專利名稱：轉Bt基因棉花標準質粒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種轉Bt基因棉花標準質粒，及其在定性檢測轉Bt基因農作物及定量檢測轉Bt基因棉花轉基因含量上的應用，以及利用該標準質粒對轉Bt基因農作物的轉基因含量進行檢測的熒光定量PCR檢測試劑盒。
背景技術：
Bt基因是蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)晶體蛋白基因的簡稱。 1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了第一個編碼Bt殺蟲晶體蛋白基因，揭開了利用基因工程培育抗蟲植物的序幕。Bt基因中分為Cry和Cyt 二大類。迄今為止，已經報道的 Bt 達至Ij 476 種，其中 Cry 分為 58 群、449 種，Cyt 分為 2 群、27 種(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2. html)。經過密碼子優化的 Bt 基因已被成功地導入煙草、玉米、棉花等多種植物，獲得一大批具良好抗蟲性的轉基因植物品種和種質資源，Bt基因已成為植物基因工程及轉基因育種中應用最廣泛、最具潛力和應用前景的抗蟲基因。目前全世界總共已獲得了50多種轉Bt殺蟲晶體蛋白基因植物，其中水稻、玉米、 棉花、馬鈴薯、油菜、楊樹、煙草等已商品化，我國農業部于2009年批準轉基因抗蟲水稻的生物安全證書。自1996年首例轉基因農作物產業化應用以來，全球轉基因技術研究與應用產業快速發展。截至2010年底，已有25個國家批準了 24種轉基因作物的商業化應用。以轉基因大豆、棉花、玉米、油菜為代表的轉基因作物種植面積由1996年的170萬公頃發展到 2010年的14800萬公頃，14年間增長了 87倍。ACP基因是棉花內源基因，用于定量檢測的棉花ACP基因片段長度為116bp的DNA 片段；其核苷酸序列不僅具備種內一致性，即所有棉花品種中含有ACP基因；還具備種間特異性，即在除棉花外其它物種里沒有該基因DNA片段。近年來，關于轉基因植物的安全性事件報道不斷，如1996年巴西豆過敏事件、 1998年Pusztai事件、1999年美國大斑蝶事件和墨西哥玉米污染事件、2000年星聯Bt玉米事件、2007年印度轉基因抗蟲棉事件、加拿大超級雜草事件和中國抗蟲棉事件等，這些事件促使國際組織和國家紛紛制定相應的安全管理法規，加強遺傳改良作物的規范管理，并對遺傳改良植物及其產品實施標識制度。為了應對遺傳改良作物管理相關的法律法規和制度，有必要建立一套高效、快速、 特異的檢測技術。聚合酶鏈反應(PCR)無疑是最佳選擇。在實際檢測中，標準物質十分關鍵。質粒標準分子的概念由日本科學家Kuribara等于2002年提出，它是指一種含有檢測目的基因特異性片段的線性化重組質粒分子。經實驗驗證，不管是由單一特異性外源序列還是多段目標序列構建的質粒標準分子，都能很好的達到轉基因作物定量分析檢測，特別是定量PCR檢測的目的。質粒標準分子由于生產方便、易擴增、操作簡便、穩定性好、純度較高、高效經濟等優點愈來愈受全世界轉基因檢測專家和研究者們重視，在轉基因生物鑒定檢測中是很好的標準陽性物質替代物，應用于轉基因品系以及其加工品的定量PCR檢測。標準質粒分子在轉基因作物和附屬產品檢測鑒定中的應用將會發揮越來越重要的作用。

發明內容
本發明的目的在于提供一種轉Bt基因棉花標準質粒，解決轉基因Bt農作物尤其是轉Bt基因棉花檢測中標準物質缺乏的難題，提供一種準確、快速、簡便的轉基因Bt農作物尤其是轉基因棉花檢測方法。本發明采用的技術方案是一種轉Bt基因棉花標準質粒，由SEQ ID No. I (174bp)所示核苷酸片段與SEQ ID No. 2 (116bp)所示核苷酸片段經過拼接后，加入常見的酶切位點，插入常規克隆載體(如 PEASY-T3、PMD18-T、PMD19-T 等)制得。具體的，所述的轉Bt基因棉花標準質粒，由SEQ ID No. 3插入pEASY_T3載體制的， 以下簡稱308號質粒。所述SEQ ID No. 3由SEQ ID No. I (174bp)所示核苷酸片段與SEQ ID No. 2 (116bp)所示核苷酸片段經過拼接，加入酶切位點Pst I、Nde I及Sal I (該酶切位點位于兩片段間)得到。所述308號質粒由如下方法構建
I.設計PCR特異性引物；
2.PCR擴增；
3.Bt目標序列獲取，片段長度174bp，通過測序進行驗證;:并設計熒光定量PCR引物及探針；
4.ACP目標序列獲取，片段長度116bp，通過測序進行驗證;并設計熒光定量PCR引物及探針；
5.構建標準質粒；
6.通過PCR、酶切、測序等驗證標準質粒；
7.對標準質粒進行特異性、穩定性及均勻性檢測；
8.對標準質粒特異性、穩定性及均勻性結果進行分析。
本發明轉Bt基因棉花標準質粒分子既含有Bt外源基因又包括ACP棉花內源基
因，Bt外源基因既可用于定性待測農產制品是否含有轉Bt基因，棉花ACP內源基因可定性檢測農產制品中是否含有棉花；同時，Bt外源基因和棉花ACP內源基因可以定量檢測棉花類農產制品中的轉Bt基因棉花的含量。本發明還涉及所述轉Bt基因棉花標準質粒在檢測棉花類農產制品中轉Bt基因棉花含量中的應用。所述轉Bt基因棉花標準質粒可用于檢測下列之一的轉Bt外源基因農作物(I) CryIA(a), (2)CryIA(b), (3)CryIA(c), (4)Crylab/ac。所述轉Bt基因農作物可為下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜，優選為棉花。所述轉Bt基因棉花標準質粒含有棉花ACP內源基因，可在轉Bt基因棉花轉基因含量檢測中的定性定量應用。本發明還涉及一種轉Bt基因棉花的熒光定量PCR檢測試劑盒，主要包括特異性引物和探針、PCR緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和轉Bt基因棉花標準質粒，所述特異性引物和探針序列如下用于檢測Bt外源基因的引物和探針Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’用于檢測棉花ACP內源基因的引物和探針ACP-F-Primer :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’ACP-R-Pnmer :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3 ACP-Probe :5， -FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3’，其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。所述的轉Bt基因棉花標準質粒由SEQ ID No. 3所述核苷酸片段插入pEASY_T3載體制的。使用以上試劑盒對轉Bt基因農作物的熒光定量PCR檢測可按本領域常規方法進行，提取待測樣品基因組DNA后，配制PCR緩沖液進行PCR擴增，取PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，根據電泳結果是否出現Bt基因的特異性條帶(174bp)，判斷待測農作物是否含有相應外源基因，若電泳結果同時出現ACP基因特異性條帶(I 16bp)，則待測農作物為轉Bt 基因棉花；同時以標準質粒梯度濃度溶液于相同條件下進行擴增，繪制標準曲線，對照標準曲線，即可獲得待測樣品中外源基因和內源基因的拷貝數，即可獲知待測樣品的外源基因含量。本發明的有益效果主要體現在本發明提供了一種轉Bt基因棉花標準質粒，生產方便、易擴增、操作簡便、穩定性好、高效經濟，解決了轉Bt基因農作物檢測中標準物質缺乏的難題，并且提供了一種準確、快速、簡便的轉Bt基因農作物檢測試劑盒，能夠很好的進行轉Bt基因農作物的定量分析檢測。
(四)
因； 4 :308


圖I為pEASY-T3重組載體結構
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質粒
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2為Bt和ACP基因驗證電泳圖；Marker DL2000 ;1、2為Bt基因；3、4為ACP基 3 為 EcoRI 單酶切；M DL2000 ；1 Sal I 酶切；2 EcoR I 酶切；3 Pst I 酶切；
4為308號質粒測序結果與合成序列比對5為308號質粒的Bt基因熒光定量PCR結果(標準曲線)；
6為308號質粒的ACP基因熒光定量PCR結果(標準曲線)；
7為308號質粒4°C下Bt片段第I天熒光定量PCR結果；
8為308號質粒4°C下Bt片段第14天熒光定量PCR結果；
9為308號質粒4°C下Bt片段第28天熒光定量PCR結果；
10為308號質粒4°C ACP片段第I天熒光定量PCR結果；
11為308號質粒4°C ACP片段第14天熒光定量PCR結果；
12為308號質粒4°C ACP片段第28天熒光定量PCR結果；
圖13為308號質粒Bt基因均勻性qPCR分析；圖14為308號質粒ACP基因均勻性qPCR分析；圖15為308號質粒熒光定量檢測極限分析。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此實施例I :308號質粒的構建本發明所述一種轉基因棉花標準質粒包含外源Bt基因和ACP棉花內源基因，其構建方法包括如下步驟I.設計PCR特異性引物Bt-F :5，-TTCCTTGGACGAAATCCCACC-3’Bt-R :5，-GCCAGAATTGAACACATGAGCGC-3，2. PCR 擴增利用設計的PCR引物特異性擴增轉Bt基因農作物的特異性序列。3. Bt目標序列獲取，并通過測序進行驗證步驟2獲得的擴增后特異性序列即為Bt目標序列，其片段為174bp，用美國ABI公司3730型測序儀對其進行測序驗證；并設計熒光定量PCR引物及探針，熒光定量PCR引物及探針如下所示Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’4.采用與步驟4相同方法選擇ACP目標序列，選取長度為116bp的序列作為質粒的內源基因特異性片段，并設計熒光定量PCR引物及探針。熒光定量PCR引物及探針如下所示ACP-F-Primer :5，-CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3’ACP-R-Primer :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3 ACP-Probe :5， -FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3，，其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團。5.構建標準質粒將步驟4中所選取的174bp的Bt特異片段與步驟5中選取的116bp的ACP內源特異性片段經過拼接，兩端添加Pst I、Nde I酶切位點，兩片段間添加酶切位點Sal I后， 所得片段插入PEASY-T3克隆載體(購自北京全式金生物技術有限公司)，完成標準質粒的組合，標準質粒分子如附圖I (因其插入片段長度為308bp，本發明簡稱308號質粒)。其重組流程如下a.基因序列的QC :對所需合成的基因全序列進行分析，檢查基因內部是否含有復雜二級結構和重復序列。根據序列情況設計合成方案；b.根據基因序列分析的結果，進行單鏈oligo的設計及合成；c.利用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因；
d.將合成好的基因裝入PEASY-T3 Cloning載體并轉化至感受態細胞DH5 α ；e.測序驗證重組克隆中基因序列是否與要求相符。質粒重組片段序列如下308號質粒插入片段長度為308bp，包括Bt(174bp)、ACP(116bp)、連接兩個片段的酶切位點Sal I和插入片段兩端的酶切位點Pst I、Nde I。。6.通過PCR、酶切、測序等驗證標準質粒(I) PCR 驗證對所構建的308號質粒用Bt基因及ACP基因的前述引物進行擴增電泳，在目標片段區域獲得清晰的單一預期條帶，如圖2，說明這二個片段已經被正確地插入質粒中。(2)酶切驗證根據插入片段和pEASY-T3載體TA克隆位點兩端特異性較高的酶切位點選擇Sal I> EcoR I、Pst I分別單酶切308質粒，結果見圖3，分別可以看到預期大小的酶切片段，由此基本肯定質粒片段的正確性。(3)測序驗證根據插入片段(含兩端酶切位點)設計引物，進行PCR擴增，將擴增結果進行測序。并對測序結果與設計序列進行匹配對比，結果完全吻合，驗證了質粒序列100%的可靠性，比較結果如圖4。7.對308號質粒進行特異性、穩定性及均勻性檢測(1)308號質粒的濃度測定和檢測重復性質粒突光定量PCR引物與步驟4、5中相同,探針采用Primer Express2. O和Beacon designer 設計，然后由 TaKaRa 公司負責合成。根據 PicoGreen dsDNA Reagent and Kits 所測定母液濃度計算質粒拷貝數，再用滅菌去離子水分別稀釋成初始模板拷貝數為107，IO6, IO5, IO4, IO3,100，10拷貝的標準質粒進行熒光定量PCR繪制標準曲線，從而建立標準質粒的qPCR定量分析體系并用于實際標準分子的定量分析，重復定量分析3次，分析檢測靈敏性。表I為熒光定量PCR 25 μ L擴增體系，表2為qPCR擴增程序，熒光定量PCR探針序列如下Bt :5’ -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse-3’ACP :5，-FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3，表I :熒光定量PCR 25uL擴增體系
權利要求
1.一種轉Bt基因棉花標準質粒，由SEQ ID No. I所示核苷酸片段與SEQ ID No. 2所示核苷酸片段經過拼接后，插入克隆載體制得。
2.如權利要求I所述的轉Bt基因棉花標準質粒，由SEQID No. 3所示核苷酸片段插入 PEASY-T3載體制得。
3.如權利要求I所述的轉Bt基因棉花標準質粒在檢測轉Bt基因農作物的轉基因含量中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述轉Bt基因棉花標準質粒用于檢測下列之一的 Bt 外源基因(I)CryIA(a), (2)CryIA(b), (3)CryIA(c), (4)Crylab/ac。
5.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述的農作物為下列之一水稻、玉米、大豆、棉花、油菜。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述的農作物為棉花。
7.一種轉Bt基因棉花的熒光定量PCR檢測試劑盒，主要包括特異性引物和探針、PCR 緩沖液、脫氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合酶和轉Bt基因棉花標準質粒，其特征在于所述特異性引物和探針序列如下Bt-F-Primer :5’ -GTAAGGTCGTTGTAACGGCTATTG-3’Bt-R-Primer :5’ -CGCCTTGACCACAGCTATCC-3’Bt-Probe :5， -FAM-CCACCTTTGCCCAAACACGCTAACG-Eclipse_3’其中FAM為熒光報告基團，Eclipse為熒光淬滅基團；ACP-F-Primer :5’ -CAAACAAGAGACCGTGGATAAGGTA-3，ACP-R-Primer :5，-CAAGAGAATCAGCTCCAAGATCAAG-3，ACP-Probe :5’ -FAM-TTAGCTTTAGACAATGACAAACCAATCACCGG-TAMRA-3，其中FAM為熒光報告基團，TAMRA為熒光淬滅基團；所述轉Bt基因棉花標準質粒由SEQ ID No. 3所示核苷酸片段插入pEASY-T3載體制得。
全文摘要
本發明提供了一種轉Bt基因棉花標準質粒及其應用，一種轉Bt基因棉花標準質粒，由SEQ ID No.1(174bp)所示核苷酸片段與SEQ ID No.2(116bp)所示核苷酸片段經過拼接后，加入常見的酶切位點，插入常規卡隆載體制得。本發明提供的轉Bt基因棉花標準質粒，生產方便、易擴增、操作簡便、穩定性好、純度較高、高效經濟，解決了轉Bt基因棉花和轉Bt基因農作物檢測中標準物質缺乏的難題，并且提供了一種準確、快速、簡便、省時省力的轉Bt基因農作物檢測試劑盒，能夠很好的達到轉Bt基因作物定量分析檢測，特別是定量PCR檢測的目的。
文檔編號C12N15/63GK102586302SQ20121000832
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者付賢樹, 俞曉平, 葉子弘, 崔海峰, 趙煦泓, 金榮愉 申請人:中國計量學院