專利名稱：重組柯薩奇病毒a16型病毒樣顆粒的制備方法及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒的制備方法，特別涉及利用經過密碼子優化的柯薩奇病毒A16型Pl基因和3CD基因，通過酵母表達系統制備重組柯薩奇病毒 A16型病毒樣顆粒的方法。
背景技術：
手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是嬰幼兒常見的傳染病，由人腸道病毒屬的柯薩奇病毒(Coxsackie virus)A組16、4、5、7、9、10型，B組2、5型；埃可病毒 (ECHO viruses)和腸道病毒71型(EV 71)感染引起。其中以EV 71及Cox A16型最為常見(Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH. An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system. J Infect Dis 1974 ；129 304-309.)。CoxA16感染會導致心肌炎、心肌病和無菌性腦膜炎等并發癥，除此之外，CoxA16 還是多種人類疾病的致病原，可引起呼吸道感染、結膜炎、發熱性皮疹、皰疹性咽峽炎、急性弛緩性麻搏等(Yang F, Zhang Τ, Hu YF. Survey of Enterovirus Infections from Hand, Footand Mouth Disease Outbreak in China,2009. Virology Journal 2011;8:1-4·)。 2008年1月1日至2011年10月31日止，全國感染手足口病近476萬例，造成1821名患兒死亡。在2009年中國爆發的手足口病中發現，存在同時感染EV71和CoxA16兩種病毒的病例。
柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CoxA16)屬小RNA病毒，其毒粒為二十面體形，立體對稱，呈球形狀，是裸露的核衣殼，直徑約為23-30nm，無包膜。病毒基因組為約 7kb的單鏈RNA，其組成從5’端到3’端的方向依次為5’端非編碼區，Pl區、P2區、P3區和一段3’端非編碼區。Pl區編碼病毒的主要結構蛋白，即衣殼蛋白(capsule protein)，其轉錄及翻譯產物經蛋白酶水解后，最終得到4個蛋白產物，分別為VP4(IA)，VP2 (IB)，VP3 (IC) 及VP4(1D)。主要的中和抗原位點就在Pl區得VPl上，VP2和VP3上也含有一些中和型的抗原決定簇，但它們存在的區域是在非保守序列中。VP4序列呈高度保守，不暴露在衣殼的外表面，所以不具有中和性抗原決定簇。P2區呈現P2A、P2B和P2C三個部分。P2A蛋白的這一區域是起抑制宿主細胞mRNA轉錄作用的。P2B的功能與轉膜作用有關，而P2C蛋白據推測其參與病毒RNA基因組的復制。P3區中，VPg(P3A)前體通過加工成為成熟的VPg。P3C 是一個蛋白酶，可以自動催化自我剪切釋放。3D是一個RNA合成酶，是在RNA復制過程中的依賴RNA的RNA多聚酶，它可以復制合成病毒的RNA。
研究顯示CoxA16滅活病毒免疫小鼠可產生具有保護效力的抗CoxA16和抗 EV71兩種中和抗體，可顯著提高攻毒試驗中實驗動物的存活率(Wu TC, Wang YF, Lee YP. Immunity to Avirulent Enterovirus 71 and Coxsackie A16 Virus Protects against Enterovirus 71 Infection in Mice. Journal Of Virology 2007 ；81 10310-10315.)。但目前，還沒有針對CoxA16感染的特效藥或疫苗上市，因此，研制CoxA16 預防性疫苗對于控制嬰幼兒手足口病的流行具有重要意義。而病毒樣顆粒在形態上和真實的病毒類似，并且不含有潛在的致病病毒基因組，所以病毒樣顆粒為抗病毒預防性疫苗的開發提供了理想的備選方案。發明內容
本發明的一個目的是提供一種柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒的制備方法。
本發明所提供的柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒的制備方法包括如下步驟
1)將柯薩奇病毒A16型的Pl基因和3⑶基因克隆到目的質粒中，得到重組表達載體；
2)用步驟1)得到的重組表達載體轉化目的酵母細胞，得到表達所述Pl基因和 3⑶基因的重組酵母細胞；
3)裂解步驟幻得到的重組酵母細胞，分離得到重組的柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒。
上述步驟1)中，所述Pl基因和所述3CD基因均為經過密碼子優化的基因；所述優化為在不改變野生型柯薩奇病毒A16型Pl蛋白和野生型柯薩奇病毒A16型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型柯薩奇病毒A16型Pl基因和野生型柯薩奇病毒A16型3CD基因的密碼子替換為酵母細胞偏好(高頻使用)的密碼子。所述優化還包括對Pl基因序列和 3⑶基因序列的其他改造，以適合在酵母細胞中表達。本發明中使用的術語“偏好的密碼子” 具有本領域公知的含義，也稱為密碼子的偏好性(CodonPref erence)，是指某些生物體更偏愛使用某些同義三聯密碼子(即編碼相同氨基酸的密碼子)。
在本發明的一個實施例中，上述步驟1)中所述Pl基因(經過密碼子優化的基因， 命名為COXA16P1Y)的核苷酸序列為序列表中序列1所示；所述3CD基因(經過密碼子優化的基因，命名為Cox A163CDY)的核苷酸序列為序列表中序列2所示。為適合在酵母細胞中表達，根據本發明描述的方法對柯薩奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因進行改造獲得的其他基因序列也屬于本發明的保護范圍。
上述步驟幻中，所述目的酵母細胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發明的一個實施例中，所述目的酵母細胞具體為釀酒酵母INVSCl。
所述Pl基因和3⑶基因在所述重組表達載體中各由一個啟動子驅動轉錄，驅動所述Pl基因的啟動子方向和驅動所述3CD基因的啟動子方向相反。在本發明的一個實施例中，所述重組表達載體為將所述Pl基因和所述3CD基因分別插入到pESC-URA的兩個多克隆位點處。具體可將所述Pl基因插入到所述PESC-URA的多克隆位點1(MCS1/FLAG)的 SpeI和I^c I之間；將所述3⑶基因插入到所述pESC-URA的多克隆位點2 (MCS2/myc)的 Sal I和Kpn I之間，得到的重組質粒。
利用本發明所提供的方法制備得到的柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒也屬于本發明的保護范圍。
本發明的另一個目的是提供密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的Pl基因和3CD基因。
本發明所提供的密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的Pl基因(CoxA16 PlY)的核苷酸序列為序列表中序列1所示；本發明所提供的密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的3CD基因(Cox A16 3CDY)的核苷酸序列為序列表中序列2所示。為適合在酵母細胞中表達，根據本發明描述的方法對柯薩奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因進行改造獲得的其他基因序列也屬于本發明的保護范圍。
其中，序列1由2589個核苷酸組成，為優化后柯薩奇病毒A16型Pl基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列5所示的蛋白，序列5由862個氨基酸組成；序列2 由1941個核苷酸組成，為優化后的柯薩奇病毒A16型3CD基因的編碼序列，其編碼所得的蛋白為序列表中序列6所示的蛋白，序列6由646個氨基酸組成。
含有上述密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的Pl基因或3⑶基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本發明的保護范圍。
所述重組表達載體可為將所述Pl基因和所述3⑶基因分別插入到pESC-URA質粒的兩個多克隆位點處，得到的重組質粒。所述重組菌可為攜帶有上述密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因的重組酵母細胞。所述酵母細胞可為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本發明的一個實施例中，所述酵母細胞具體為釀酒酵母INVSCl。
所述表達盒由能夠啟動所述密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的Pl基因或3CD 基因表達的啟動子，所述密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因，以及轉錄終止子組成。在本發明的一個實施例中，所述啟動子具體為釀酒酵母GALl和GALlO啟動子，當然也可以使用其他公知的酵母啟動子的任何一種，如GAL7、ADH1、ADH3和PGK啟動子， 或者其他真核基因啟動子。在本發明的一個實施例中，所述轉錄終止子具體為ADHl和CYCl 終止子。
上述密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的Pl基因或3CD基因在制備下述a)或b) 中的應用也屬于本發明的保護范圍
a)柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒；
b)以柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒為活性成分的預防性疫苗。
本發明還涉及并提供了在重組宿主細胞中同時表達Cox A16 Pl蛋白和3⑶蛋白的方法，該方法包括(1)將含有編碼Cox A16 Pl蛋白和3CD蛋白的編碼基因的重組表達載體導入重組宿主細胞，如重組的酵母細胞(釀酒酵母INVSC1)。( 在允許所述的Cox A16 Pl蛋白和3CD蛋白同時表達的條件下培養重組宿主細胞，如重組的酵母細胞(釀酒酵母 INVSC1)。
本發明對野生型的柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CoxA16)的Pl基因或3⑶基因進行了酵母細胞偏好型密碼子優化，從而提高了 CoxA16 Pl蛋白和CoxA16 3⑶ 蛋白在酵母細胞中的表達水平(見圖5)。在本發明中，Cox A16 Pl蛋白和CoxA16 3⑶蛋白在酵母細胞中同時表達，Cox A16 3⑶蛋白對Cox A16P1蛋白進行酶切后得到VP1、VP2、 VP3、VP4四種結構蛋白(3⑶是3C的前體，由3⑶蛋白產生的3C蛋白為一種蛋白酶，可將 Pl蛋白水解為VP1、VP2、VP3、VP4四種結構蛋白)。這四種結構蛋白進而自行組裝成柯薩奇病毒A16型的病毒樣顆粒(Cox A16VLPs)。
實驗證明，利用本發明所提供的方法，在酵母表達系統(釀酒酵母INVSC1)中成功的制備了 Cox A16 VLPs0同時較野生型Pl基因和3⑶基因相比，本發明對Pl基因和3⑶基因的密碼子優化大大提高了 Cox A16 VLPs在酵母表達系統中的產量。所述Cox A16 VLPs可以用于制備基于VLP的Cox A16預防性疫苗。


圖1為pESC-P 1Y質粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bp DNA Marker ；泳道B為pESC_URA質粒對照；泳道C為pESC-PlY質粒。
圖2為pESC-PIY質粒的SpeI及I^ac I酶切鑒定結果。其中，用泳道A為15000bpDNA Marker ；泳道B為pESC-PlY質粒的SpeI及I^ac I酶切鑒定結果。
圖3為PESC-P1Y-3CDY質粒的瓊脂糖凝膠電泳圖。其中，用泳道A為15000bpDNA Marker ；泳道B為pESC-PlY質粒對照；泳道C和泳道D為pESC_PlY_3⑶Y質粒。
圖4為pESC-P 1Y-3⑶Y質粒的Ml I及Kpn I酶切鑒定結果。其中，用泳道A為 15000bp DNA Marker ；泳道 B 為 pESC_PlY_3CDY 質粒的 Sal I 及 Kpn I 酶切鑒定結果。
圖5 S^festern Blot鑒定重組Cox A16衣殼蛋白的表達。其中，泳道A為蛋白分子量對照；泳道B為INVSCl/pESC-PlY-3CDY蛋白提取物；泳道C為INVSCl酵母蛋白提取物；泳道D為INVSCl/pESC-PlW-3CDW蛋白提取物。
圖6為通過透射電鏡技術顯現的Cox A16病毒樣顆粒(VLPs)的代表樣品。
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1、Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因的密碼子優化及全基因合成
以下按分步驟詳細描述Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因的密碼子優化及全基因合成的流程。
UCox A16 Pl基因和Cox A16 3CD基因的密碼子優化
根據野生型Cox A16 Pl基因序列(如序列表中序列3所示)和野生型Cox A16 3CD基因序列(如序列表中序列4所示)，經過設計和反復驗證得到適合于在酵母細胞中表達的優化型Cox A16 Pl基因序列和優化型Cox A16 3⑶基因序列，即將Cox A16病毒的Pl 基因序列和3CD基因序列在不改變氨基酸序列的前提下轉變成含有如Siarp PM等Gharp PM, Cowe E. Synonymous Codon Usage inSaccharomyces cerevisiae. Yeast,1991,7 (7) 657-678.)所描述的酵母優選密碼子的優化序列，從而提高Cox A16 Pl蛋白和Cox A16 3⑶ 蛋白在酵母細胞培養環境中的表達水平。
根據上述方法，最終獲得按酵母密碼子偏好設計的優化型Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因，分別命名為Cox A16 PlY和Cox A16 3⑶Y，其基因序列分別為序列表中序列 1和序列2。Cox A16 PlY基因(序列1)編碼的蛋白與序列3所示野生型Cox A16 Pl基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列5所示氨基酸序列組成的蛋白；Cox A16 3CDY基因 (序列2)編碼的蛋白與序列4所示野生型Cox A16 3CD基因編碼的蛋白一致，均為序列表中序列6所示氨基酸序列組成的蛋白。
2、密碼子優化型Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因的全基因合成
使用序列重疊延伸PCR法全基因合成Cox A16 PlY和Cox A16 3⑶Y，具體方法如下根據優化Cox A16 PlY和Cox A16 3⑶Y的基因序列合成多條IOObp的上下游片段，兩6片段間3’端互補重疊Mbp，所述上下游片段互為模板、引物進行PCR擴增，使用凝膠回收試劑盒回收擴增片段，再以此相鄰的回收片段互為引物、模板進行下一輪PCR擴增，得到拼接序列，再以相鄰拼接序列互為模板、引物進行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互為模板、引物進行PCR拼接，依此類推最終合成全長的密碼子優化型Cox A16 Pl基因和 Cox A163CD 基因，即 Cox A16 PlY 和 Cox A163CD Y。
實施例2、攜帶Cox A16 PlY和Cox A16 3⑶Y的酵母重組表達載體的構建
1、大腸桿菌DH5a感受態細胞的制備
從37°C培養16 20h的新鮮平板上挑取DH5 α單菌落(Takara公司，產品目錄號為D9057S)，接種于5ml不含抗菌素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜(12 16h)。 次日從上述培養物中吸取0.5ml按體積比1 100轉入50ml LB培養基中繼續培養約池， 至菌液的0D600值為3時，在無菌條件下將細菌轉移到一無菌、用冰預冷的50ml離心管中， 冰浴30min。在4°C條件下，4000rpm離心lOmin，棄上清，將管倒置lmin，使殘留培養液流盡，以IOml用冰預冷的IOOmM的CaC12溶液重懸細菌沉淀，冰浴30min。4°C，4000rpm離心 IOmin,棄上清，每50ml初始培養物用2ml預冷的含15%甘油的IOOmM的CaCl2溶液重懸細菌沉淀，分裝成200 μ 1每管，_80°C保存備用。
2、pESC-URA 質粒的轉化
用無菌吸頭分別吸取1 μ g pESC-URA質粒(一種具有雙向啟動子的酵母表達質粒，購自Angilent technologies，產品目錄號為217454)加入200 μ 1上述步驟1制備的 DH5a感受態細胞中，輕輕旋轉混勻，冰浴30min。將管移入42°C水浴箱中水浴90s，然后將管快速轉移到冰浴中，使細胞冷卻1 2min。每管加入800 μ 1不含抗生素的LB培養基(蛋白胨、酵母提取物、氨芐青霉素購自北京欣經科公司，NaCl購自國藥化學試劑有限公司)， 將管轉移至37°C搖床上，溫育45min (轉速< 150rpm)。取50 μ 1已轉化的感受態細胞，用一無菌的彎頭玻棒輕輕涂到含相應抗生素的LB平板表面，將平板置于室溫至液體被吸收， 倒置平皿，于37°C培養12 16h。
3、pESC-URA質粒的小量制備
挑取經上述步驟2轉化培養所得的單菌落接種于5ml含氨芐青霉素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜。將培養物移入1. 5ml Eppendorf管中，12000rpm離心30_60s， 倒去培養液，倒置離心管，使上清流盡，用ΙΟΟμ 1預冷的溶液1(終濃度為50mmol/L的葡萄糖，終濃度為25mmol/L的Tris-HCl，終濃度為lOmmol/L的EDTA，pH8. 0)重懸菌體，劇烈振蕩混勻；加入200 μ 1新鮮配制的溶液II (終濃度為0. 2mol/L的NaOH，終濃度為質量百分含量1 %的SDS)，溫和混勻，冰浴3min，至液體清亮；加入150 μ 1預冷的溶液III (配制100ml 溶液 III :5mol/L KAc 60ml，冰乙酸 11. 5ml，水 28. 5ml)溫和混勻，冰浴 lOmin, 12000rpm 離心lOmin，小心吸取上清，將上清轉移至另一離心管中，加入2倍體積的無水乙醇室溫沉淀30min，12000rpm離心lOmin，棄上清，沉淀用70 %乙醇洗一次，室溫晾干后，用30 μ 1含 RNaseAdOOy g/ml)的TE (pH 8. 0)溶解沉淀，37°C水浴30 60min后置_20°C保存備用。
4、酵母重組表達載體pESC-ΡΙΥ的構建
將實施例1得到的Cox A16 PlY基因克隆到pESC-URA質粒的多克隆位點1 (MCS1/ FLAG)的SpeI和I^cI之間，得到酵母重組表達載體pESC-ΡΙΥ。具體按照如下步驟進行
1)將實施例1得到的Cox A16 PlY基因(如序列表中序列1所示)的5’端和3’端分別引入限制性內切酶SpeI和I^c I (限制性內切酶SpeI及I^c I購自大連寶生物工程有限公司)的酶切位點，在Cox A16 3⑶Y基因(如序列表中序列2所示)的5’端和3’ 端分別引入限制性內切酶Ml I和Kpn 1(限制性內切酶Ml I及Kpn I購自大連寶生物工程有限公司)的酶切位點。具體操作如下(1)以實施例1得到的Cox A16 PlY基因(如序列表中序列1所示)為模板，用如下引物進行PCR擴增得到5’端和3’端分別引入限制性內切酶SpeI和I^ac I酶切位點的Cox A16P1Y基因片段上游引物為5，-GGACTAGTACCAT GGGTTCTCAAGTTTCTACTCA-3’(下劃線處為限制性內切酶SpeI酶切位點的序列)；下游引物為 5，-CCTTAATTAATTACAAAGTAGTAATTTTATAGAA-3‘(下劃線處為限制性內切酶 Pac I 酶切位點的序列)。(2)以實施例1得到的Cox A16 3CD Y基因(如序列表中序列1所示)為模板，用如下引物進行PCR擴增得到5’端和3’端分別引入限制性內切酶Ml I和Kpn I 酶切位點的Cox A16 3CD Y基因片段上游引物為5’ -ACGCGTCGACACCATGGGT-3’ (下劃線處為限制性內切酶Ml I酶切位點的序列)；下游引物為5’ -GGGGTACCTTAAAACAATTCCAACC AATTTCT-3’(下劃線處為限制性內切酶Kpn I酶切位點的序列)。
2)使用限制性內切酶SpeI和I^c I酶切上述步驟3制備的pESC_URA質粒，回收骨架載體(大片段，由于小片段大小僅約為^bp,瓊脂糖凝膠電泳時經常無法顯示)與經同樣酶切的Cox A16 PlY基因片段按1 4比例混合，依次加入IOX T4 DNA連接酶緩沖液和T4 DNA連接酶(T4 DNA連接酶及10XT4 DNA連接酶緩沖液購自大連寶生物工程有限公司)，反應體積為20μ 1，16°C連接過夜，取10μ 1連接反應產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。從接種轉化產物的LB瓊脂平板上挑取若干個單菌落，接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜，按步驟3所述質粒的快速小量制備方法提取重組質粒(圖1)。并用內切酶SpeI及I^c I對重組質粒進行酶切鑒定，鑒定結果如圖2所示， 得到大小約為6600bp和^OObp的兩個條帶，與預期結果相符，進一步經酶切鑒定后的重組質粒送公司測序，將測序證實含有Cox A16 PlY基因的重組質粒命名為pESC-ΡΙΥ。采用相同的方法構建含有野生型Cox A16 Pl基因(Cox A16 P1W，序列幻對照重組質粒，命名為 PESC-Plff0
5、酵母重組表達載體pESC-PlY-3CDY的構建
將實施例1制備的所述Cox A16 3CDY基因克隆到上述步驟4制備的酵母重組表達載體pESC-ΡΙΥ的多克隆位點2 (即為pESC-URA質粒的多克隆位點2，MCS2/myc)的Sal I和Kpn I之間，得到酵母重組表達載體pESC-PlY-3⑶Y。具體按照如下步驟進行
使用限制性內切酶Ml I和Kpn I酶切上述步驟4制備的酵母重組表達載體 pESC-ΡΙΥ，回收骨架載體(大片段)與經同樣酶切的CoxAie 3⑶Y基因片段按1 4比例混合(DNA Marker和DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自大連寶生物工程有限公司)，依次加入 10XT4DNA連接酶緩沖液和T4DNA連接酶，反應體積為20μ 1，16°C連接過夜，取10μ 1連接反應產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞。從接種轉化產物的LB瓊脂平板上挑取若干個單菌落，接種到5ml含相應抗生素的LB培養基中，37°C劇烈振蕩培養過夜，按步驟3所述質粒的快速小量制備方法提取重組質粒(圖幻。并用內切酶Ml I及Kpn I對重組質粒進行酶切鑒定，鑒定結果如圖4所示，得到大小約為9200bp和1900bp的兩個條帶，與預期結果相符，進一步經酶切鑒定后的重組質粒送公司測序，將測序證實含有CoxAie 3⑶Y基因的重組質粒命名為PESC-P1Y-3CDY。酵母重組表達載體PESC-P1Y_3CDY中，啟動所述CoxA16 PlY基因轉錄的啟動子為釀酒酵母GALlO啟動子，轉錄終止子為ADHl終止子；啟動所述CoxA16 3CDY基因轉錄的啟動子為釀酒酵母GALl啟動子，轉錄終止子為CYCl終止子。采用相同的方法構建同時含有野生型CoxA16 Pl基因(CoxA16 P1W，序列；3)和野生型CoxA16 3CD基因 (CoxA 16 3CDW，序列4)的對照重組質粒，命名為pESC_PlW_3CDW。
實施例3、重組CoxAie病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達及純化
1、釀酒酵母感受態細胞的制備
在釀酒酵母平板中挑取單克隆菌落INVk 1 (Saccharomyces cerevisiae，產品目錄號C81000，購自Invitrogen)接種于IOml YPD培養液(購自北京欣經科公司)中，30°C 振搖培養16h，取合適體積的培養物加入48ml YPD培養液中混勻，使其0D600值為0. 5， 30°C振搖培養Ih后0D600值為0. 7，繼續培養30min后，將培養物轉入50ml無菌的離心管中，室溫 1500rpm 離心 5min，棄上清，用 IOml Sc EasyComp transformation kit(購自 Invitrogen)中的溶液I (試劑盒自帶)重懸沉淀，室溫1500rpm離心5min，小心棄上清，用 Iml溶液II (試劑盒自帶)重懸沉淀，50 μ 1/管分裝滅菌的1. 5ml離心管中，置_70°C保存。
2、酵母重組表達載體PESC-P1Y-3CDY轉化酵母感受態細胞
將4 μ 1實施例2制備的酵母重組表達載體pESC-PlY-3⑶Y加入到上述步驟1制備的酵母INVSCl感受態細胞中，加入500 μ 1 Sc EasyComp transformation kit (購自 Invitrogen)中的溶液III，在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻，得到DNA/酵母混合物。將DNA/ 酵母混合物置30°C水浴中孵育lh，每隔15min在渦旋振蕩器上劇烈振蕩混勻。取100 μ 1 涂布URA選擇平板(選擇性培養液(tea-) :YNB6.7g，酵母tea營養缺陷培養基粉末(Sigma 公司，Y1501) 1. 92g，如制平板加入20g瓊脂粉，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至 50°C，加入IOOml無菌的20%葡萄糖。)0_，置30°C孵箱中倒置培養2_4天。隨機挑取5個單克隆菌落接種于IOml URA選擇培養液中，30°C振搖培養16h，離心收集酵母細胞。將經過上述鑒定表明成功轉入重組表達載體PESC-P1Y-3CDY的酵母INVSCl細胞命名為INVSCl/ PESC-P1Y-3CDY。同時設置轉入pESC_URA空載體的酵母INVSCl細胞的對照，將該酵母細胞命名為INVSCl/pESC-URA。采用相同的方法得到轉入重組表達載體PESC-P1W_3CDW的酵母 INVSCl 細胞，將其命名為 INVSCl/pESC-PlW-3CDW。
3、重組Cox A16病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達及純化
1)重組Cox A16病毒樣顆粒在酵母細胞中的大量表達將經過上述步驟2獲得的 INVSCl/pESC-PlY-3CDY(實驗組)、INVSCl/pESC-PlW_3CDW(對照組)和 INVSCl/ pESC-URA (陰性對照組)單菌落分別接種于50ml URA選擇培養液(選擇性培養液⑴ra_) YNB 6. 7g，酵母tea營養缺陷培養基粉末(Sigma公司，Y1501) 1. 92g，溶于900ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入IOOml無菌的20%葡萄糖。)中，30°C振搖培養16h，取合適體積的培養液接種于500ml URA選擇培養液中，使0D600值為0. 4，30°C振搖培養4h，取合適體積的培養液接種3L URA誘導培養液(YNB6. 7g，酵母tea營養缺陷培養基粉末(Sigma公司，Y1501) 1. 92g，溶于800ml去離子水中，高壓滅菌，冷卻至50°C，加入100ml無菌的20% 半乳糖和100ml無菌的20%麥芽糖)，使0D600值為0. 4，30°C振搖培養48h，離心收集菌體沉淀，用PBS緩沖液重懸，APV高壓均質儀以1500bar循環破碎3次，4°C 8000g離心15min， 收集上清(破碎菌液上清)，置-70°C保存。將1倍體積的50% PEG溶液(50% PEG溶液 50gPEG6000 (Ameresco公司)溶于100ml ddH20)緩慢加入到4倍體積的上述破碎菌液上清中，4°C攪拌過夜。第二日，4°C 8000rpm，30min離心，去除上清，收集沉淀。用無菌PBS重懸沉淀，濃縮至樣品原體積的1/10，得到濃縮樣品(實驗組濃縮樣品、對照組濃縮樣品和陰性對照組濃縮樣品)。
2)重組Cox A16病毒樣顆粒的純化在離心管中由下至上依次小心加入1. 4g/ml、 1. 32g/ml和1. 2g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液(上述步驟1)中得到的濃縮樣品)置CsCl不連續密度梯度(CsCl購自北京欣經科公司)，4°C用Beckman SW32Ti轉頭 IOOOOOg離心21h，PBS緩沖液重懸沉淀，4°C 13000g離心15min，收集上清液置_70°C保存， 得到待測樣品(實驗組待測樣品、對照組待測樣品和陰性對照組待測樣品)。
對純化后的待測樣品通過紫外分光光度計進行蛋白產量測定，結果顯示利用本發明所提供的密碼子優化后的重組表達載體PESC-P1Y-3⑶Y，在酵母表達系統中，每升發酵液可以制備得到約400-500mg的重組Cox A16病毒樣顆粒；而野生型的重組表達載體 PESC-P1W-3CDW在酵母表達系統中，每升發酵液制備的Cox A16病毒樣顆粒少于10mg。這一結果說明，密碼子優化有效的提高了 Cox A16病毒樣顆粒在酵母表達系統中的產量。
實施例4、重組Cox A16病毒樣顆粒的鑒定及電鏡觀察
對實施例3制備的待測樣品(實驗組待測樣品和對照組待測樣品)進行Western Blot鑒定和電鏡觀察。
Uffestern Blot鑒定重組Cox A16衣殼蛋白的表達利用碧云天公司的BCA蛋白定量試劑盒(增強型)(POOlOS)，按照說明書操作步驟，對實施例3得到的純化后的待測樣品(實驗組待測樣品、對照組待測樣品或陰性對照)進行蛋白定量。根據定量結果，對三種待測樣品各取適量的懸液(保證三種樣品的上樣蛋白總量相等)進行10% SDS-PAGE電泳。用識別Cox A16全蛋白的兔多克隆抗體為一抗(一抗由北京義翹神州生物技術有限公司提供)，熒光標記羊抗兔抗體為二抗(二抗購自KPL，產品目錄號為072-07-15-06)進行 Western Blot 分析(蛋白 Marker 購自 Fermentas 公司)。
結果如圖5所示，實驗組待測樣品和對照組待測樣品均檢測到大小約為 34KD(VPl)、30KD(VP2)和27KD(VP3)的Cox A16三條特異性條帶(由于VP4蛋白大小僅為 7KD，所以很難同時檢測到)，且實驗組(密碼子優化后)所檢測到的CoxAie三條特異性條帶信號明顯強于對照組(野生型)；而陰性對照組待測樣品未檢測到Cox A16的特異性條市ο
2、重組Cox A16病毒樣顆粒的電鏡觀察將實施例3得到的純化后的三個待測樣品(實驗組待測樣品、對照組待測樣品或陰性對照)調整蛋白濃度一致，各取10 μ 1懸液滴加在覆蓋鍍碳支持膜上靜止lmin，吸干鍍碳支持膜(購自中鏡科儀，編號BZ11022;3)表面殘余液體，用2%磷鎢酸(購自中鏡科儀，編號GZ02536)染色lmin，吸干鍍碳支持膜表面殘液，室溫放置干燥后用透射電子顯微鏡觀察其形態結構。
結果顯示，實驗組待測樣品(圖6)和對照組待測樣品在電鏡下均可見直徑約30nm 左右的病毒樣顆粒的存在，且相同濃度條件下，同一電鏡視野下實驗組(密碼子優化后)待測樣品觀測到病毒樣顆粒要明顯多于對照組(野生型)待測樣品；而陰性對照組(空載體) 測樣品則沒有在電鏡下觀察到病毒樣顆粒的存在。
本實施例的結果表明，攜帶有密碼子優化后的Cox A16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因的重組表達載體在酵母系統中，成功的包裝出Cox A16的病毒樣顆粒，同時較野生型CoxA16 Pl基因和Cox A16 3⑶基因相比，本發明經過密碼子優化后提高了 Cox A16病毒樣顆粒在酵母表達系統中的產量。
權利要求
1.柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒的制備方法，包括如下步驟1)將柯薩奇病毒A16型的Pl基因和3CD基因克隆到目的質粒中，得到重組表達載體；2)用步驟1)得到的重組表達載體轉化目的酵母細胞，得到表達所述Pl基因和所述 3⑶基因的重組酵母細胞；3)裂解步驟幻得到的重組酵母細胞，分離得到重組的柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因均為經過密碼子優化的基因；所述優化為在不改變野生型柯薩奇病毒A16SP1蛋白和野生型柯薩奇病毒A16型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，將野生型柯薩奇病毒A16型Pl基因和野生型柯薩奇病毒A16型3CD基因的密碼子替換為酵母細胞偏好的密碼子。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列為序列表中序列1所示；所述3CD基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述目的酵母細胞為釀酒酵母、多形漢遜酵母、巴斯德畢赤酵母、胞壁克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述Pl基因和所述3CD基因在所述重組表達載體中各由一個啟動子驅動轉錄，驅動所述Pl基因的啟動子方向和驅動所述3CD基因的啟動子方向相反。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述重組表達載體為將所述Pl 基因和所述3CD基因分別插入到pESC-URA的兩個多克隆位點處各由一個啟動子驅動轉錄得到的重組質粒。
7.利用權利要求1-6中任一所述方法制備得到的柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒。
8.密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的Pl基因，其特征在于所述Pl基因的核苷酸序列為序列表中序列1所示；和/或密碼子優化型的柯薩奇病毒A16型的3CD基因，其特征在于所述3CD基因的核苷酸序列為序列表中序列2所示。
9.含有權利要求8所述Pl基因和/或3CD基因的重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
10.權利要求8所述Pl基因和/或3CD基因在制備下述a)或b)產品中的應用a)柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒；b)以柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒為活性成分的預防性疫苗。
全文摘要
本發明公開了重組柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒的制備方法。本發明所提供的方法包括如下步驟1)將柯薩奇病毒A16型的P1基因和3CD基因克隆到目的質粒中，得到重組表達載體；2)用步驟1)得到的重組表達載體轉化目的酵母細胞，得到表達所述P1基因和所述3CD基因的重組酵母細胞；3)裂解步驟2)得到的重組酵母細胞，分離得到重組的柯薩奇病毒A16型病毒樣顆粒。利用本發明所提供的方法能在酵母表達系統中制備得到柯薩奇病毒A16型的病毒樣顆粒，同時較野生型P1基因和3CD基因相比，本發明對P1基因和3CD基因的密碼子優化大大提高了柯薩奇病毒A16型的病毒樣顆粒在酵母表達系統中的產量，可將其進一步用于生產嬰幼兒手足口病候選預防性疫苗和藥物組合物。
文檔編號C12N1/19GK102533797SQ201210008528
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者曾毅, 李澤琳, 王曉雯, 盛望, 陳琳 申請人:北京工業大學