專利名稱：一種獸用高效復合微生態預混劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種微生態預混劑的制備方法，更具體地說涉及一種獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，屬于微生態制劑飼料添加劑技術領域。
背景技術：
獸用微生態預混劑是一種天然、綠色、安全的飼料添加劑，由于其具有無毒、無害、無殘留、無污染等優點，同時具有防病治病，提高飼料利用率，提高動物生產性能等作用，而且能克服抗生素所產生的菌群失調、二重感染和耐藥性等，在動物源性食品安全問題日益突出的情況下越來越得到廣泛研究和應用。目前，國內市場上的獸用微生態預混劑產品主要存在以下不足:(1)活菌含量低，近年大量研究表明，如果一種菌在動物盲腸內容物中的濃度低于IO7個/g，則該菌產生的酶及代謝產物不足以影響宿主，難以滿足治療需要；(2)對胃酸和膽汁穩定性差，致使只有少數菌株進入腸道后仍具有活性，達不到發揮作用所需的活菌數量；(3)體內增殖速度差；不耐高銅，高溫加工和貯存過程中不穩定，保存期短；(5)復合預混劑少，僅適應某一特定動物。由此影響了微生態預混劑在動物上的應用效果，限制了微生態預混劑的應用范圍。

發明內容
本發明的目的在于提供一種活菌含量高、耐胃酸和膽汁、對高銅和高溫有耐受性、體內增殖速度穩定、保存期長的獸用高效微生態預混劑及其制備方法。本發明的目的是通過下述技術方案予以實現:
一種獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，包括以下步驟:
1)菌種優化篩選
將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母分別進行菌株耐酸、耐膽汁鹽、耐溫、耐高銅馴化；
所述耐酸馴化是指φΗ 3.2-3.6的條件下篩選出耐酸菌株；
所述耐膽鹽馴化是指:在培養基中加入膽鹽后，再對篩選出的耐酸菌株進行馴化；
所述耐溫馴化是指:將經耐膽鹽馴化后的菌體培養物接種至LB、TB液體培養基中，然后在40-60°C水浴中加熱，隨后繼續將培養物置于37°C培養；
所述耐高銅馴化是指:將經耐溫馴化后的菌體在含200-250mg/kg銅的MRS肉湯培養基中進行生長；
2)選取復壯菌種
選取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的第四代活化菌種作為復壯菌種，產朊假絲酵母、釀酒酵母選第三代活化菌種作為復壯菌種；
3)搖瓶培養
所述四種復壯菌種再分別采用下列相應的培養基，在搖瓶中進行培養:
①地衣芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖18-20g/L、豆餅粉60-70g/L、玉米漿6.5-7.0g/L、蛋白胨 1.3-1.5g/L，pH 值為 7.2-7.5，培養溫度為 33-37°C ；
②枯草芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖32-35g/L、蛋白胨7.5-8.3g/L、酵母膏
4.5-5.0g/L、KH2PO4 3.0-3.5g/L、CaCO3 2.0-2.5g/L，pH 值為 6.5-7.1，培養溫度為 32-34°C ；
③產朊假絲酵母培養:培養基組成為葡萄糖35-40g/L、蛋白胨10-12g/L、KH2PO4
1.8-2.0g/L、MgSO4.7H20 0.25-0.30g/L，培養溫度為 25-28°C ；
④釀酒酵母培養:培養基組成為酪蛋白胨13_16g/L、酵母粉12-15g/L、葡萄糖25_30g/UKH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4.3H20 15-16.34g/L，培養溫度為 26-30°C ；
4)30L發酵罐培養
依照步驟3)的培養條件，將經搖瓶培養后的菌種分別放入30L發酵罐中擴大培養；
5)菌體噴霧干燥
分別連續離心收集菌體，將菌泥用保護液和載體調配至固形物濃度3-5%，再于28-35°C的溫度下進行噴霧干燥，分別收集單一菌粉；
所述保護液由脫脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸鈉組成，其含量分別為:脫脂乳粉80-85g/L、半胱氨酸 0.04-0.05mol/L、谷氨酸鈉 25_30g/L ；
所述載體選自80-100目的玉米芯粉或80-100目的球磨糠粉,或者是二者以任意重量比的混合物；
所述載體的用量按如下方法計算:在步驟4)的發酵罐培養結束時，先按稀釋平板計數法分別測量上述四種菌液濃度(CFU/L)，再按四種單一菌粉中菌濃規格要求(CFU/g)，準確計算出載體用量，以保證并控制菌粉中活菌濃度；
6)配制復合菌粉
按復合菌粉中含枯草芽孢桿菌20.0-25.0億CFU/g、地衣芽孢桿菌18.0-20.0億CFU/g、釀酒酵母12.0-15.0億CFU/g、產朊假絲酵母15.0-20.0億CFU/g、總菌數彡65億CFU/g的標準，計算并稱取四種單一菌粉和載體，混合均勻即制得微生態預混劑產品。本發明的獸用高效復合微生態預混劑的制備方法與現有技術相比具有以下優
點
1)科學選取枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母四種微生物，并進行優化篩選和馴化，使其具有耐酸、耐鹽、耐溫及耐膽汁的優良特性；
2)本發明的獸用高效復合微生態預混劑活菌含量高，總菌濃度>65億CFU/g ;對高銅有耐受:性，在動物詞料含有聞銅的情況下仍能發 車其防病治病，提聞詞料利用率，提聞動物生產性能等作用；
3)本發明的獸用高效復合微生態預混劑耐胃酸、膽鹽和高溫，進入腸道后仍具較強活性，在飼料造粒加工后穩定性較好，在常溫保存條件下活性穩定；
4)本發明的獸用高效復合微生態預混劑可顯著降低大腸桿菌、沙門氏菌數量，抑制病原菌，減少蛋白質向胺及氨的轉化，使腸內糞便和血液中氨濃度下降，從而降低糞便臭味，改善舍內空氣質量，減少機體應激，降低對環境的污染；
5)本發明的獸用高效復合微生態預混劑在菌體干燥前加入保護劑和載體，并采用低溫噴霧干燥，從而大大降低了成本，探明了培養條件、收獲期、冷凍速率、殘留水分及復水條件對干燥菌體存活率的影響，保證了產品中菌體的活性，所生長的菌粉易于包裝運輸。
具體實施例方式實施例1
一種獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，包括以下步驟:
1)菌種優化篩選
將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母分別進行菌株耐酸、耐膽汁鹽、耐溫、耐高銅馴化；
所述耐酸馴化是指φΗ 3.2-3.6的條件下篩選出耐酸菌株；
所述耐膽鹽馴化是指:在培養基中加入膽鹽后，再對篩選出的耐酸菌株進行馴化；
所述耐溫馴化是指:將經耐膽鹽馴化后的菌體培養物接種至LB、TB液體培養基中，然后在40-60°C水浴中加熱，隨后繼續將培養物置于37°C培養；
所述耐高銅馴化是指:將經耐溫馴化后的菌體在含200-250mg/kg銅的MRS肉湯培養基中進行生長；
2)選取復壯菌種
選取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的第四代活化菌種作為復壯菌種，產朊假絲酵母、釀酒酵母選第三代活化菌種作為復壯菌種；
3)搖瓶培養
所述四種復壯菌種再分別采用下列相應的培養基，在搖瓶中進行培養:
①地衣芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖20g/L、豆餅粉70g/L、玉米漿7.0g/L、蛋白胨1.5g/L，pH值為7.5，培養溫度為37°C ；
②枯草芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖35g/L、蛋白胨8.3g/L、酵母膏5.0g/L、KH2PO4 3.5g/L、碳酸鈣 2.5g/L，pH 值為 7.1，培養溫度為 34°C ；
③產朊假絲酵母培養:培養基組成為葡萄糖40g/L、蛋白胨12g/L、KH2PO42.0g/L、MgS04.7H20 0.30g/L ;培養溫度為 25-28。。。④釀酒酵母培養:培養基組成為酪蛋白胨16g/L、酵母粉15g/L、葡萄糖30g/L、KH2PO4 2.4g/L、K2HPO4 _3H20 16.34g/L，培養溫度為 26-30°C ；
4)30L發酵罐培養
依照步驟3)的培養條件，將經搖瓶培養后的菌種分別放入30L發酵罐中擴大培養；
5)菌體噴霧干燥
分別連續離心收集菌體，將菌泥用保護液和載體調配至固形物濃度4%，再于33°C的溫度下進行噴霧干燥，分別收集單一菌粉；
其中，所述的保護液由脫脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸鈉組成，其濃度為脫脂乳粉80g/L、半胱氨0.04mol/L、谷氨酸鈉25g/L ；
所述載體選自80-100目的球磨糠粉。所述載體的用量按如下方法計算:在步驟4)的發酵罐培養結束時，先按稀釋平板計數法分別測量上述四種菌液濃度(CFU/L)，再按四種單一菌粉中菌濃規格要求(CFU/g)，準確計算出載體用量，以保證并控制菌粉中活菌濃度；
6)配制復合菌粉
按復合菌粉中含枯草芽孢桿菌25.0億CFU/g、地衣芽孢桿菌20.0億CFU/g、釀酒酵母15.0億CFU/g、產朊假絲酵母20.0億CFU/g的標準，計算并稱取四種單一菌粉和載體，混合均勻即制得微生態預混劑產品。該微生態預混劑產品含枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和產朊假絲酵母總菌數為80億CFU/g。
實施例2
一種獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，包括以下步驟:
1)菌種優化篩選
將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母分別進行菌株耐酸、耐膽汁鹽、耐溫、耐高銅馴化；
所述耐酸馴化是指:PH 3.2-3.6的條件下篩選出耐酸菌株；
所述耐膽鹽馴化是指:在培養基中加入膽鹽后，再對篩選出的耐酸菌株進行馴化；
所述耐溫馴化是指:將經耐膽鹽馴化后的菌體培養物接種至LB、TB液體培養基中，然后在40-60°C水浴中加熱，隨后繼續將培養物置于37°C培養；
所述耐高銅馴化是指:將經耐溫馴化后的菌體在含200-250mg/kg銅的MRS肉湯培養基中進行生長；
2)選取復壯菌種
選取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的第四代活化菌種作為復壯菌種，產朊假絲酵母、釀酒酵母選第三代活化菌種作為復壯菌種；
3)搖瓶培養
所述四種復壯菌種再分別采用下列相應的培養基，在搖瓶中進行培養:
①地衣芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖18g/L、豆餅粉60g/L、玉米漿6.5g/L、蛋白胨1.3g/L，pH值為7.2，培養溫度為350C ；
②枯草芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖32g/L、蛋白胨8.0g/L、酵母膏4.5g/L、KH2PO4 3.0g/L、CaCO3 2.0g/L, pH 值為 7.0，培養溫度為 32°C ；
③產朊假絲酵母培養:培養基組成為葡萄糖35g/L、蛋白胨10g/L、KH2PO41.8g/L、MgSO4.7H20 0.25g/L，培養溫度為 25-28°C ；
④釀酒酵母培養:培養基組成為酪蛋白胨13g/L、酵母粉12g/L、葡萄糖25g/L、KH2PO4
2.2g/L、K2HPO4.3H20 15g/L，培養溫度為 26-30°C ；
4)30L發酵罐培養
依照步驟3)的培養條件，將經搖瓶培養后的菌種分別放入30L發酵罐中擴大培養；
5)菌體噴霧干燥
分別連續離心收集菌體，將菌泥用保護液和載體調配至固形物濃度3%，再于33°C的溫度下進行噴霧干燥，分別收集單一菌粉；
其中，所述的保護液由脫脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸鈉組成，其濃度為脫脂乳粉85g/L、半胱氨0.05mol/L、谷氨酸鈉30g/L ；
所述載體選自80-100目的玉米芯粉。所述載體的用量按如下方法計算:在步驟4)的發酵罐培養結束時，先按稀釋平板計數法分別測量上述四種菌液濃度(CFU/L)，再按四種單一菌粉中菌濃規格要求(CFU/g)，準確計算出載體用量，以保證并控制菌粉中活菌濃度；
6)配制復合菌粉
按復合菌粉中含枯草芽孢桿菌20.0億CFU/g、地衣芽孢桿菌18.0億CFU/g、釀酒酵母12.0億CFU/g、產朊假絲酵母15.0億CFU/g的標準，計算并稱取四種單一菌粉和載體，混合均勻即制得微生態預混劑產品。該微生態預混劑產品含枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和產朊假絲酵母總菌數為65億CFU/g。實施例3
一種獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，包括以下步驟:
1)菌種優化篩選
將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母分別進行菌株耐酸、耐膽汁鹽、耐溫、耐高銅馴化；
所述耐酸馴化是指φΗ 3.2-3.6的條件下篩選出耐酸菌株；
所述耐膽鹽馴化是指:在培養基中加入膽鹽后，再對篩選出的耐酸菌株進行馴化；
所述耐溫馴化是指:將經耐膽鹽馴化后的菌體培養物接種至LB、TB液體培養基中，然后在40-60°C水浴中加熱，隨后繼續將培養物置于37°C培養；
所述耐高銅馴化是指:將經耐溫馴化后的菌體在含200-250mg/kg銅的MRS肉湯培養基中進行生長；
2)選取復壯菌種
選取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的第四代活化菌種作為復壯菌種，產朊假絲酵母、釀酒酵母選第三代活化菌種作為復壯菌種；
3)搖瓶培養
所述四種復壯菌種再分別采用下列相應的培養基，在搖瓶中進行培養:
①地衣芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖19g/L、豆餅粉65g/L、玉米漿6.8g/L、蛋白胨1.4g/L，pH值為7.4，培養溫度為330C ；
②枯草芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖34g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母膏4.8g/L、KH2PO4 3.2g/L、碳酸鈣 2.3g/L，pH 值為 6.5，培養溫度為 33°C ；
③產朊假絲酵母培養:培養基組成為葡萄糖38g/L、蛋白胨llg/L、KH2PO41.9g/L、MgS04.7H20 0.28g/L ;培養溫度為 25-28。。。④釀酒酵母培養:培養基組成為酪蛋白胨15g/L、酵母粉13g/L、葡萄糖28g/L、KH2PO4 2.3g/L、K2HPO4 _3H20 15.5g/L，培養溫度為 26-30°C ；
4)30L發酵罐培養
依照步驟3)的培養條件，將經搖瓶培養后的菌種分別放入30L發酵罐中擴大培養；
5)菌體噴霧干燥
分別連續離心收集菌體，將菌泥用保護液和載體調配至固形物濃度5%，再于33°C的溫度下進行噴霧干燥，分別收集單一菌粉；
其中，所述的保護液由脫脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸鈉組成，其濃度為脫脂乳粉83g/L、半胱氨0.045mol/L、谷氨酸鈉28g/L ；
所述載體選自80-100目的玉米芯粉與80-100目的球磨糠粉按2:1重量比的混合物。所述載體的用量按如下方法計算:在步驟4)的發酵罐培養結束時，先按稀釋平板計數法分別測量上述四種菌液濃度(CFU/L)，再按四種單一菌粉中菌濃規格要求(CFU/g)，準確計算出載體用量，以保證并控制菌粉中活菌濃度；
6)配制復合菌粉 按復合菌粉中含枯草芽孢桿菌23.0億CFU/g、地衣芽孢桿菌19.0億CFU/g、釀酒酵母13.0億CFU/g、產朊假絲酵母18.0億CFU/g的標準，計算并稱取四種單一菌粉和載體，混合均勻即制得微生態預混劑產品。該微生態預混劑產品含枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、釀酒酵母和產朊假絲酵母總菌數為73億CFU/g。
權利要求
1.一種獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，包括以下步驟: 1)菌種優化篩選 將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母分別進行菌株耐酸、耐膽汁鹽、耐溫、耐高銅馴化； 2)選取復壯菌種 選取地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的第四代活化菌種作為復壯菌種，產朊假絲酵母、釀酒酵母選第三代活化菌種作為復壯菌種； 3)搖瓶培養 所述四種復壯菌種再分別采用下列相應的培養基，在搖瓶中進行培養: ①地衣芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖18-20g/L、豆餅粉60-70g/L、玉米漿6.5-7.0g/L、蛋白胨 1.3-1.5g/L，pH 值為 7.2-7.5，培養溫度為 33-37°C ； ②枯草芽孢桿菌培養:培養基組成為葡萄糖32-35g/L、蛋白胨7.5-8.3g/L、酵母膏4.5-5.0g/L、KH2PO4 3.0-3.5g/L、CaCO3 2.0-2.5g/L，pH 值為 6.5-7.1，培養溫度為 32-34°C ； ③產朊假絲酵母培養:培養基組成為葡萄糖35-40g/L、蛋白胨10-12g/L、KH2PO41.8-2.0g/L、MgSO4.7H20 0.25-0.30g/L，培養溫度為 25-28°C ； ④釀酒酵母培養:培養基組成為酪蛋白胨13_16g/L、酵母粉12-15g/L、葡萄糖25_30g/UKH2PO4 2.2-2.4g/L、 K2HPO4.3H20 15-16.34g/L，培養溫度為 26-30°C ； 4)30L發酵罐培養 依照步驟3)的培養條件，將經搖瓶培養后的菌種分別放入30L發酵罐中擴大培養； 5)菌體噴霧干燥 分別連續離心收集菌體，將菌泥用保護液和載體調配至固形物濃度3-5%，再于28-35°C的溫度下進行噴霧干燥，分別收集單一菌粉； 6)配制復合菌粉 按復合菌粉中含枯草芽孢桿菌20.0-25.0億CFU/g、地衣芽孢桿菌18.0-20.0億CFU/g、釀酒酵母12.0-15.0億CFU/g、產朊假絲酵母15.0-20.0億CFU/g、總菌數彡65億CFU/g的標準，計算并稱取四種單一菌粉和載體，混合均勻即制得微生態預混劑產品。
2.如權利要求1所述獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，其特征在于:所述耐酸馴化是指:PH 3.2-3.6的條件下篩選出耐酸菌株。
3.如權利要求1所述獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，其特征在于:所述耐膽鹽馴化是指:在培養基中加入膽鹽后，再對篩選出的耐酸菌株進行馴化。
4.如權利要求1所述獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，其特征在于:所述耐溫馴化是指:將經耐膽鹽馴化后的菌體培養物接種至LB、TB液體培養基中，然后在40-60°C水浴中加熱，隨后繼續將培養物置于37°C培養。
5.如權利要求1所述獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，其特征在于:所述耐高銅馴化是指:將經耐溫馴化后的菌體在含200-250mg/kg銅的MRS肉湯培養基中進行生長。
6.如權利要求1所述獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，其特征在于:所述保護液由脫脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸鈉組成，其含量分別為:脫脂乳粉80-85g/L、半胱氨酸0.04-0.05mol/L、谷氨酸鈉 25_30g/L。
7.如權利要求1所述獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，其特征在于:所述載體選自80-100目的玉米芯粉或80-100目的球磨糠粉,或者是二者以任意重量比的混合物。
8.如權利要求1或7所述獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，其特征在于:所述載體的用量按如下方法計算:在步驟4)的發酵罐培養結束時，先按稀釋平板計數法分別測量上述四種菌液濃度(CFU/L)，再按四種單一菌粉中菌濃規格要求(CFU/g)，準確計算出載體用量，以保證并控制菌粉 中活菌濃度。
全文摘要
本發明涉及一種獸用高效復合微生態預混劑的制備方法，屬于微生態制劑飼料添加劑技術領域。該制備方法包括將地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、產朊假絲酵母、釀酒酵母分別進行優化篩選、菌種復壯、搖瓶培養、30L發酵罐培養、菌體噴霧干燥、配制復合菌粉等步驟；本發明制得的高效復合微生態預混劑具有耐酸、耐鹽、耐溫及耐膽汁的優良特性，活菌含量高，對高銅有耐受性，在飼料造粒加工和常溫保存條件下穩定性好，其制備方法簡單，成本低廉，生產的產品質量穩定可靠，有較好的市場前景。
文檔編號C12N1/16GK103202393SQ20121000687
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者趙志毅, 胥勇, 溫亮 申請人:四川省環亞生物科技有限公司