專利名稱：構建的一個連作棉田土壤宏基因組文庫的制作方法
技術領域：
本發明涉及土壤微生物、生物化學及分子生物學等領域，特別是把從新疆不同連作年限棉田土壤中分離純化出土壤微生物30kb-150kb大片段的DNA連接到BAC載體中構建成宏基因組文庫，該文庫中包含有不同連作年限棉田土壤中原核和真核微生物各種染色體內部基因及其調控信息。本發明針對新疆連作棉田中孕育的大量生物基因資源，利用現代分子生物技術手段從不同連作年限棉田土壤中分離微生物大片段DNA并連接到宏基因組載體當中，在未培養的情況下直接獲得了各種連作年限棉田土壤生態環境中各種微生物基因資源。該文庫可用于篩選各種不同連作年限棉田微生物資源基因和研究生物基因調控原理等。
背景技術：
從1929年發現青霉素以來，人們已經從微生物中開發了一百多種臨床使用的抗生素，抗癌和抗病毒藥物。然而，近些年來人類、家畜以及栽培作物病原菌抗(耐)藥性迅速發展，新的傳染病隱患日益加深，但是從可培養微生物中發現新型生物活性物質的研究卻舉步為艱，為此科學家們不斷的調整研究的材料以及方法，試圖高效而持續的從各種環境中開發出豐富的微生物資源。土壤微生物是最有價值的天然產物來源，它們能提供許多工業上十分重要的抗生素以及生物催化劑。各種微生物都有驚人的產生多樣化次級代謝產物的能力。Hammond估計地球上的微生物物種多達16X109，廣泛分布于各種生態系統中，其中，土壤無論從微生物數量和種類上都是首屈一指的生境。有人用科學的方法估計I克土壤中約有大于10000種不同的微生物，因此，土壤是微生物的大本營。但是，運用現有的技術，只有0.2% 2%的土壤微生物是可培養的，因此土壤中孕育著大量未被開發的生物基因資源。利用土壤環境下的未培養微生物資源是工 業生物技術開發的一個全新領域，也是人類尋找新型功能活性物質和天然藥物的天然寶庫，具有廣闊的開發應用前景。過去十多年在環境微生物培養和高新生物技術上的發展，特別是在基因組相關技術上的飛速發展，為我們從分子水平上了解環境微生物及其生態功能多樣性提供了諸多的便利。首先:隨著基因組技術的發展，人們開始用分子生物學的方法來研究微生物間的進化關系和遺傳信息的功能關系。環境基因組又稱多源基因組或宏基因組，是指從環境中提取總的DNA，對其進行遺傳學和功能學的研究。優點是不但可以原始地反映環境樣品中所有生物的遺傳多樣性，避開難培養這一技術瓶頸，而且可以把細胞外的DNA—并研究。通過環境基因組的方法可以獲得越來越多的DNA序列，且大都是新穎的未被純培養微生物的序列。運用環境基因組序列不但可以使我們逐漸了解微生物群落功能的復雜性，以及微生物間的相互作用關系，而且可以使我們深入了解未被純培養微生物的生理和生態特征。研究藥物發現相關的新穎基因，自然也要把目標鎖定在環境基因組中編碼新穎次級代謝產物的基因上。與其他基因工程技術不同，土壤環境基因組技術所需要的DNA片段不是來自已知菌中已熟知的基因片段或基因簇，而是來自完全未知的土壤樣品中，對其可能具有的潛在功能也并不知曉。在土壤總DNA中，編碼次級代謝產物的基因經常是成簇存在的，與同一個次級代謝產物相關的基因的生物合成區域和調節區域經常是緊密相連的。這些相連的基因使得克隆到載體中整個次級代謝產物途徑基因是一個連續的片段。在藥物發現中，生物合成基因和抗性基因也是連在一個片段上的，對于有毒的代謝產物，宿主可以通過共表達的抗性基因帶來的抗性機制來避免毒性。這一特點不但簡化了對外源片段進行剪切和修飾程序，而且使重組子的篩選更加方便，無疑為功能基因的克隆和表達提供了便利。其次:宏基因組(metagenomics)工程,直接將特定環境中的總體遺傳物質，克隆到可培養的宿主細胞中，建立宏基因組文庫，從所獲得的重組克隆子中篩選活性物質和相關基因(簇)，避開了環境微生物分離培養的難題，在挖掘和利用未培養微生物資源，篩選新穎生物活性物質方面具有極大的潛力。隨著對各種生物在DNA分子水平上研究的深入，尤其是人類和水稻基因組計劃的實施，構建基因組文庫己成為遺傳研究實驗室的常規策略。它對于分離特定的基因片段，研究基因的表達調控、基因組的組織結構，以及人類和動植物的基因組工程等都有極其重要的作用。構建基因組文庫的載體很多，大致可分為噬菌體系列(如早期的噬菌體、COS-mid、PI噬菌體和fosmid等)和 人工染色體系列(如YAC、BAC和PAC等)。前者的克隆能力相對較小(噬菌體24kb左右，cosmid 35 45kb)，許多真核生物的基因，上游啟動子序列較長，又含有大而多的內元，如此龐大而復雜的結構，難以作為單一片段克隆于這些載體中。因此，人們開始構建一系列的人工染色體，如酵母人工染色體(yeastartificialchromosome, YAC)、細菌人工染色體(bacterialartif icialchromosome, BAC), Pl 人工染色體(Pl-de-rived artificial chromosome, PAC)和哺乳動物人工染色體(mammalianartificial chromosome,MAC)等,它們的普遍特點是插入片段較大,一般在IOOkb以上。這些具有較大外源片段承受能力的人工染色體對于真核生物基因組文庫構建無疑是極為有利的，且其在與外源片段連接后無需進行包裝。新疆干旱地區是我國糧棉瓜果生產的重要基地。到2010年它已連續18年成為我國最大產棉區，僅2006年種植棉花面積已達1864萬畝,耕種面積占到各類農作物總面積近40%，在宜棉區的棉花播種面積甚至高達90%以上。像新疆這樣的農業大省，多年來由于連作(有的長達20年以上)、作物品種單一等多種原因造成作物病蟲害日漸加重并有爆發的趨勢，而為了控制病蟲害的蔓延農藥被大量使用，隨之而來的是土壤被嚴重污染，據報道新疆僅僅棉花每年平均施藥在十次以上。有毒物質的常年累積反過來又造成農田生物多樣性趨向單一，同時快速提高了病原菌的耐藥性和抗藥性，也就是說如此的惡性循環導致了一個非常突出的現象——農作物的主栽區往往也是病蟲害的重災區，也是農藥、化肥、地膜等污染的重災區。但是，另一方面隨著棉花種植面積的不斷擴大，連茬現象越來越嚴重，我們也清楚的觀察到兩個可惜的現象。一個是，滴灌技術的運用使大量荒地被開墾，而在新開墾的棉花地幾乎沒有任何病害發生(即便是和發病嚴重的棉花地相鄰)，也就根本無需依靠農藥來殺滅病害，而造成這種現象的根本原因是新開墾的土壤微生物原生態結構還未發生大的改變、微生物多樣性還未被完全破壞，從而表現出來的土壤生態結構與功能的一致性。另一個是，連年耕作給土壤微生物生態帶來負面影響的同時，也起到了富集具有降解農業污染物和轉化難利用物質功能的微生物的作用，那么這些微生物必然也具有一些可以開發和利用的資源基因。因此該地區土壤中可能蘊含著新的、還不為人知的基因資源。通過構建，對不同類型、不同耕作方式下的微生物群落結構進行研究，能揭示出微生物群落結構與理化性質的內在聯系，從而改善當前的生態環境，并獲得新的、有用的基因資源。本發明就是針對不同連作年限棉田土壤中蘊含的大量微生物基因組信息，利用土壤大片段DNA提取技術和BAC載體，通過構建宏基因組文庫的方式直接獲得了包括非培養微生物基因組信息在內的所有的土壤生物信息。該文庫的構建能滿足于各種酶基因的分離、抗生素的篩選及分子生物學研究所需要的各種生物調控信息等研究需要。

發明內容
目前構建基因組文庫的載體很多，大致可分為噬菌體系列(如早期的噬菌體、COS-mid、PI噬菌體和fosmid等)和人工染色體系列(如YAC、BAC和PAC等)。前者的克隆能力相對較小(噬菌體24kb左右，cosmid 35 45kb)，許多真核生物的基因，上游啟動子序列較長，又含有大而多的內元，如此龐大而復雜的結構，難以作為單一片段克隆于這些載體中。因此，人們開始構建一系列的人工染色體，如酵母人工染色體(yeast artificialchromosome, YAC)、細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC), Pl 人工染色體(P1-derived artificial chromosome, PAC)和哺乳動物人工染色體(mammalianartificial chromosome,MAC)等,它們的普遍特點是插入片段較大,一般在IOOkb以上。這些具有較大外源片段承受能力的人工染色體對于真核生物基因組文庫構建無疑是極為有利的，且其在與外源片段連接后無需進行包裝。對于土壤大片段DNA的提取和回收，我們使用的是優化后的方法，提取的大片段DNA同時滿足以下幾個要求:①片段要在300kb以上，因為相同的克隆數中片段大所構建的文庫包含的信息內容才大，才能夠多的涵蓋土壤中遺傳信息的內容；②純度高，尤其是不含或者少含抑制后繼實驗中酶活力的物質(土壤中的這類物質很多)回收的DNA中盡可能的包含土壤中所 有微生物的遺傳信息。針對這個現狀，本研究根據實際操作經驗使用的是載體是BAC，回收的土壤大片段是不同連作年限的棉田30-150kb左右大小的片段，宿主菌是大腸桿菌。本發明成功的構建了不同連作年限的棉田土壤宏基因組BAC文庫，同時指出每個構建關鍵步驟操作中的注意事項和該文庫的使用范圍等供大家根據自己的實際需要參考。本發明提供了一個完整的包含10萬克隆以上的不同連作年限的棉田土壤宏基因組BAC文庫。本發明提供了土壤宏基因組文庫構建的每個關鍵步驟的注意事項和原理，可以根據需要片段大小選擇不同類型的載體和構建步驟。本發明提供了可根據實際需要更改操作步驟的原理和方法。具體地，提供了該文庫從大片段土壤DNA到文庫克隆的整個過程。本發明首先將來自于不同連作年限的不同大小片段的土壤DNA樣品脫磷處理后，然后片段大小不同的各樣品再調整成不同濃度的DNA溶液，分別與BAC載體連接后轉化大腸桿菌感受態細胞，最后用相應的篩選標記篩選出攜帶有大片段DNA的克隆子。由于在構建立文庫的過程中我們做了多個連接反應，并且分別使用了從30-150kb不同長度的大片段DNA，因此整個文庫的構成由30-150kb的所有大小的DNA組成。在后繼的研究中可以根據實際需要從不同大小的克隆子中篩選所需的文庫信息。本發明提供了每個關鍵環節的詳細步驟和原理，并提出了可以調整方案的建議和方法。首先指出了不同大小片段的DNA分子分別和載體連接是成功構建的第一個關鍵環節，并提供了較為詳細的方法和步驟。其次指出了連接過程中的注意事項，指明了載體分子和外源片段分子濃度之間的關系影響到連接和構建的效率。轉化和篩選的過程也是關鍵環節，指出了轉化和篩選過程的注意事項和切實可行的方法。本發明提供的文庫可以用于工業用酶基因的篩選、新抗生素的發現、農業用有毒有害物質的降解基因、微生物基因的調控信息等的研究工作，也可以滿足一些相關的后繼工作需要。具體地，本發明提供了文庫的構建立方法和獲得的很有開發應用研究價值的文庫，具體的方法如下:1.本發明闡述了該 文庫的構建方法步驟:根據實際的操作并結合已經公開的方法實踐出了切實可行的一個構建方法，并獲得了一個容量超過10萬克隆以上的一個土壤宏基因組文庫。2.不同大小片段的DNA分子和載體的連接:調整獲得的不同大小片段土壤微生物DNA分子濃度分別與BAC載體連接，其目的是獲得較高的連接效率。3.連接產物的轉化:將連接有不同大小片段DNA的BAC載體轉化到大腸桿菌中，并利用篩選標記獲得合格的克隆子。依據本發明提供的原理和通過實施本發明的具體方法并結合需要調整操作步驟，可以達到以下預期效果:1.提供了一個不同連作年限的土壤宏基因組文庫，獲得的該文庫可以用于各種功能基因的篩選、微生物次級代謝產物的分離以及各種后繼分子生物學等的科學研究工作。2.本發明提供了獲得的土壤宏基因組文庫的構建方法，與常規方法相比具有詳細、可操作性強、操作步驟依據需要可調等特點。


圖1:克隆子酶切鑒定圖，其中1-8和10-16為隨機挑選的平均插入片段約為85kb的克隆子，9為分子量MARK (從小到大依次為:48.5,97,145.5kb)。圖2:克隆子酶切鑒定圖，其中1-17和19-27為隨機挑選的平均插入片段約為IlOkb的克隆子，I和18為分子量MARK (從小到大依次為:48.5,97,145.5kb)。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。實施例一:限制性內切酶測試消化插入片段的大小盡可能控制在30kb-150kb范圍內。1.將10個1.5mL的離心管置于一個離心管架上，標記1-10，每管加入250 μ I的HindIII 酶的 Buffer ；
2.在一個1.5ml的離心管中加入10 μ I HindIII (20單位/ μ I)、80 μ I的高純度水和10 μ I IOXHindIII緩沖液，混勻得到2.0單位/μ I的HindIII溶液(稀釋液I)。取10 μ I加入80 μ I的高純度水和10 μ I IOXHindIII緩沖液中以得到0.2單位/ μ I的HindIII溶液(稀釋液2)。依次類推，按照下表，以未稀釋的Hindlll、稀釋液I和2、特定量的HindIII加入這10個管子中。
權利要求
1.一個構建的包含有未耕作土壤在內的不同連作年限棉田土壤宏基因組文庫。首先分離獲得各種不同連作年限的棉田土壤微生物細胞，然后利用低熔點瓊脂糖包埋法經脈沖電泳分離各種大小的DNA片段，最后將回收到的30-150kb大小的DNA片段與BAC載體連接并克隆到大腸桿菌宿主菌中，超過10萬個這樣的克隆構建成一個土壤宏基因組文庫。
2.一種根據權利要求1的包含該宏基因組文庫的所有原核生物基因組相關信息。其特征在于該文庫中含有大量非培養土壤原核微生物基因組信息，其中各克隆中可能含有交叉重疊的原核基因生物信息。
3.一種根據權利要求1的包含該宏基因組文庫的所有真核生物基因組相關信息。其特征在于該文庫中含有大量非培養土壤真核微生物基因組信息，其中各克隆中可能含有交叉重疊的真核基因生物信息。
4.一種根據 權利要求1的包含與該宏基因組文庫中的基因以及基因族調控信息等。
全文摘要
本發明涉及土壤微生物、生物化學及分子生物學等領域，特別是從新疆不同連作年限棉田土壤中分離純化出土壤微生物30kb-150kb大片段DNA，并連接到適合的載體中構建成宏基因組文庫，該文庫中包含有不同連作年限棉田土壤中原核和真核微生物各種染色體內部基因信息。本發明針對新疆連作棉田中孕育的大量生物基因資源，利用現代分子生物技術手段從不同連作年限棉田土壤中分離微生物大片段DNA并連接到宏基因組載體當中，在未培養的情況下直接獲得了各種連作年限棉田土壤生態環境中各種微生物基因資源。該文庫可用于篩選各種不同連作年限棉田微生物資源基因和研究生物基因調控原理等。
文檔編號C12R1/19GK103205816SQ20121000811
公開日2013年7月17日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者張偉 申請人:新疆師范大學