專利名稱：腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物醫學的病毒免疫學檢測技術領域，具體涉及一種可特異性檢測腸道病毒71型抗體的重組蛋白及該重組蛋白的應用。
背景技術：
腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)屬小RNA病毒科、腸道病毒屬，是手足口病的主要病原體之一。除EV71外，多種腸道病毒包括柯薩奇病毒A組0、5、9、10、16型)、柯薩奇病毒B組0、5型)和埃可病毒等也能引起手足口病，其中以柯薩奇病毒A16 (Coxsackie A16，CA16)最為常見。通常情況下，EV71感染引起的手足口病在臨床癥狀和體征方面與CA16等其它腸道病毒所致的手足口病難以區別，但部分患兒也可出現無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質炎樣麻痹和神經源性肺水腫等多種神經系統并發癥，有較高的病死率和致殘率，嚴重危害嬰幼兒的生命健康。自1974年^^！！^肚等人首次報道EV71以來，EV71已在世界范圍內引起多次暴發與流行。近年來，EV71感染疫情在亞太地區呈上升趨勢，如1997年馬來西亞、1998年我國臺灣地區和1999年新加坡等地均出現暴發流行。2008年4月，我國安徽等較多省份相繼出現暴發流行；據衛生部發布的法定傳染病疫情報告顯示，我國手足口病疫情呈逐年上升趨勢。為有效控制EV71的流行，必須努力提高診斷和治療水平、加強疫情監測與流行病學研究，發展有效的疫苗。其中早期特異性病原學診斷至關重要。早期診斷、早期治療對于改善EV71型手足口病的預后、降低重癥病例的病死率與致殘率有重要意義。目前用于EV71感染的診斷仍以傳統的病毒分離技術為主，然后用中和試驗鑒定并確定血清型，或利用EV71單克隆抗體進行間接免疫熒光法(IFA)鑒定。這些方法費時費力且敏感性差，不利于早期診斷。利用逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測EV71 RNA也是常見的方法，但由于其靈敏度很高，對實驗室條件及操作人員要求也高，稍有不慎，極易引起交叉污染，出現假陽性，故難以在基層推廣應用。而酶聯免疫吸附試驗(ELISA)由于其快速敏感且操作簡單、無需太多的實驗設備，適合在廣大基層診療機構中推廣應用。目前國內外EV71感染的ELISA檢測，按所采用的抗原不同可以分為兩大類。第一類是采用EV71滅活全病毒顆粒作為抗原來檢測EV71特異性抗體。這一方法在實際應用中存在明顯的不足一是利用純化的EV71病毒顆粒做抗原，即使在純度得到保證的情況下，病毒顆粒表面仍然存在一些與其他腸道病毒有交叉反應的抗原位點，故其特異性得不到保證。二是病毒培養和純化過程不僅操作復雜、成本高，而且還易導致活病毒污染。第二類是采用VPl重組蛋白作為抗原來檢測EV71特異性抗體。VPl是最主要的表面抗原，直接決定病毒的抗原性，但除了含有EV71型特異性抗原位點以外，也存在其他腸道病毒共同的抗原表位，可被其他腸道病毒感染血清識別，這些表位將在一定程度上降低EV71特異性抗體檢測的敏感性和特異性。鑒于EV71的危害性以及目前血清學檢測技術的一些缺陷，有必要開發一種EV71特異性抗原來替代上述診斷用抗原，以進一步提高EV71特異性抗體檢測的敏感性和特異性。

發明內容
解決的技術問題目前在腸道病毒71型感染診斷中，采用病毒分離以及中和抗體檢測等方法存在著費時費力又不能快速診斷的弊端，采用RT-PCR等分子生物學方法存在著過程繁瑣又需要昂貴的分子生物學試劑及相應的儀器設備等問題，采用全病毒顆粒作為診斷抗原也存在著抗原制備過程復雜、費時費力、生物安全隱患等問題，為了解決上述問題，本發明提供了一種含有腸道病毒71型特異性抗原表位的重組蛋白及其制備方法，可以代替全病毒顆粒作為診斷抗原進行血清學診斷抗原，用于腸道病毒71型特異性抗體的檢測。技術方案腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所述。腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原，表達該蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所述。包含上述核苷酸序列的重組質粒。所述核苷酸序列的重組質粒為PGEX-4T-2/EV71-VP16_43> pGEX-4T-2/(EV71-VPl6_43)2、pGEX_4T_2/(EV7卜VP16_43) 4 禾口 pGEX_4T_2/(EV71-VP16_43)6。表達腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原的工程菌株，宿主菌為大腸桿菌，它含有上述的重組質粒。腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原的制備方法，以SEQ ID NO. 2所述的核苷酸為模板，設計上游引物SEQ ID N0.5和下游引物SEQ ID NO. 6，然后進行PCR擴增獲得目的基因，經EcoRI和BamHI雙酶切后克隆至表達質粒pGEX_4T_2，構建重組質粒pGEX_4T_2/EV71-VP 16_43 ；分別利用EcoR I和BamH I雙酶切和EcoR I和BglII雙酶切重組質粒pGEX-4T-2/EV71-VPl6_43產生插入片段和載體，經T4 DNA連接酶連接形成含2個抗原編碼基因片段的重組質粒PGEX-4T-2/ (EV71-VP16_43) 2，同法構建含4個和6個抗原編碼基因片段的重組質粒；將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組工程菌；利用IPTG誘導表達重組蛋白并純化獲得目的蛋白。腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原在制備單克隆抗體、多克隆抗體以及在制備腸道病毒71型特異性抗體檢測試劑盒中的應用。有益效果本發明為腸道病毒71型感染的血清學檢測提供了一種新的診斷抗原，經實驗證明本發明提供的腸道病毒71型特異性抗原具有良好的敏感性和特異性，可被腸道病毒71型感染后的人血清以及滅活全病毒動物免疫血清識別，不但可以用于腸道病毒71型感染的血清學診斷，還可以用于疫苗研發以及使用過程中的免疫效果評價。與全病毒顆粒作為診斷抗原相比，本發明提供的特異性抗原蛋白制備簡便，降低了試劑盒制備的成本。


圖1為PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中A為EV71-VP1基因擴增，B為EV71-VP16_43 區段擴增；
圖2為表達質粒pGEX-4T-2/EV71_VPl6_43的構建流程圖；圖3為SDS-PAGE分析GST_EV71_VP16_43重組蛋白誘導表達情況，其中M表示蛋白分子量標準，1為誘導前，2-12為各菌落誘導池；圖4為flfestern-blot分析GST_EV71_VP16_43重組蛋白的免疫反應性，其中圖4A是重組蛋白與EV71等相關病毒兔免疫血清IgG的反應性分析，其中1-3是抗EV71兔血清，4是抗CA16兔免疫血清，5是抗Echo6兔免疫血清；圖4B是重組蛋白與手足口病患者血清IgM的反應性分析，1-13為EV71陽性血清(PCR)，14-16為CA16陽性血清(PCR)，17-18為EV71和CA16雙陰性血清(PCR)；圖5為EV71_VP16_43多拷貝重組蛋白抗原的表達及免疫反應性比較。其中圖5A為SDS-PAGE分析串聯表達的GST重組蛋白純化情況，其中M表示蛋白分子量標準，1為GST, 2-5分別為含EV71-VP16_43不同拷貝數的GST重組蛋白；B和C :ffestern-blot分析EV71-VP16_43不同拷貝數GST-重組蛋白與EV71感染患者血清IgM的免疫反應性比較，圖5B為EV71弱陽性血清，圖5C為EV71強陽性血清。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的保護范圍。
實施例1重組EV71特異性抗原蛋白的制備1. 1 EV71病毒流行株VPl基因序列測定將EV71流行株-MAS0901病毒液接種至單層非洲綠猴腎細胞(Vero)上，36°C,5%CO2培養，逐日觀察細胞病變效應(CPE)，當CPE達80 %以上后收獲病毒，取140 μ L病毒培養上清,采用 QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取病毒 RNA，用 Onelt印 RT-PCRKit(QIAGEN)擴增 VPl 基因，上游引物(Fl-SEQ ID NO. 3)為 5，-GCAGCCCAGAAGAACTTCAC-3，，下游引物(Rl-SEQ ID NO. 4)為 5，-ACCACTCTAAAGTTGCCCAC_3，，產物大小為 1015bp，擴增體系如下
權利要求
1.腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原，其特征在于其氨基酸序列如SEQID NO. 1所述。
2.腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原，其特征在于表達該蛋白的核苷酸序列如SEQID NO. 2 所述。
3.包含權利要求2所述核苷酸序列的重組質粒。
4.包含權利要求2所述核苷酸序列的重組質粒pGEX-4T-2/EV71-VPl6_43、pGEX_4T_2/(EV71-VP16_43) 2、pGEX-4T-2/ (EV71_VP16_43) 4 和 pGEX_4T_2/ (EV71_VP16_43) 6。
5.表達腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原的工程菌株，其特征在于宿主菌為大腸桿菌，它含有權利要求3或4所述的重組質粒。
6.腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原的制備方法，其特征在于以SEQID NO. 2所述的核苷酸為模板，設計上游引物SEQ ID NO. 5和下游引物SEQ ID NO. 6，然后進行PCR擴增獲得目的基因，經\ .BamH I雙酶切后克隆至表達質粒pGEX_4T_2，構建重組質粒pGEX-4T-2/EV71-VPl6_43 ；分別利用I私BamH I雙酶切和I和召§7 II雙酶切重組質粒pGEX-4T-2/EV71-VPl6_43產生插入片段和載體，經T4 DNA連接酶連接形成含2個抗原編碼基因片段的重組質粒pGEX-4T-2/ (EV71-VP16_43) 2，同法構建含4個和6個抗原編碼基因片段的重組質粒；將重組質粒轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)，獲得重組工程菌；利用IPTG誘導表達重組蛋白并純化獲得目的蛋白。
7.權利要求1所述腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原在制備單克隆抗體、多克隆抗體以及在制備腸道病毒71型特異性抗體檢測試劑盒中的應用。
全文摘要
腸道病毒71型特異性重組蛋白抗原及其應用，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所述；核苷酸序列如SEQIDNO.2所述；該重組蛋白可應用于制備單克隆抗體、多克隆抗體以及腸道病毒71型特異性抗體的檢測。本發明為腸道病毒71型感染的血清學檢測提供了一種新的診斷抗原，經實驗證明本發明提供的腸道病毒71型特異性抗原具有良好的敏感性和特異性，可被腸道病毒71型感染后的人血清以及滅活全病毒動物免疫血清識別，不但可以用于腸道病毒71型感染的血清學診斷，還可以用于疫苗研發以及使用過程中的免疫效果評價。與全病毒顆粒作為診斷抗原相比，本發明提供的特異性蛋白抗原制備簡便，降低了試劑盒制備的成本。
文檔編號C12N1/21GK102558313SQ201210007599
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者孟繼鴻, 張建華, 徐明杰, 戴星, 江炳福, 程險峰, 董敏, 董晨 申請人:東南大學