵液100°C水浴Ih以殺死發酵液里的菌體和雜蛋白，取上清8000r/min離心5min，再取上清經O. 22 μ m細菌濾膜真空抽濾，取上清IOmL裝于滅過菌的青霉素瓶中，將用滅菌土培養的二葉期棉苗放入其中，每瓶3株棉苗，每處理3瓶，每天觀察1-2次棉苗生長狀況，連續觀察5d，檢測抽濾液的活性，棉花幼苗生長狀況與清水對照相同為最佳比例。如表5. I顯示內生細菌DPlO菌株，Cl組VD液和菌懸液比例為2:1達到完全減毒，是該菌共培養的最佳比例，此時毒素蛋白含量為27. 39 μ g/mL, DPlO的菌懸液濃度3. 3X107cfu/mL ；CCM9菌株，Cl組VD液和菌懸液比例為1:1達到完全減毒，為該菌共培養的最佳比例，此時毒素蛋白含量為20. 98 μ g/mL, CCM9的菌懸液濃度5. O X 107cfu/mL ；SZ5菌株，Cl組VD液和菌懸液比例為1:1達到完全減毒，為該菌共培養的最佳比例，此時毒素蛋白含量為20. 98 μ g/mL, SZ5的菌懸液濃度 5. OX 107cfu/mL。表5. I三株內生細菌與大麗輪枝菌毒素混合培養體系比較
權利要求
1.一種降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內生細菌的獲得方法，是把從植物體內分離得到的植物內生細菌的菌體與大麗輪枝菌毒素混合培養，應用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定混合培養后的蛋白條帶與原毒素的蛋白條帶進行比較，混合培養體系缺少了 26KD蛋白條帶的為目的菌株。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述植物內生細菌是分離自各種植株體內，分離方法是常規的表面消毒法，植物內生性的測定是采用無菌苗接種再分離的方法。
3.根據權利要求I所述的方法，其特征在于所述大麗輪枝菌毒素是將大麗輪枝菌發酵液100 °C水浴I h,6層濾紙布氏漏斗真空抽濾,棄菌絲體,濾液8000 r/min離心10 min,取上清液依次經O. 45 μ m和O. 22 μ m微孔濾膜真空抽濾,此濾液為毒素液。
4.由權利要求I所述方法獲得的降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內生細菌的應用，是將所述獲得的目的菌株接種到植物體內能在植物體內傳導和繁殖。
全文摘要
本發明涉及一種具有防治植物黃萎病功能的內生菌的獲得方法及其應用，屬于生物技術領域。所述的降解大麗輪枝菌毒素蛋白的植物內生細菌的獲得方法，是把從植物體內分離得到的植物內生細菌的菌體與大麗輪枝菌毒素混合培養，應用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定混合培養后的蛋白條帶與原毒素的蛋白條帶進行比較，混合培養體系缺少了26KD蛋白條帶的為目的菌株。該方法目標明確，機理清楚。解決了生物防治土傳病害中的生防微生物受土壤環境影響大，效果不穩定的缺點。本發明利用大麗輪枝菌的致病特點和植物內生細菌在植物體內傳導的特性，直接針對引起植物病害的黃萎病菌毒素篩選降解毒素的內生細菌以達到有效防治植物黃萎病的目的。
文檔編號C12R1/125GK102911894SQ20121035322
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月20日 優先權日2012年9月20日
發明者閆淑珍, 陳雙林, 許芳 申請人:南京師范大學