專利名稱：用于多重連接擴增技術的探針制備方法
技術領域：
本發明涉及寡核苷酸探針制備，具體為可用于多重連接擴增技術(MLPA)的長探針的制備方法。
背景技術：
多重連接擴增技術(multiplex Ii gat ion-dependent probe amplification， MLPA)是一種高通量的基因檢測方法，該技術利用核酸雜交、連接反應和PCR擴增反應，可以在同一反應管內對多達45種不同的核苷酸序列進行檢測和定量分析。至今MLPA技術已應用于多種領域的研究及基因診斷，并且不斷的有新的技術改進，尤其是在探針設計上，有采用M13單鏈噬菌體插入到衍生的序列兩端涉及了限制性內切酶識別位點，以便獲得采用雙酶切獲得長探針；
在申請號為200910108977. 4，名稱為“可用于多重連接擴增技術的長探針的制備方法”，文件中公開了一種采用PCR方法結合親和素磁殊法制備可用于多重連接擴增技術的長探針，該公開的技術方法主要包括針對目標核苷酸序列和用于制備長探針的與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列設計一對PCR擴增引物，分別為通用引物和檢測引物；通用引物的5’端標記生物素；以所述與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列為模板進行PCR擴增，獲得生物素標記的雙鏈核苷酸序列；將生物素標記的雙鏈核苷酸序列與親和素標記的親和素磁珠混合，使生物素標記的雙鏈核苷酸序列與親和素磁蛛相互吸附；使生物素標記的的雙鏈核苷酸序列變性，解鏈形成單鏈；離心取上清，獲得非生物素標記的單鏈核苷酸序列。該方法雖然操作簡單，但是需要磁珠分離系統，成本較高，并且在磁珠分離過程中有磁珠結合不完全造成dsDNA殘留，探針得率不高。

發明內容
為解決上述技術問題，本發明旨在提供一種低成本、高得率的可用于多重連接擴增技術的探針制備方法。用于多重連接擴增技術的探針制備方法，包括以下步驟
1)設計一對與待測靶片段及長探針核苷酸序列無關的檢測引物，分別為GPl和GP2，用于最后的PCR擴增檢測，所述的GPl為5’端帶熒光基團修飾，同時合成5’端帶磷酸化修飾的右探針RP0-N，由目的右探針序列與GP2的反向互補序列組成；
2)確定一段與探針及通用引物無關的核苷酸序列S，并用于設計一對擴增左端長探針的引物，分別為GPL和LP0-N’，其中GPL是由GPl的序列與S序列的前18bp左右的序列組成，LPO-N'由目的左探針序列的反向互補序列與S序列中的18bp左右反向互補的序列組成，并且其5’端要帶上磷酸化修飾；
3)用GPL和LPN以所述的一段與探針及通用引物無關的核酸序列為模板進行PCR擴增，獲得互補鏈5’磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列；
4)純化回收PCR產物；5)采用核酸Lamda外切酶對以上雙鏈核苷酸序列進行消化，去除5’磷酸化標記的那條單鏈DNA ；
6)采用ssDNA純化回收試劑盒對消化產物進行回收，便得到左端長探針。擴增左端探針的引物由兩段核苷酸序列組成，一段根據探針檢測目標的核苷酸序列設計，另一段根據與待檢測靶片段無關的模版核苷酸序列設計。所述PCR擴增得到的5’磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列需先經過純化再進行 Lambda外切酶消化。步驟5)所述的Lambda外切酶消化過程中，1 μ g雙鏈DNA用1個單位Lambda外切酶消化。本發明所述MLPA探針制備方法與采用M13噬菌體制備MLPA相比，具有以下優點 1) PCR擴增引物簡單，只需考慮引物Tm值和長度等一般性問題，通過結合目標核苷酸
序列，針對模版設計一對引物即可。2)利用簡單的PCR和Lambda外切酶消化即可獲得長探針，無需M13噬菌體培養， 可一天內完成探針制備工作，大大降低了 MLPA技術門檻。3)無需進行克隆制備，無需特異性內切酶酶切，操作簡單。4)探針制備靈活性更強，可針對基因組DNA、質粒、人工基因序列等進行制備所需探針。5)探針所需的填充序列來源方便，可使不同探針填充序列保持一致，也可根據需要選擇不同模版擴增所需填充序列，降低雜交時的非特異性雜交，提高檢測成功率。本發明所述MLPA探針制備方法與采用鏈親和素磁珠法制備MLPA相比，具有以下優點
1)成本低廉，只需要PCR儀即可完成擴增、酶切等全部操作，無需添置單獨的磁珠分離系統，且每μ gDNA探針制備成本不到磁珠法1/10。2)酶消化后使用專門的ssDNA回收試劑盒進行回收，排除了沒有消化完全的 dsDNA和核苷酸，保證得到的為所需單鏈探針，避免了磁珠分離過程中磁珠結合不完全造成的dsDNA殘留，提高MLPA實驗時的雜交效率。3)探針得率高，通過充分的Lambda外切酶消化，可最大程度的將dsDNA變為 ssDNA,避免了磁珠法中因為磁珠結合后DNA變性不完全造成的ssDNA得率下降，從而提高了探針制備效率。


圖1本發明的方法流程圖2本發明實施例中的瓊脂糖凝膠電泳分析結果圖。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實例說明本發明的制備方法，具體為用多重連接擴增技術檢測人基因組CECRl基因的長探針的制備及其檢測，包括以下步驟
1)設計一對與待測靶片段及長探針核苷酸序列無關的檢測引物，分別為GPl (5’端帶熒光基團修飾)和GP2，用于最后的PCR擴增檢測；同時合成5’端帶磷酸化修飾的右探針CN 102534004 A
R-CECRl，由CECRl右探針序列與GP2的反向互補序列組成；
2)與待檢測靶片段無關的模板核苷酸序列(S)的選擇，并根據S和目標核苷酸序列設計引物；
3)人工合成引物GPL(由GPl的序列和S序列的前18nt組成)和L-CECRl'(由S序列下游23nt的反向互補序列+CECRl左探針序列的反向互補序列CECR1，組成)，且在L-CECRl， 的5’末端帶上磷酸化修飾；
4)PCR擴增；
5)PCR產物純化回收；
6)Lamda核酸外切酶對PCR純化回收產物進行消化；
7)用ssDNA純化回收試劑盒對Lamda核酸外切酶消化的PCR產物進行回收，即得到用于多重連接擴增技術左端的長探針，由GPl的序列、S序列和CECRl的左探針序列組成。8)用上述得到的CECRl基因的左端長探針與合成的5’端磷酸化的右端短探針一起跟基因組DNA進行雜交反應，連接后PCR擴增，行瓊脂糖凝膠電泳分析。實施步驟1引物的設計合成。設計一對與待測靶片段及長探針核苷酸序列無關的易于進行PCR擴增的檢測引物，分別為GPl (5’端帶熒光基團修飾)和GP2，用于最后的PCR擴增檢測，同時合成5’端帶磷酸化修飾的右探針R-CECR1，由目的右探針序列與GP2的反向互補序列組成。選擇質粒pET_14b (購自Novagen)中一部分序列為與待檢測靶片段無關的模板序列(S)，并根據CECRl基因的左探針序列和S序列設計并人工合成左端長探針制備專用的通用引物GPL (由GPl的序列和S序列的前18nt組成)和制備CECRl基因左端長探針用的下游引物L-CECR1’(由S序列下游23nt的反向互補序列+CECRl左探針序列的反向互補序列 CECRl'組成)。上述引物的具體核苷酸序列為
GPl 5' GGGTTCCCTAAGGGTTGGA3' 19nt 5，端FAM修飾(用于最后毛細管電泳檢測)； GP2 5' GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA 3'
GPL 5' GGGTTCCCTAAGGGTTGGACTGTCGCTTGCGGTATTC 3，(下劃線部分為 GPl 的序列，剩余部分為S序列的前18nt) L-CECRl，
5'ATTTTGAGCGTCATGAGCCTCTCATTGGTGCTCGCCGAGGCGGCATAAATC3' 51nt (下劃線部分為CECRl左探針序列的反向互補序列，剩余部分為S序列下游23nt的反向互補序列) R-CECRl
5' CGCTGAGATGAAGGAGGCCATGAGGACCCTGATATCTAGATTGGATCTTGCTGGCAC3' 57nt 5' 端磷酸化修飾(下劃線部分為CECRl右探針序列，剩余部分為GP2的反向互補序列GP2') 最終PCR擴增得到的左端長探針片段具體序列為 GGGTTCCCTAAGGGTTGGA (GPl 序列)
CTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGCCTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGT TTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGCGGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCG AGGCTGGATGGCCTTCCCCATTATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGT CCAGGCAGGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTCGATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCA (S 序列) CCAATGAGAGGCTCATGACGCTCAAAAT (CECRl 左探針序列) 實施步驟2 PCR擴增及其產物的純化回收。以質粒pET_14b為模板，用引物GPL和L-CECR1’進行PCR擴增。1)PCR反應體系
權利要求
1.用于多重連接擴增技術的探針制備方法，包括以下步驟.1)設計一對與待測靶片段及長探針核苷酸序列無關的檢測引物，分別為GPl(5’端帶熒光基團修飾)和GP2，用于最后的PCR擴增檢測，同時合成5’端帶磷酸化修飾的右探針 RP0-N,由目的右探針序列與GP2的反向互補序列組成；.2)確定一段與探針及通用引物無關的核苷酸序列S，并用于設計一對擴增左端長探針的引物，分別為GPL和LP0-N’，其中GPL是由GPl的序列與S序列的前18bp左右的序列組成，LPO-N'由目的左探針序列的反向互補序列與S序列中的18bp左右反向互補的序列組成，并且其5’端要帶上磷酸化修飾；.3)用GPL和LPN以所述的一段與探針及通用引物無關的核酸序列為模板進行PCR擴增，獲得互補鏈5’端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列；.4)純化回收PCR產物；.5)采用核酸Lamda外切酶對以上雙鏈核苷酸序列進行消化，去除5’磷酸化標記的那條單鏈DNA ；.6)采用ssDNA純化回收試劑盒對消化產物進行回收，便得到左端長探針。
2.根據權利要求1所述的用于多重連接擴增技術的探針制備方法，其特征在于，步驟.2)所述的用于擴增左端探針的引物由兩段核苷酸序列組成，一段根據探針檢測目標的核苷酸序列設計，另一段根據與待檢測靶片段無關的模版核苷酸序列設計。
3.根據權利要求1所述的用于多重連接擴增技術的探針制備方法，其特征在于，步驟.3)所述PCR擴增得到的5’端磷酸化修飾的雙鏈核苷酸序列需先經過純化再進行Lambda外切酶消化。
4.根據權利要求1所述的用于多重連接擴增技術的探針制備方法，其特征在于，步驟 5)所述的Lambda外切酶消化過程中，1 μ g雙鏈DNA用1個單位Lambda外切酶消化。
全文摘要
本發明公開了可用于多重連接擴增技術(MLPA)的長探針的制備方法，包括以下步驟1)選擇與待測目標序列無關的載體作為模板，并根據目標核苷酸序列和目標探針長度設計引物；2)人工合成引物；3)PCR擴增；4)PCR產物純化回收；5)使用Lambda外切酶對PCR產物進行消化；6)回收單鏈DNA。本發明所述MLPA探針制備方法成本低廉，只需要PCR儀即可完成擴增、酶切等全部操作，酶消化后使用專門的ssDNA回收試劑盒進行回收，排除了沒有消化完全的dsDNA和核苷酸，提高MLPA實驗時的雜交效率，通過充分的Lambda外切酶消化，可最大程度的將dsDNA變為ssDNA，從而提高了探針制備效率。
文檔編號C12Q1/68GK102534004SQ20121000824
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者黃劭 申請人:武漢緝熙生物科技有限公司