專利名稱：一種流感病毒疫苗的制備方法
技術領域：
本發明屬于疫苗制備技術領域，具體涉及一種流感病毒疫苗的制備方法。
背景技術：
流感病毒感染導致急性呼吸道傳染病-流行性感冒，給人類健康和社會生活造成嚴重危害。流感病毒類型多、變異快，當新亞型病毒出現時，人群特異性免疫往往難以奏效。接種流行株疫苗是預防流感流行、保護易感人群最經濟、有效的手段。目前獲得批準生產的流感疫苗主要是雞胚來源的滅活疫苗，這種疫苗存在諸多不足，如生產成本高、周期長，過敏反應，雞胚連續傳代可導致病毒抗原性變異，雞胚還存在可能的外源因子的污染等，特別是如果禽流感爆發，雞群大量死亡，雞胚供應及產量會成為瓶頸。因此，世界衛生組織積極推薦各國發展哺乳細胞培養的流感病毒疫苗的制備。目前，多種哺乳細胞被應用于一些病毒性疫苗的生產，Vero細胞全球公認，MDCK 細胞美國、歐洲認可。而MDCK細胞又被公認為是培養流感病毒最合適的細胞系，該細胞比目前所知的其他細胞對流感病毒更敏感，短時間即可獲得較高滴度的病毒，同時保持流感病毒抗原的穩定性，但MDCK細胞對于每年WHO發布的流感疫苗病毒株不是全能的敏感， 而使得生產的病毒滴度仍有不確定性已成為疫苗生產的瓶頸。有文獻報道同種哺乳細胞表面存在的流感病毒受體的類型和數量是不同的(Govorkova EA，Murti G, Meignier B, Taisne C DE, Webster RG.African Green Monkey Kidney (Vero) Cells Provide an AlternativeHost Cell System for Influenza A and B Viruses. J Virol,1996, 70 (8) 5519-5524.)，因此，建立細胞單克隆庫，篩選病毒敏感的單克隆株，獲得病毒適應性細胞單克隆，提高病毒產量，可為工業化生產流感疫苗奠定基礎。

發明內容
本發明的目的在于提供一種流感病毒疫苗的制備方法，提高流感病毒產量，使其適用于工業化生產。一種流感病毒疫苗的制備方法，按照如下步驟進行(1)哺乳動物細胞單克隆庫的建立將哺乳動物細胞在培養瓶中培養，待細胞生長至匯合度70-90%，用含EDTA的胰蛋白酶消化并計數，取100個細胞稀釋至20ml細胞培養液中，混勻，接種于96孔板，每孔 200 μ 1，置37°C細胞培養箱中培養，待細胞長至40-60%匯合度，消化后轉移至M孔板中繼續培養，每一株單克隆化細胞轉移至一孔，待長至85-95%匯合度后消化、轉移至兩個M孔中繼續培養，待長至85-95%匯合度將細胞進行凍存；(2)病毒高適應性細胞單克隆株的篩選取單克隆細胞接種至M孔板，培養過夜，吸棄培養液，PBS洗2-6次，加入流感病毒及TPCK-TrypSin，37°C培養48_90h后測定細胞培養上清中的血凝滴度，血凝滴度大于28 為病毒高適應性細胞單克隆株；
(3)優化病毒培養條件取病毒高適應性細胞單克隆株鋪至M孔板中，培養過夜，分別優化病毒培養的溫度、收獲時間、添加TPCK-Trypsin的量和感染指數MOI，獲得病毒在病毒高適應性細胞單克隆株中最佳生長參數；(4)在生物反應器中培養病毒高適應性細胞單克隆株，培養48_90h后收集培養液，收集的培養液經超濾膜包濃縮、蔗糖密度梯度離心純化、超離脫糖、滅活，測定血凝素含量后配制成單價或多價流感疫苗。所述哺乳動物細胞為狗腎細胞MDCK、非洲綠猴腎細胞Vero、PER. C6細胞或人二倍體細胞。所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒或具有流感病毒表型的重配病毒株。所述生物反應器培養病毒高適應性細胞單克隆株的方式為微載體懸浮培養或無載體懸浮培養。所述微載體懸浮培養中的微載體為葡聚糖微載體，用量為10_20g/L。本發明的有益效果本發明通過建立細胞單克隆庫、篩選病毒高適應性細胞單克隆株、應用大規模生物反應器進行大規模細胞培養的方法生產流感病毒疫苗，克服傳統雞胚生產流感疫苗生產成本高、周期長，過敏反應、雞胚連續傳代可導致病毒抗原性變異等缺點，大大提高病毒產量，安全、有效、穩定。


圖1為MDCK單克隆細胞株培養甲型Hmi流感病毒疫苗株的血凝滴度檢測。圖2為大規模培養的病毒適應性細胞單克隆株在微載體cytodex 3上生長的顯微照片。圖3為細胞培養的流感病毒純化后的電鏡照片。圖4為細胞培養的流感病毒純化后SDS-PAGE電泳圖；圖中，M-蛋白marker、1-細胞來源的Hmi流感病毒、2-雞胚來源的Hmi流感病
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。實施例1以篩選甲型Hmi流感病毒疫苗株(A/reassortant/NYMC X-179A)高適應性MDCK 細胞單克隆株、應用該單克隆細胞株生產單價甲型Hmi流感病毒疫苗為例。(I)MDCK細胞單克隆庫的建立將從美國標準生物品收藏中心(ATCC)弓丨進的MDCK細胞(p = 53)在75cm2培養瓶中培養，待細胞生長至匯合度80 %，用含EDTA的胰蛋白酶消化并計數，取100個細胞稀釋至 20ml細胞培養液中，混勻，接種于96孔板，每孔200 μ 1，置37°C細胞培養箱中培養，隔日觀察，適時換液，待細胞長至50%匯合度，消化后轉移至M孔板中繼續培養，每一株單克隆化細胞轉移至一孔，待長至90%匯合度后消化、轉移至兩個M孔中繼續培養，待長至90%匯合度取適量細胞進行凍存，建立MDCK細胞單克隆庫。(2)篩選病毒高適應性細胞單克隆株取相同數量的單克隆細胞接種至M孔板，培養過夜，吸棄培養液，PBS洗3次，加入以細胞維持液稀釋的等量流感病毒(10 μ 1)及1 μ g/ml TPCK-Trypsin，37°C培養7 后測定細胞培養上清中的血凝滴度，血凝滴度大于28為流感病毒適應性細胞株M77(圖1)。(3)優化病毒培養條件取相同數量的獲得的流感病毒高適應細胞株(M77)鋪至M孔板中，培養過夜， 分別優化病毒培養的溫度、收獲時間、添加TPCK-Trypsin的量及感染指數(Μ0Ι = 0. 001， 0. 005,0.01,0. 025,0. 1,0. 25,0. 5,1,1. 5，2，3，5，7)，獲得流感病毒在適應株中最佳生長參數，從而獲得更多流感病毒。流感病毒最優培養條件為培養溫度為37°C，添加1 μ g/ml TPCK-Trypsin，感染指數MOI介于0. 001至0. 005間，病毒收獲時間為72h。(4)大規模培養細胞以培養流感病毒及疫苗制備使用的主要設備是美國NBS公司7. 5L生物反應器，工作體積為4L。在生物反應器罐體中加入40g cytodex 3型微載體(GE Healthcare)，同時加入2L磷酸鹽緩沖液PBS，8磅高壓40min，排空PBS，加入10 %胎牛血清DMEM細胞培養液，調整生物反應器轉速、溫度和通氣，預培養過夜。消化4個10層細胞工廠的細胞接種入罐內，將培養溫度設為37°C，攪拌轉速設為65rpm，溶氧設為40%，pH設為7. 4，進行培養，間隔他測定培養液中葡萄糖含量，當葡萄糖含量<lg/L時排出罐內培養液，換新鮮培養液繼續培養。待細胞長滿微載體(圖2)， 全部排空罐內培養液，用Hank's液將罐體和微載體洗3次，加入含1 μ g/ml TPCK-Trypsin 的細胞維持液4L，同時接種流感病毒(感染指數MOI = 0. 001-0. 005)。間隔他測定維持液葡萄糖濃度，低于lg/L時補加葡萄糖至4g/L，72h后收集病毒培養液，培養液中含有高濃度流感病毒(圖幻。收獲的病毒培養液經300kD分子量超濾膜包濃縮、蔗糖密度梯度離心純化(純化后的電泳檢測如圖4所示)、超離脫糖、甲醛滅活、Triton X_100裂解，單擴測定血凝素含量，按照15 μ g HA (血凝素)/劑配制成流感疫苗。
權利要求
1.一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，按照如下步驟進行(1)哺乳動物細胞單克隆庫的建立將哺乳動物細胞在培養瓶中培養，待細胞生長至匯合度70-90%，用含EDTA的胰蛋白酶消化并計數，取100個細胞稀釋至20ml細胞培養液中，混勻，接種于96孔板，每孔 200 μ 1，置37°C細胞培養箱中培養，待細胞長至40-60%匯合度，消化后轉移至M孔板中繼續培養，每一株單克隆化細胞轉移至一孔，待長至85-95%匯合度后消化、轉移至兩個M孔中繼續培養，待長至85-95%匯合度將細胞進行凍存；(2)病毒高適應性細胞單克隆株的篩選取單克隆細胞接種至M孔板，培養過夜，吸棄培養液，PBS洗2-6次，加入流感病毒及 TPCK-TrypSin，37°C培養48_90h后測定細胞培養上清中的血凝滴度，血凝滴度大于28為病毒高適應性細胞單克隆株；(3)優化病毒培養條件取病毒高適應性細胞單克隆株鋪至M孔板中，培養過夜，分別優化病毒培養的溫度、 收獲時間、添加TPCK-Trypsin的量和感染指數Μ0Ι，獲得病毒在病毒高適應性細胞單克隆株中最佳生長參數；(4)在生物反應器中培養病毒高適應性細胞單克隆株，培養48-90h后收集培養液，收集的培養液經超濾膜包濃縮、蔗糖密度梯度離心純化、超離脫糖、滅活，測定血凝素含量后配制成單價或多價流感疫苗。
2.根據權利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述哺乳動物細胞為狗腎細胞MDCK、非洲綠猴腎細胞Vero、PER. C6細胞或人二倍體細胞。
3.根據權利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述流感病毒為甲型流感病毒、乙型流感病毒或具有流感病毒表型的重配病毒株。
4.根據權利要求1所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述生物反應器培養病毒高適應性細胞單克隆株的方式為微載體懸浮培養或無載體懸浮培養。
5.根據權利要求4所述一種流感病毒疫苗的制備方法，其特征在于，所述微載體懸浮培養中的微載體為葡聚糖微載體，用量為10-20g/L。
全文摘要
本發明公開了屬于疫苗制備技術領域的一種流感病毒疫苗的制備方法。該方法首先將哺乳動物細胞單克隆化，建立單克隆細胞庫，然后篩選流感病毒適應的單克隆化細胞株，然后優化病毒適應性細胞株培養病毒條件，最后將病毒適應性細胞株在生物反應器中進行培養，待細胞生長至一定密度時接種流感病毒，參照優化后的病毒培養條件培養病毒，病毒收獲后進行濃縮、純化、滅活和裂解，測定血凝素含量，制備流感病毒疫苗。本發明的方法大大提高病毒產量，安全、有效、穩定。
文檔編號C12N5/071GK102526720SQ20121000768
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月11日 優先權日2012年1月11日
發明者劉坤, 姚志東, 張良艷, 王希良, 邢麗 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院微生物流行病研究所