專利名稱：識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及到能識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列，特別涉及到對炭疽芽胞桿菌芽孢特異性檢測和鑒別的多肽序列。本發明也提供了應用含有該序列的多肽和蛋白質，用于炭疽芽胞桿菌芽孢鑒別與檢測的方法。
背景技術：
炭疽是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，其病原體為炭疽芽胞桿菌。炭疽芽胞桿菌的芽孢因其極大的抗逆性和生物毒性，是備受關注的生物戰劑和生物恐怖原之一。由于炭疽芽胞桿菌與蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌以及蕈狀芽胞桿菌非常近緣，從而給炭疽芽孢的有效鑒別與快速檢測帶來困難。發展能特異性識別并具有高親和力的生物標志物用于炭疽芽胞桿菌芽孢的檢測與鑒定具有重要意義。到目前為止，有許多炭疽芽孢的檢測生物標志物被發現。其中包括針對炭疽芽抱表面保護性抗原的抗體(Long, G. W. and Τ. O 1 Brien (1999). " Antibody-based systems for the detection of bacillus anthracis in environmental samples. " J_ Appl Microbiol 87(2) :214. ；C ote，C. K.，C. A. Rossi，et al. (2005). " The detection of protective antigen (PA)associated with spores of Bacillus anthracis and the effects of anti—PA antibodies on spore germination and macrophage interactions. " Microb Pathog 38 (5-6) :209-225. ；Wang, D. B.，L.J.Bi，et al. (2009). 〃 Label-free detection of B. anthracis spores using a surface plasmon resonance biosensor. " Analyst 134(4) :738-742.)，篩選出的單鏈抗體(Wang，S. Η·， J.B.Zhang,et al. (2006). 〃 Construction of single chain variable fragment (ScFv) and BiscFv-alkaline phosphatase fusion protein for detection of Bacillus anthracis. " Anal Chem 78(4) :997-1004.)，以及通過嗷菌體表面展示技術篩選出的多妝序列(Williams, D. D.，0. Benedek, et al. (2003). " Species-specific peptide ligands for the detection of Bacillus anthracis spores. 〃 Appl Environ Microbiol 69(10) :-6288-6293. ；Sainath Rao, S.，Κ. V. Mohan, et al. (2010). " Peptides panned from a phage-displayed random peptide library are useful for the detection of Bacillus anthracis surrogates B. cereus 4342 and B. anthracis Sterne. Biochem Biophys Res Commun 395(1) :93-98.)等等。但是目前的這些生物標志物往往對炭疽芽孢的特異性與親和力不好。plyG是炭疽芽胞桿菌Y噬菌體產生的專一性裂解炭疽芽胞桿菌的裂解酶 (Schuch，R.，D. Nelson, et al. (2002). " A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis. " Nature 418 (6900) :884-889.)。該酶具有一個酸胺酶活性區段，具有很高的殺菌活性和特異性，專一性的裂解炭疽芽胞桿菌，而對其它芽胞桿菌以及革蘭氏陰性細菌沒有作用。現有研究已找到在PlyG上含有一段氨基酸序列能特異性的識別炭疽芽胞桿菌的營養體(Fujinami，Y.，Y. Hirai, et al. (2007). " Sensitivedetection of Bacillus anthracis using a binding protein originating from gamma-phage. " Microbiol TmMirioI 51(2) : 163-169.),但 plyG 上是否含有能識別炭疽芽胞桿菌芽孢的氨基酸序列還不知道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種特異識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列。還提供含有該多肽序列的多肽和蛋白質，用于檢測炭疽芽胞桿菌芽孢的探針，或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體的應用。本發明解決其技術問題采用以下的技術方案本發明提供的識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列，是一段能識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列SBDl，其氨基酸序列為NVRTHQSWSGKYCPH觀LAEG。所述多肽序列SBDl是通過體外截斷炭疽芽胞桿菌Y噬菌體裂解酶plyG方法而獲得。含有所述SBDl的多肽和蛋白質具有能特異識別炭疽芽胞桿菌芽孢的能力。含有所述SBDl的多肽和蛋白質直接用于檢測或鑒定炭疽芽胞桿菌芽孢的探針， 或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體。所述SBDl與其它物質結合后，用于檢測或鑒定炭疽芽胞桿菌芽孢的探針，或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體；所述其它物質為具有熒光的染料、酶或磁性顆粒等物質。在所述SBDl的基礎上，可以通過增加plyG蛋白質上面的一些氨基酸序列，獲得與炭疽芽胞桿菌芽孢具有更高親和力的多肽序列SBD2，其氨基酸序列為DNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSWSGKYCPHRMLAEGRWGAFIQKVKNGNVATTSPT。所述SBD2直接用于檢測或鑒定炭疽芽胞桿菌芽孢的探針，或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體。所述SBD2與其它物質結合后，用于檢測或鑒定炭疽芽胞桿菌芽孢的探針，或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體；所述其它物質為具有熒光的染料、酶或磁性顆粒等物質。本發明有以下的主要突出效果和優點可用于檢測炭疽芽胞桿菌芽孢的探針或者富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體。具有所發明的多肽序列的多肽能特異性的結合炭疽芽胞桿菌芽孢，而對炭疽芽胞桿菌的營養體沒有識別作用，對其它種類細菌的芽孢也沒有識別作用。該多肽與具有熒光的染料、酶或磁性顆粒等物質結合后，仍保持其對炭疽芽胞桿菌芽孢的特異結合。這種特異性的識別和結合能夠用于炭疽芽胞桿菌芽孢的鑒定和檢測。


圖I為FITC熒光標記的SBD多肽對炭疽芽胞桿菌芽孢染色的顯微鏡圖像。圖2為FITC熒光標記的SBD多肽對炭疽芽胞桿菌芽孢特異性識別的統計圖。圖3為FITC熒光標記的SBD多肽和單獨的FITC對炭疽芽胞桿菌營養體識別的熒光圖。圖4為綠色熒光蛋白標記的含plyG酶上60個氨基酸序列的蛋白質EP6對炭疽芽胞桿菌芽孢染色的圖像。
圖5為FITC-SBD多肽與EP6對炭疽芽胞桿菌芽孢親和力差異的比較圖。圖6為FITC-SBD多肽與炭疽芽胞桿菌芽孢之間親和力測定結果的曲線圖。圖7為EP6蛋白質與炭疽芽胞桿菌芽孢之間親和力測定結果的曲線圖。圖8為EP6蛋白質熒光消減法檢測炭疽芽孢結果圖。圖9為用流式細胞術檢測炭疽芽孢結果圖。圖10為用夾心ELISA法檢測炭疽芽孢結果的曲線圖。
具體實施例方式本發明公開了一段能識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽，該多肽序列通過體外截斷炭疽芽胞桿菌Y噬菌體裂解酶PlyG而獲得。本發明的內容還涉及到在此序列基礎上，通過增加一些在plyG酶上的氨基酸序列后，獲得對炭痕芽胞桿菌芽抱具有更聞未和力的氣基酸序列。本發明還公開了通過化學合成或基因工程方法構建一系列含有該序列的多肽和蛋白質，用于檢測炭疽芽胞桿菌芽孢的探針或者富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體的方法。下面結合實施例及附圖對本發明作進一步說明。下列實施例中所用的方法如無特別說明均是常規的實驗方法。實驗中所用到的引物均委托上海英駿公司合成。測序均由上海英駿公司完成。多肽的合成與標記委托上海強耀科技有限公司合成。試驗中用到的全長PlyG基因序列委托上海生工合成，用到的所有菌株和載體均為申請者實驗室保存。實施例I.能識別炭疽芽孢的NVRTHQSWSGKYCPH觀LAEG多肽(SBDl)的獲得之前公開的plyG蛋白質的全長序列如下MEIQKKLVDPSKYGTKCPYTMKPKYITVHNTYNDAPAENEVSYMISNNNEVSFHIAVDDKKAIQGIPLE RNAffACGDGNGSGNRQSISVEICYSKSGGDRYYKAEDNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSffSGKYCPHRMLAEGR WGAFIQKVKNGNVATTSPTKQNIIQSGAFSPYETPDVMGALTSLKMTADFILQSDGLTYFISKPTSDAQLKAMKEYL DRKGffffYEVK0通過體外截短plyG蛋白質實驗，鑒定發現該蛋白質上面的21個氨基酸能識別炭疽芽胞桿菌芽孢，其中底部劃線處為21個氨基酸所對應的多肽序列(SBDl)在噬菌體裂解酶plyG全長氨基酸序列上的位置。SBDl具有能與炭疽芽胞桿菌的芽孢結合的能力。為進一步證實該多肽序列與炭疽芽胞桿菌的芽孢結合的特異性與親和力，采用化學方法，合成了在多肽N-端修飾有熒光素FITC標記的多肽(FITC-SBD)FITC-NVRTHQSffSGKYCPHRMLAEG，將FITC-SK)多肽溶于磷酸緩沖液PBS(137mM NaCl, 2. 7mM KC1，4. 3mMNa2HP04 ·Η20，
I.4mM KH2PO4,ρΗ7. 4)后，就可用于與炭疽芽胞桿菌的芽孢結合的能力的驗證以及其它的檢測試驗。實施例2.SBDl多肽識別炭疽芽孢的驗證(I)炭疽芽孢預處理
本實驗中采用甲醛滅活的炭疽芽孢作為實驗樣本。滅活的炭疽芽孢用 PBSM(1 XPBS，5%脫脂牛奶)在 37°C封閉 2h，用 PBST (I XPBS, O. 05% Tween-20)通過離心 (12000g，lmin)洗滌3次后，溶于PBS中。(2)炭疽芽孢的染色及熒光顯微鏡分析將處理好的炭疽芽孢與同摩爾濃度的FITC-SBD和FITC在室溫分別孵育 30min-lh，用 PBST(1XPBS，0. 05% Tween-20)通過離心(12000g, lmin)洗滌 3 次后，溶于磷酸緩沖液中。取適量與FITC-SBD孵育后的炭疽芽孢涂布在載玻片上，用熒光顯微鏡觀測炭疽桿菌芽孢的熒光。同時，以FITC孵育的炭疽芽孢為對照，用熒光顯微鏡觀測與FITC孵育后的炭疽桿菌芽孢的熒光。用FITC-SBD孵育成功后的炭疽芽孢在熒光顯微鏡下呈現明亮的綠色(圖I)，而與FITC孵育的炭疽芽孢在熒光顯微鏡下只有很微弱的背景熒光。證明 FITC-SBD具有能與炭疽芽孢結合的能力。(3) FITC-SBD對炭疽芽孢特異性的確定(3. I)對照芽孢的準備取適量的蠟樣芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、短小芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌以及枯草芽胞桿菌的芽孢，用PBSM(1XPBS，5%脫脂牛奶)在37°C封閉2h，用 PBST(I XPBS,O. 05 % Tween-20)通過離心(12000g，lmin)洗滌 3 次后，溶于 PBS 中。同時取適量的炭疽芽胞桿菌營養體，用PBSM(1XPBS，5%脫脂牛奶)在37 °C封閉2h，用 PBST (I X PBS, O. 05% Tween-20)通過離心(12000g，lmin)洗滌 3 次后，溶于 PBS 中。這些芽孢中的蠟樣芽胞桿菌和蘇云金芽胞桿菌是與炭疽芽胞桿菌極為近緣的芽胞桿菌，它們之間的差別一般認為只在于其中所含有的細菌質粒有差別。之前公開的一些多肽很少有能區別這些近緣芽孢的能力。 (3. 2)染色及熒光顯微鏡分析將處理好的芽孢和營養體細胞與同濃度的FITC-SBD和FITC在室溫分別孵育 30min-lh，用 PBST(1XPBS，0. 05% Tween-20)通過離心(12000g, lmin)洗滌 3 次后，溶于 PBS中。取適量孵育后的芽孢和營養體分別涂布于載玻片上，用熒光顯微鏡分別觀測芽孢和營養體細胞的熒光。同時，分別以FITC孵育后的芽孢和營養體為對照，用熒光顯微鏡分別觀測芽孢和營養體細胞的熒光。統計各類芽孢和營養體分別用FITC-SBD、FITC以及PBSB 染色后的熒光強度，并做統計分析。結果表明只有用FITC-SBD染色后的炭疽芽孢呈現出明顯的熒光強度的增加，而其它芽孢在熒光強度上均沒有明顯的變化(如圖2所示)。此外， 也發現FITC-SBD不能與炭疽桿菌營養體結合(如圖3所示)。該實驗證實該多肽序列組成的FITC-SBD多肽對結合炭疽芽胞桿菌的芽孢具有很好的特異性，能區別炭疽芽孢與其它菌的芽孢的同時，也能區別炭疽芽孢與炭疽桿菌營養體。實施例3.含有更長plyG氨基酸序列的識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽獲得在SBDl序列上，通過增加更多的plyG上的氨基酸序列，有可能得到更好的能識別炭疽芽孢的多肽。本實施例僅舉一列來說明。在該例子中，通過將綠色熒光蛋白質(EGFP) 基因與PlyG基因中含有所感興趣的多肽基因片段融合，再通過大腸桿菌表達后，成為帶有熒光蛋白質標記的多肽。采用該熒光蛋白質標記后的多肽用于炭疽芽胞桿菌芽孢的識別。
本實施例以融合有一個長60氨基酸序列(106-165，p60)的多肽和EGFP的融合蛋白質EP6為例子。MEIQKKLVDPSKYGTKCPYTMKPKYITVHNTYNDAPAENEVSYMISNNNEVSFHIAVDDKKAIQGIPLE RNAffACGDGNGSGNRQSISVEICYSKSGGDRYYKAEDNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSffSGKYCPHRMLAEGR ffGAFIQKVKNGNVATTSPTKQNIIQSGAFSPYETPDVMGALTSLKMTADFILQSDGLTYFISKPTSDAQLKAMKEYL DRKGffffYEVK0上述多肽序列為之前報道的全長plyG蛋白的序列，其中底部劃線處為識別炭疽芽胞桿菌芽孢的氨基酸序列P60在plyG蛋白序列上的位置。該多肽序列為能更好的識別炭疽芽孢的多肽序列SBD2。(I)以plyG基因為模板擴增p60片段。在目的基因的兩端分別加入EcoRI和XhoI的酶切位點，引物設計如下Upper 5~TAAAGAATTCGATAATGCTGTTGATGTTG~3EcoRI ,Down 5~TAATCTCGAGTTATGTTGGTGAAGTAGTCG~3XhoI以2μ I基因為模板，各加入引物I μ g進行PCR擴增，PCR擴增程序如下1)94°C, 5min ；2) 94°C, 30sec, 52°C, 30sec, 72°C, 30sec, 30 個循環;3) 72 °C，IOmin ； (2)將 p60 基因連入表達質粒pET28a (+)得到重組載體pET-p60，然后將其轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。(3)表達載體pET-EP6的構建。以綠色熒光蛋白基因載體pEGFP-Cl (申請者實驗室保存)為模板擴增egfp基因， 并在引物兩端引入NdeI和BamHI的酶切位點，引物設計如下Upper 5~AATCCATATGGTGAGCAAGGGCGAG~3NdeI， Down 5~GGCCGGATCCCTTGTACAGCTCGTC~3BamHI，以2μ I基因為模板，各加入引物I μ g進行PCR擴增，PCR擴增程序如下1)94°C, 5min ;2) 94°C，30sec，52°C，lmin，72°C，lmin，30 個循環；3) 72°C, IOmin ;將產物進行凝膠電泳回收后連入載體pET-p60中得到表達載體PET-EP6，然后將其轉化大腸桿菌BL21 (DE3)。(4)EP6的表達純化。將表達菌株BL21 (DE3) /pET_EP6用IPTG低溫誘導表達。收集菌體后超聲破碎，取上清過Ni-NTA柱，收集250mM咪唑洗脫峰，收集到的融合蛋白質EP6經PBS透析后，保存在 4攝氏度冰箱中備用。實施例4.EP6識別炭疽芽孢的驗證(I)炭疽芽孢預處理本實驗中采用甲醛滅活的炭疽芽孢作為實驗樣本。滅活的炭疽芽孢用 PBSM(1 XPBS，5%脫脂牛奶)在 37°C封閉 2h，用 PBST (I XPBS, O. 05% Tween-20)通過離心 (12000g，lmin)洗滌沉淀物3次后，溶于PBS中。(2)炭疽芽孢的染色及熒光顯微鏡分析
將處理好的炭疽芽孢與同摩爾濃度的EP6和EGFP在室溫分別孵育30min_lh，然后用 PBST (I XPBS, O. 05% Tween-20)通過離心(12000g, lmin)洗滌 3 次后，溶于 PBS 緩沖液中。取適量與EP6孵育后的炭疽芽孢涂布于載玻片上，用熒光顯微鏡觀測芽孢熒光。同時， 以與EGFP孵育后的炭疽芽孢為對照。用EP6孵育成功后的炭疽芽孢在熒光顯微鏡下呈現明亮的綠色(圖4)，而作為對照的EGFP與芽孢孵育后，炭疽芽孢在熒光顯微鏡下只呈現微弱的背景熒光，證實在SBDl序列基礎上，含有更多plyG蛋白質上序列的延長多肽與EGFP 融合的蛋白質EP6仍然可以與炭疽芽孢結合。實施例5.FITC-SBD與EP6對炭疽芽孢親和力的測定親和力常數是反應兩個分子之間結合力強弱的重要參數之一，本實施例中通過比較同濃度的FITC-SBD和EP6分別與等量的炭疽芽孢在相同條件下作用后，測定離心上清中熒光強度的減少，來反應FITC-SBD和EP6與炭疽芽孢結合的相對強弱。同時采用Scatchard plot法測定了 EP6與炭疽芽孢結合的親和力常數，來進一步的驗證EP6與炭疽芽孢的結合。(I)FITC-SBD與EP6對炭疽芽孢結合差異的比較相同摩爾濃度的FITC-SBD與EP6分別與一定濃度的炭疽芽孢混合孵育30min后， 12000g離心Imin后，取上清測定熒光強度，通過熒光的減少來評價二者對炭疽芽孢結合力的差異。所得到的熒光消減柱狀圖見圖5。結果反應EP6比FITC-SBD的結合能力更好。證實在SBDl序列的基礎上，通過改造，有可能獲得比SBDl多肽結合炭疽芽孢能力更好的多肽。(2) Scatchard plot法測定親和力常數的實驗過程將一定濃度的炭疽芽孢與不同濃度的EP6蛋白在37°C孵育2h，12000g離心lmin 后，取上清測定熒光強度，并將其轉化為EP6的蛋白質摩爾濃度Cf。孵育前的EP6的摩爾濃度定義為Ct。由此可以計算出在孵育過程中結合到炭疽芽孢上的EP6的摩爾濃度Cb為 (Ct-Cf)。實驗中所用到的炭疽芽孢的濃度定義為Cs。并據此定義反應的結合比例V = Cb/ Cs。根據Scatchard plot的原理，以v/Cf對V作圖,所得到的直線的斜率的負倒數就是EP6 與炭疽芽孢結合的解離常數Kd，而直線與X軸的交點就是單個炭疽芽孢上存在的EP6的結合位點的個數。通過增加EP6的濃度，固定炭疽芽孢的濃度，得到的飽和曲線見圖6，得到的 Scatchard plot直線見圖7。并依據直線的回歸方程(Adj. R2 = O. 9918)得到EP6與炭疽芽孢的解離常數為4. 42 X IO^7M.實施例6.消減法檢測炭疽芽孢采用本發明所公開的多肽序列，可以構建各種探針，通過其特異性結合炭疽芽孢的特點，來發展各種檢測炭疽芽孢的方法，如前面實施例中所用到的熒光顯微鏡法。還可以用于其它方法，如ELISA，流式細胞術，捕獲富集后PCR的方法等等。本實施例采用熒光消減法作為例子。該方法的原理是將一定濃度的EP6與不同濃度的炭疽芽孢混合孵育，離心后測定上清中的熒光強度。通過孵育前后EP6熒光強度的變化來衡量炭疽芽孢的數量。該方法簡單易行，對儀器要求不高，具有很好的重復性。具體步驟是(I)將一定濃度的EP6與不同濃度的炭疽芽孢按照I : I體積比混合，室溫孵育30min-lh。(2) 12000g離心lmin，取上清測其熒光強度為Fb。其中孵育前EP6 的熒光強度為Fa。(3)以(Fa-Fb)對孢子濃度作圖，得出檢測的線性范圍和標準曲線。⑷ 以蕈狀芽胞桿菌的孢子為陰性樣品，按同樣的方法進行試驗。(5)結合陰性樣品的實驗結果，計算出該方法對炭疽芽孢檢測的靈敏度約為lxl05CFU/ml。檢測結果的曲線如圖8所示。 測定實際樣本時，將同濃度的EP6與實際樣本按I : I體積比混合，按上述同樣的步驟，測定孵育前后的熒光變化值(Fa-Fb)，同對照標準曲線，即可計算出實際樣本中含有的炭疽芽孢數量。實施例7.流式細胞術檢測炭疽芽孢將FITC-SBD1或EP6與不同濃度的炭疽芽孢混合，在PBS溶液中，室溫孵育 30min-lh后，可以直接通過流式細胞儀，對標記上帶有熒光的炭疽芽孢數目進行統計，達到快速檢測溶液中炭疽芽孢的目的。本實施例中采用EP6作為熒光標記物和貝克曼FACSCalibur流式細胞儀，設定液流速度為lml/min, 15mff IS離子激光器的激發波長設定為488nm,檢測所用的是530±15nm 的濾光片。按照儀器推薦的實驗手冊開展試驗。由于EP6對炭疽芽孢具有很高的特異性， 所以該方法具有很低的背景，可以實現低至5xl03CFU/ml炭疽芽孢的檢測。對不同濃度炭疽芽孢的檢測結果如圖9所示。實施例8.酶聯免疫吸附法(ELISA)法檢測炭疽芽孢本實施例中，將SBDl和SBD2分別與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯后，用于檢測捕獲到包被有炭疽芽孢抗體的96孔板上的芽孢，建立一種類似夾心ELISA法檢測炭疽芽孢的方法。一抗可以是抗炭疽芽孢的單鏈抗體，也可以是抗炭疽芽孢的多抗。如果樣本中有炭疽芽孢，芽孢會捕獲在96孔板上，標記有HRP的SBDl或SBD2與捕獲的芽孢反應后，經過洗滌后，會留在96孔板上，最后加入酶標抗體的底物后，就會顯色。實驗條件簡單易控，具有很好的靈敏度。以下以SBDl與HRP偶聯用于ELISA進行具體說明。(8. DSBDl與HRP的偶聯SBD1與HRP偶聯標記采用簡易過碘酸鈉法，該法是以 NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與SBDl上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高。具體步驟如下(I)稱取5mg HRP溶解于Iml蒸餾水中。(2)于上液中加入O. 2ml新配的O. IM NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。(3)將上述溶液裝入透析袋中，對ImM pH4. 4的醋酸鈉緩沖液透析，4°C過夜。(4)加20 μ I O. 2Μ ρΗ9. 5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化HRP的pH升高到9. O 9. 5， 然后立即加入IOmg SBD在Iml O. OlM碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。(5)加O. Iml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4°C 2小時。(6)將上述溶液裝入透析袋中，對O. 15M pH7. 4PBS透析，4°C過夜。(8. 2)包被抗體到96孔酶標板(購自Thermo Scientific)上:在每個孔中，加入實驗室自制的100 μ I炭疽芽孢單克隆抗體(10 μ g/ml溶解于O. 5M碳酸緩沖液)，4°C孵育過夜，洗滌5次后，用含有5% (w/v)脫脂奶粉的TBS緩沖液37°C封閉2h。(8. 3)將含有炭疽芽孢的100 μ L樣本溶液依次加入每個孔中，37°C反應Ih后，用TBS緩沖液洗滌3次。(8. 4)將標記有HRP的SBDl的溶液IOOyL加入每個孔中，37°C反應Ih后，用TBS 緩沖液洗滌3次。(8. 5)加入自制的TMB顯色液100 μ L，室溫反應O. 5h后，加入2M H2SO4中止反應， 用酶標儀(Bio-Tec Instruments, Inc.)測溶液在405nm的吸收。采用同樣的步驟，SBD2與HRP偶聯后也具有很好的識別能力。由于SBD2比SBDl 的親和力強，也顯示出了更好的靈敏度。對不同濃度炭疽芽孢的檢測結果如圖10所示。實施例9.磁珠免疫富集-PCR法檢測炭疽芽孢本實施例中，將SBDl和EP6與羧基修飾后的磁珠偶聯后，用于富集樣品中的炭疽芽孢后，加熱裂解，然后用PCR引物進行擴增，達到即特異又高靈敏檢測的目的。SBDl和EP6偶聯磁顆粒的制備方法如下使用含O. I % (體積/體積)Tween20的 50mM、pH4. 7的醋酸鈉緩沖液洗滌磁顆粒，加入EDC和NHS使其終濃度均為20mM，室溫反應一小時。洗滌磁珠后，分別加入SBDl和EP6使其與磁顆粒含有的羧基的數量比例是I : 300 到I : 400，37°C搖床120rpm反應2小時，洗滌磁顆粒后加入含有5% (質量/體積)BSA的 O. 02M PBS (pH7. 2)溶液，37°C搖床120rpm封閉2小時，使用含O. 1% (體積/體積)Tween20 的50mM、pH4. 7的醋酸鈉緩沖液反復洗滌磁顆粒，并將分別偶聯有SBDl和EP6的磁顆粒轉移至含I % (質量/體積)PVP、I % (質量/體積)BSA、0· 5 % (體積/體積)Tween20,5% (質量/體積)蔗糖的50mM pH8. 5硼酸緩沖液中保存，置于4°C備用。取制備好的磁珠10 μ 1，與500 μ I的含炭疽芽孢的溶液混合，30°C反應O. 5-1小時后，在磁力架上進行磁顆粒分離，去掉溶液，用PBS洗滌磁珠3次，最后加入蒸餾水50 μ 1，然后在沸水浴中煮沸30-45min，IOOOOg離心Imin后取上清5_10 μ I用于PCR擴增。PCR 擴增采用購買的 Bacillus anthracis PCR 檢測試劑盒(Takara, Cat. #RR027)，分別擴增炭疽芽孢的PA基因和CAP基因。PA引物序列為:PA7 5/ -ATCAC CAGAG GCAAG ACACC C-3'；PA6 5/ -ACCAA TATCA AAGAA CGACG C-3'。CAP引物序列為MOll 5/ -GACGG ATTAT GGTGC TAAG-3'；M012 5/ -GCACT GGCAA CTGGT TTTG-3'。PCR 擴增程序如下l)94°C,5min ；2)94°C, 15sec,60°C, 15sec, 72°C, 30sec, 35 個循環；3)72°C, IOmin ；PCR完成后，通過電泳檢測是否有特異的DNA條帶出現，就可以判斷樣本中是否有炭疽芽孢。實驗結果表明，使用EP6修飾的磁珠能顯著的提高富集炭疽芽孢的能力，使得 PCR可以對溶液中含有低至l-100CFU/ml炭疽芽孢的樣本進行檢測，SBDl修飾的磁珠具有相同的效果。
權利要求
1.一種識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列，其特征是一段能識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列SBD1，其氨基酸序列為NVRTHQSWSGKYCPH觀LAEG。
2.根據權利要求1所述的識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列，其特征是所述多肽序列 SBDl是通過體外截斷炭疽芽胞桿菌Y噬菌體裂解酶plyG方法而獲得。
3.權利要求1或2所述識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列的用途，其特征在于含有所述SBDl的多肽和蛋白質具有能特異識別炭疽芽胞桿菌芽孢的能力。
4.根據權利要求3所述的用途，其特征在于含有所述SBDl的多肽和蛋白質直接用于檢測或鑒定炭疽芽胞桿菌芽孢的探針，或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體。
5.根據權利要求3所述的用途，其特征在于所述SBDl與其它物質結合后，用于檢測或鑒定炭疽芽胞桿菌芽孢的探針，或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體；所述其它物質為具有熒光的染料、酶或磁性顆粒物質。
6.權利要求I或2所述識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列的用途，其特征是在所述 SBDl的基礎上，通過增加plyG蛋白質上面的一些氨基酸序列，獲得與炭疽芽胞桿菌芽孢具有更高親和力的多肽序列SBD2，其氨基酸序列為DNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSWSGKYCPHIMLAEGRWGAFIQKVKNGNVATTSPT。
7.根據權利要求6所述的用途，其特征是所述SBD2直接用于檢測或鑒定炭疽芽胞桿菌芽孢的探針，或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體。
8.根據權利要求6所述的用途，其特征是所述SBD2與其它物質結合后，用于檢測或鑒定炭疽芽胞桿菌芽孢的探針，或者作為富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體；所述其它物質為具有熒光的染料、酶或磁性顆粒物質。
全文摘要
本發明涉及一種識別炭疽芽胞桿菌芽孢的多肽序列及其應用，具體是公開了一段能識別炭疽芽胞桿菌芽孢的NVRTHQSWSGKY CPHRMLAEG氨基酸序列；在此氨基酸序列基礎上，增加一些在plyG酶上的氨基酸序列后，能獲得對炭疽芽胞桿菌芽孢具有更高親和力的多肽；通過化學合成或基因工程方法構建一系列含有該序列的多肽和蛋白質，可用于檢測炭疽芽胞桿菌芽孢的探針或者富集炭疽芽胞桿菌芽孢的載體。具有所發明多肽序列的多肽的主要特征為能特異性結合炭疽芽胞桿菌芽孢，而對炭疽芽胞桿菌的營養體沒有識別作用，對其它種類細菌的芽孢也沒有識別作用，這種特異性的識別和結合能夠用于炭疽芽胞桿菌芽孢的鑒定和檢測。
文檔編號C12R1/07GK102586214SQ20121000622
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月6日 優先權日2012年1月6日
發明者危宏平, 張先恩, 楊航, 王殿冰 申請人:中國科學院武漢病毒研究所